abi测序的基本原理和应用

《abi测序的基本原理和应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《abi测序的基本原理和应用（40页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、测序分析测序分析的的基本原理和应用基本原理和应用测序分析测序分析的的基本原理和应用基本原理和应用 1 主要内容主要内容主要内容主要内容 测序反应测序应 荧光标记ddNTP/荧光标记引物 BigDyeTerminator的不同版本 模板制备 模板制备 引物设计 测序反应产物纯化 2 测序测序反应反应测序测序反应反应 3 测序反应测序反应 双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法 5 测序反应测序反应双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法 O O O 无3 OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入 O 3H 5 3 H O 43 OH 测序反应测序反应 变性 测序反应测序反应 退火 DNA模板 火 引物 AG

2、A T C 测序酶 荧光标记的ddNTP 延伸/终止 测序酶 荧光标记的ddNTP （BigDyeTerminator） dNTPs 5 dNTPs 荧光标记的测序反应产物荧光标记的测序反应产物荧光标记的测序反应产物荧光标记的测序反应产物荧光标记的测序反应产物荧光标记的测序反应产物荧光标记的测序反应产物荧光标记的测序反应产物 ? ddNTP 被加到正在合成的链上，由于它的3-OH已被氧化，下一个dNTP 的磷酸基团能与之成磷酸酯键使合成终的5-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。 ? 测序反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺入产生一系列不同长度的新的 DNA片段。DNA片段。 6 基

3、因分析仪的基本构造基因分析仪的基本构造基因分析仪的基本构造基因分析仪的基本构造 CCD 相机记录所有通道信号相机记录所有通道信号 计算机分析测序数据计算机分析测序数据 激光激发所有通道激光激发所有通道 毛细管毛细管 电泳方向电泳方向 高压电源高压电源 7 高压电源高压电源 DNA测序示意图DNA测序示意图 DNA测序示意图测序示意图 C T T G C A T G A C 序列 用点的大小代表用点的大小代表DNA分子的大小，分子的大小， 颜色代表颜色代表DNA所标记的颜色所标记的颜色 信号 颜色代表颜色代表DNA所标记的颜色所标记的颜色。 检测窗口 毛细管毛细管 8 进样端 化学原理化学原理化

4、学原理化学原理 9 “荧光标记荧光标记ddNTP” vs “荧光标记引物荧光标记引物”荧光标记荧光标记ddNTPvs 荧光标记引物荧光标记引物 荧光标记荧光标记ddNTP荧光标记引物荧光标记引物 单管反应 (+) 非标记引物 (+) 四管反应 (-) 仅需要M13正向和反向测序引物 非标记引物 (+) 无错误终止 仅需要M13正向和反向测序引物 荧光信号均一(+) 不建议用于毛细管电泳 (Compressions) 最新一代的BigDye Terminator测序试剂盒的荧光信号非常均一，99.9 %的客户都 在用此试剂盒进行测序。 10 dNTPs/ddNTPs比例的重要性比例的重要性比例的

5、重要性比例的重要性 测序反应测序反应 ddGTP ddCTP ddATP dATP dCTP dTTP ddGTP ddCTP dATP dGTP dCTP ddATP ddCTP ddTTP ddATP dCTP dGTP dCTP ddCTP ddTTP ddATP dCTP dTTP ddCTP dNTPs / ddNTPs比例比例 ddGTPdGTPdGTPddTTP 0 低高 无荧光信号 主要是较短的 延伸产物 主要是较长的 延伸产物 单碱基延伸 不同的测序试剂盒用于不同的测序应用 注意如果进行PCR产物测序重要的是要在测序反应前要去除PCR产物中 11 注意：如果进行PCR产物测序

