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1、粘膜免疫佐剂的研究进展摘要：黏膜免疫在机体抵抗病原入侵时发挥着重要的作用，疫苗通过黏膜免疫可以引起局部和全身的免疫应答。但是疫苗经过消化道黏膜时常受到消化液的降解，而且常常会引起免疫耐受，为了克服这些困难，人们设计了大量的黏膜免疫佐剂以增强机体对抗原的黏膜免疫力和全身的免疫应答水平。这里将近年来粘膜免疫佐剂的研究进展做一下叙述。关键词：粘膜免疫；佐剂；类型；研究进展机体约有80以上的细菌、病毒和寄生虫的感染都起始于粘膜表面。粘膜免疫可以诱导局部粘膜产生分泌性IgA(sIgA)、IgM和IgG等保护性抗体，并可诱导其它部位的粘膜也产生sIgA，这是粘膜免疫保护作用的主要机制。此外，粘膜免疫还诱导
2、粘膜CTL反应，并且产生分泌IFN-的CD4+T细胞，这对于病原体侵入的预防和清除是非常重要的1。因此粘膜免疫是保护机体免于病原体侵犯的重要屏障，在疫苗的设计中具有重要意义。目前机体粘膜免疫的机制还不完全清楚。现有研究表明，基于粘膜免疫的疫苗由于诱导的免疫往往反应较弱，持续时间短，难以取得理想的免疫保护效果。目前认为，如重组蛋白、合成多肽和DNA等抗原的免疫原性较弱是重要原因之一，因此需要设法提高免疫反应的强度，并且还有一些疫苗需要转变免疫反应类型，以突出粘膜免疫等。这些方面的问题使佐剂的使用显得尤为迫切和重要，因此对于粘膜免疫佐剂的研究已经成为感染免疫和疫苗领域的一个研究热点2。目前，已报道
3、的粘膜免疫佐剂主要分为四类：第一类是细菌性物质；第二类是各种细胞因子；第三类是某些无机成分；第四类是可增强抗原递呈的相关载体3。1 细菌性物质大多数细菌来源的蛋白、核酸或者其它成分均能增强免疫，其原因大多是它们的保守成分可与模式识别受体(Pattern-recognition receptor，PRR)结合。PRR主要分为两种：Toll样受体(Toll-1ike receper，TLR)和核苷酸结合的寡聚化结构域(Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)。其中TLR识别胞外配体，NOD针对胞内病原体及其产物引发级联信号转导。1.1 细菌毒素和
4、其衍生物1.1.1 霍乱毒素(CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(LT) CT和LT都属于A-B型细菌蛋白毒素家族，而且两者的氨基酸序列有80的相同。晶体结构分析显示两者有很相近的结构特征，也很好地说明两者具有同源性。CT是由A、B两种亚单位组成的AB5型结构的六聚体蛋白，A亚单位(CTA)有240个氨基酸，在第192位氨基酸附近被蛋白酶裂解后可以生成CTA1和CTA2两个多肽，二者以二硫键相连。CTAl具有ADP-核糖基转移酶的作用；CTA2的主要功能是连接CTAl和B亚单位(CTB)。与CT相同，LT的A亚单位(LTA)是酶活性单位，B亚单位(LTB)具有与靶细胞结合的功能，LTB除可与神经节苷
5、脂l(GMl)结合，还可与GM2、非GM糖脂类受体等结合。与CT引起的致死性腹泻相比，LT引起的腹泻要温和的多，而且与CT相比，LT同样具有很好的粘膜佐剂作用，基本上不诱生IgE，却能有效地启动机体局部和全身的体液和细胞免疫。因此，LT作为佐剂可能比CT更胜一筹。CT(LT)发挥毒素的大致作用过程为CTB通过GMl的结合位点与细胞表面的GMl受体结合，经过吞噬作用CT分子进入细胞，主动转运至内质网，CTA与CTB分离，进入细胞质。CTAl通过结合NAD，ADP-核糖转移酶作用于GTP结合蛋白，引起腺苷酸环化酶长久活化，细胞内环化腺苷酸无限增加，刺激肠粘膜过度分泌水和电解质，产生腹泻等毒素效应。