6、，重要的是要在测序反应前要去除PCR产物中 残留的dNTPs BigDyeTerminator测序测序试剂盒试剂盒- 概况概况g y测序测序试剂盒试剂盒 概况概况 版本版本 1.1 版本版本 3.1 荧光荧光 最初最初的的 BigDye kit提高提高测序酶活性测序酶活性的的 BigD e kit荧光荧光最初最初的的 BigDye kit 提高提高测序酶活性测序酶活性的的 BigDye kit dNTPs/ddNTPs 比例比例 “原始的原始的” 适于长片段测序适于长片段测序 测序酶测序酶 热稳定，适于困难模板测序热稳定，适于困难模板测序 缓冲液缓冲液 试剂盒配有试剂盒配有 5 x BigDy

7、e Sequencing Buffer 12 BigDyeTerminator测序试剂盒- 应用g y序试剂 v3.1 用于大部分应用用于大部分应用 测序 应用应用 V3.1V1.1 De-novo测序 再测序 原始(de novo)测序 + ? 再测序 + ? 困难模板测序+ v1.1 用于用于特殊的应用特殊的应用 困难模板测序 + 长片段测序 + ? 各种模板类型测序 (质粒, BACs, +? v . 用于用于特殊的应用特殊的应用 用快速电泳程序进行的短 PCR 产物测序 各种模板类型测序 (质粒, 和 fosmids) +? 混合碱基检测（SNP） + ? 用快速电泳程序进行短片段测序

8、 ?+ PCR 产物测序 靠近测序引物的序列判读 用快速电泳程序进行短片段测序 ?+ + Recommended ? Satisfactory 更多信息请参考BigDye Terminator v3 1 和v1 1 Cycle Sequencing Kits 的产品彩页 13 更多信息请参考BigDye Terminator v3.1 和v1.1 Cycle Sequencing Kits 的产品彩页 BigDyeTerminator测序试剂盒测序试剂盒g y 测序举例: 杂合子检测 v1.1 v3.13 14 注意：用v3.1可以得到更均一的测序峰，更好地区分混合碱基。 BigDyeTerm

9、inator测序试剂盒测序试剂盒BigDye Terminator测序试剂盒测序试剂盒 测序举例: 测序起点测序举例: 测序起点 v3.1 First baseFirst base v1.1 如果想读出测序引物邻近的序列或在测序产物开始的50个碱基内区分出杂合子， 请选择 15 请选择BigDyeTerminator v1.1 kit。 测序模板制备测序模板制备测序模板制备测序模板制备 16 测序模板制备测序模板制备：质粒质粒测序模板制备测序模板制备：质粒质粒 碱裂解法提取质粒要用RNA酶消化和PEG沉淀 碱裂解法提取质粒，要用RNA酶消化和PEG沉淀 CsCl 层析 商业化试剂盒 (MagM

10、ax, Tri-Reagent, Centri-Sep) 注意: 免柱避免超出纯化柱的DNA载量 可能需要额外的脱盐步骤 17 测序模板制备测序模板制备：PCR产物产物测序模板制备测序模板制备：PCR产物产物 去除PCR反应液的残留 去除PCR反应液的残留 残留的引物：保证引物特异性，避免多重测序 残留的dNTPs：以保持dNTPs / ddNTPs的最佳比例 盐成分：避免抑制测序酶活性 非特异PCR产物：避免扩增出同源性区域 Exo I / SAP消化消化柱纯化柱纯化胶回收纯化胶回收纯化稀释稀释 18 测序反应测序反应 PCR产物纯化方法产物纯化方法PCR产物纯化方法产物纯化方法 依赖于 依

11、赖于 PCR反应的优化程度 PCR产物的质量 ? 选择最佳的纯化方法? 选择最佳的纯化方法 19 胶回收纯化胶回收纯化胶回收纯化胶回收纯化 可用于任何质量的PCR产物纯化 优势优势: 可用于任何质量的PCR产物纯化 -优势优势: 去除非特异PCR产物和引物二聚体 ? - 缺点缺点: -重复性差，得率低 -费时 -紫外照射可能会破坏DNA链 切下条带，然后用商品化试剂盒纯化 20 柱纯化柱纯化柱纯化柱纯化 用于特异PCR产物纯化或存在 100b 的非特 用于特异PCR产物纯化或存在 0.9：糖残留) 测序引物测序引物测序引物测序引物 引物设计原则引物设计原则引物设计原则引物设计原则 长度：17-