6、目前认为，LT和CT主要通过以下方式诱导粘膜免疫反应4,5：增加上皮细胞的渗透性，增强抗原吸收；增强不同抗原呈递细胞的抗原呈递作用；调节B细胞的分化，使IgA的形成增加；诱导树突状细胞(DC)分泌白细胞介素1(IL-l)；通过上调IL-lO，下调IL-12，选择性地影响细胞表面分子的表达，抑制Thl细胞的产生，增强T细胞的调节活性。但是值得注意的是，细菌毒素的佐剂效应并不仅仅涉及一种机制，而是多种机制协同作用的结果。1.1.2 减毒或无毒CT和LT的衍生物 虽然LT和CT是强有力的粘膜免疫佐剂，但是由于具有毒性阻碍了它们在人体的应用。为了避免毒性，人们试图直接把CT和LT的B亚单位用作佐剂，但
7、研究发现，CTB或LTB直接与抗原混合免疫，其佐剂效应弱。若用化学方法或基因重组的方法与抗原结合后其佐剂活性会大幅度地提高，其机理可能是由于结合后的抗原不仅被DC、巨噬细胞有效摄取，还被原初B淋巴细胞有效摄取。但总的来讲，其佐剂效应都较全蛋白弱。CTBLTB在作为粘膜免疫佐剂时的应用方式主要有：CTBLTB与目的抗原按一定比例在体外直接混合；通过基因融合手段，构建可表达CTLT或CTBLTB与目的基因抗原融合的蛋白质系统；以化学偶联手段将抗原分子同CTBLTB在体外进行偶联；CTLT的多种突变体等。如今人们构建了很多突变体以去除或降低毒性，同时保留佐剂属性。它们的毒性不一，诱导的免疫反应强度差
8、异较大。研究发现，ADP一核糖基转移酶活性降低，其毒性降低，同时佐剂活性也降低6。1.2 病原体相关模式分子模式识别受体可以通过与病源体相关模式分子(PAMP)结合，激活天然免疫系统。PAMP包括脂多糖、肽聚糖、鞭毛和细菌CpG DNA等。TLR是一类主要的模式识别受体，它识别PAMP后可以活化NF-B转录因子和MAP激酶家族成员，从而使细胞产生促炎症因子，并使协同刺激分子的表达上调。这样不仅活化了天然免疫系统，最终也促进了获得性免疫的活化。因此，利用TLR配基(即一些PAMP)作为粘膜佐剂来激活天然免疫系统是一种很有希望的策略7。1.2.1 含CpG基序的DNA 细菌DNA中含有CpG基序，
9、它具有较好的佐剂活性。CpG具有佐剂活性是因为它可与TLR9结合，从而诱导促炎症因子、Thl型细胞因子和趋化因子的产生、也可以诱导APC上MHC和协同刺激分子的表达。在小鼠体内可以产生以Thl型为主的免疫反应，包括高水平的细胞毒性T淋巴细胞、IFN-的产生和IgG2a抗体的产生。含有CpG的寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)也是一种有效的粘膜佐剂。将CpG-ODN与纯化蛋白抗原一起经鼻免疫，可以诱导粘膜Th2型免疫反应(即IgA抗体的产生)和系统的Th1型免疫反应。目前，已有研究报道在小鼠生殖道疱疹病毒感染模型中，应用CpG-ODN为佐剂进行粘膜免疫可以诱导有效的免疫保护作用8。有实验证明，将C
10、pG-ODN通过阴道和口腔给予小鼠后，可以分别激活雌性小鼠阴道和消化道的粘膜免疫。因此，仅通过阴道粘膜给予免疫刺激剂CpG-ODN就可以在小鼠阴道粘膜迅速地诱导产生Th1型反应相关的细胞因子，如IFN-、IL-12、IL-18以及趋化因子RANTES、MIP-l和MIP-1等。另外，在没有任何病毒抗原的情况下，仅在阴道给予一剂CpG-ODN也可以在致死量阴道疱疹病毒攻击下提供有效的免疫保护9。该研究小组还证明CpG-DNA可以增强消化道粘膜的天然免疫。经消化道给予CpG-ODN可以提高胃肠道局部CC趋化因子RAN-TES，MIP-la，MIP-1的产生，以及CXC趋化因子IP-10的产生。更重
11、要的是CpG ODN在没有任何外源细菌抗原存在的条件下，经胃肠道给药同样可以抑制细菌在小鼠胃粘膜的克隆增殖10。扁桃体B细胞属于粘膜型B细胞，Cognasse等研究了多种CpG-ODN与扁桃体B细胞的反应。将IL-2，IL-10和sCD40L与不同的CpG-ODNs组合刺激B细胞，会对B细胞最终分化为抗体分泌细胞产生不同的影响11。因此，CpG-ODN可能成为一类能够调控局部免疫球蛋白类型和亚型的粘膜佐剂。1.2.2 单磷酰脂质A(MPL) MPL来源于细菌提取物，已被广泛应用于胃肠外疫苗佐剂。MPL是从沙门氏菌R595的脂多糖(LPS)中提取的，保持了LPS的大部分免疫刺激活性，但没有继承其