12、25 碱基 Tm ：55 到65 ? 退火温度一般规则 Ta (?)= Tm 5 Tm=(A+T)x2 + (G+C)x4 “ (2+4)-5规则” 避免: 引物二聚体 发卡结构 二级结构 发卡结构 第二个结合位点 26 测序引物测序引物 引物重悬和定量引物重悬和定量 测序引物测序引物 引物重悬和定量引物重悬和定量 冻干粉：重悬在水或1 mM Tris（pH 8.0）, 静置10 min, 振荡, 然后分装。 用分光光度计利用引物特异的吸收系数检测引物浓度。 储存储存 高 -20 ? / -80 ?母液保存 (不要稀释，浓度越高越好) +4 ?工作液保存 (适当稀释，可以保存一个月) 27 测

13、序反应完成后存在什么测序反应完成后存在什么？测序反应完成后存在什么测序反应完成后存在什么？ 荧光标记的测序产物荧光标记的测序产物 Tris + Cl- 荧光标记的测序产物荧光标记的测序产物 Tris Cl MgCl2 残留的荧光标记的残留的荧光标记的 ddNTP 残留的残留的dNTP 测序酶测序酶 28 为什么要进行测序产物纯化为什么要进行测序产物纯化？为什么要进行测序产物纯化为什么要进行测序产物纯化？ 测序反应只消耗一小部分荧光标记的ddNTP(BigDyeTerminator） 残留的BigDye会随测序产物一起进入毛细管迁移，导致错误的碱基判读 染料峰染料峰 29 染料峰会干扰碱基判读染

14、料峰会干扰碱基判读染料峰会干扰碱基判读染料峰会干扰碱基判读 中等染料峰中等染料峰 小染料峰小染料峰 无染料峰无染料峰 30 测序产物测序产物DNADNA应避免应避免: :测序产物测序产物DNADNA应避免应避免: : 蛋白、洗涤剂、基因组DNA蛋白洗涤剂 缩短毛细管寿命 样品脏或混合样品 样品脏或混合样品 影响读长 缩短毛细管寿命 测序结果差 盐离子、 EDTA缓冲液 抑制DNA聚合酶活性抑制DNA聚合酶活性 优先进入毛细管 31 测序产物纯化测序产物纯化测序产物纯化测序产物纯化 32 BigDyeXTerminator纯化试剂盒纯化试剂盒:BigDye XTerminator纯化试剂盒纯化试

15、剂盒: 更高通量，更少时间，更少浪费更高通量，更少时间，更少浪费 特点特点 & 优点优点- 特点特点 & 优点优点： 简单，快速：三步法纯化 一个工作日可以完成所有测序流程 易于自动化或用移液器手工操作 纯化好的测序产物比较稳定 室温小时 室温，48 小时 4 ? ，10天 重跑样品时，无需重做测序反应重跑样品时，无需重做测序反应 万一停电或电脑死机等，样品无损失 无需转移测序产物 “Chain of custody”（每一步都可以监控） 塑料耗材消耗少 节省成本 33 节省成本 BigDyeXTerminator纯化试剂盒纯化试剂盒BigDye XTerminator纯化试剂盒纯化试剂盒 AB专利的测序产物纯化试剂盒 AB专利的测序产物纯化试剂盒 同管纯化方式 直接在测序反应管或板里面操作直接在测序反应管或板里面操作 测序样品的位置保持不变 无需其它耗材 去除残留的BigDye Terminator(染料峰) 测序产物脱盐 纯化好的测序产物比较稳定:纯化好的测序产物比较稳定: 室温，48 小时 4C， 10 天 34 测序应用测序应用测序应用测序应用 35 测序应用测序应用测序应用测序应用 De Novo 测序 重测序 突变检测、SNPs、插入、缺失 克隆产物验证克隆产物验证 比较基因组 分型 分型 BAC 末端-测序 微生物和真菌鉴定微生物和真菌鉴定 MLST (多基因