12、毒性。MPL具有佐剂活性是因为它能够活化抗原呈递细胞，诱导产生促炎症因子。这些都可以诱导产生抗原特异性细胞免疫和增强抗体水平。最近，MPL被用于口服和经鼻免疫，来诱导和增强抗原特异性粘膜和系统免疫反应。与CpG-DNA相似，MPL是通过活化TLR来发挥作用。Martin等12证明，MPL通过TLR2，TLR4诱导纯化的人单核细胞，以及人外周血单核细胞表达TNF-、IL-10、IL-12。通过检测NF-B的活性证明，MPL通过TLR2，TLR4激活NF-B。另外，MPL刺激单核细胞后，可以使其协同刺激分子CD80、CD86表达上调，当单核细胞用抗TLR2、TLR4的单克隆抗体预先处理，该效应会被
13、抑制。2 细胞因子佐剂细胞因子用作粘膜免疫佐剂可以直接定位于作用部位，常用的免疫部位有鼻粘膜和上呼吸道。细胞因子在许多动物模型系统中都是有效的免疫佐剂，能增强和保护机体免受病毒、细菌和寄生虫的侵袭，对肿瘤免疫和临床应用也有增效作用。研究较多的用于粘膜免疫佐剂的细胞因子有IL-1、IL-6、IL-12、IL-18、IFN、GM-CSF、淋巴细胞趋化因子等，实验表明，淋巴细胞趋化因子可以增强Thl和Th2型细胞的应答。IL-12、IL-18、IFN主要增强Thl型免疫反应，IL-6主要增强Th2型免疫反应。Staats等用IL-1、IL-6、IL-12、IL-18、GM-CSF的各种组合与抗原鼻部
14、免疫后，产生了混合型的抗原特异性反应，有些组合的免疫反应甚至强于CT，可见，细胞因子能有效增强粘膜免疫反应13。3 无机成分佐剂3.1 氟化物应用氟化物作为粘膜免疫佐剂的研究已有报道。氟化钠可以诱导大鼠T细胞中多聚磷酸肌醇降解为磷酸肌醇，升高细胞内自由Ca2+，并使T细胞受体的和链进行磷酸化，从而T细胞进入活化的早期阶段。Sumio等研究发现粘膜佐剂NaF能够消除口服耐受，引起抗体反应增加，鸡同时口服抗原与NaF后，血清IgG抗体水平明显增加。尽管鸡群有个体差异，并且抗体滴度较低，但在胆汁和泪液中均检测到IgA抗体3。3.2 多聚体研究发现，烷基聚丙烯酯多聚体Butyll6-p(AA)作为灭活
15、抗原粘膜免疫增强剂，可明显增强IgA对灭活新城疫病毒(iNDV)、灭活流感病毒MRC-11(iMRc-11)、甲型得克萨斯血凝素神经氨酸酶亚单位流感病毒(HANA)的反应3。3.3 亲脂性季铵盐KLinguer等以二甲基双十八基季铵溴化物(DDA)为粘膜免疫佐剂，鼻内接种DDA与白喉类毒素(DT)，破伤风类毒素(TT)或呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白重组片断BBG2Na的混合物都可诱导全身和局部的强免疫应答，其作用机理可能是增加通过鼻腔上皮细胞的抗原量，产生炎性刺激以促进抗原摄取3。4 可增强呈递的相关载体抗原可以被包裹在相应载体中，或粘附于其表面，或与其偶联，这样能增强抗原递呈，降低抗原释放
16、速度，减少免疫次数，增强抗原特异免疫反应，为疫苗的口服输送提供了良好的手段。4.1 免疫刺激复合物(immune-stimulating complexs，ISCOMs)ISCoMs是由脂质、胆固醇和Quil A构成的一种骨架样颗粒，大小约40nm。蛋白抗原和Quil A合并入这种颗粒，将Quil A的佐剂性和所结合抗原的免疫原性融合在一起，从而能将疫苗直接定位于APCs。人轮状病毒抗原首次口服免疫无菌猪，再联合ISCOMs鼻内加强免疫两次，诱导了抗原特异性肠道IgA抗体和血清中和抗体应答，并提高了猪的抗感染能力。ISCOMs是应用于人体的很有发展前景的疫苗载体14。4.2 脂质体近来相关研究表明，由脂质体构成的全细胞鼠疫杆菌疫苗经鼻内免疫可增强局部IgA和IgG应答，保护机体抵抗呼吸道细菌的
