《丙型肝炎病毒NS5B 在Hep3B 细胞的表达及活性分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《丙型肝炎病毒NS5B 在Hep3B 细胞的表达及活性分析（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、丙型肝炎病毒 NS5B 在 Hep3B 细胞的表达及活性分析孔令保， 刘志文， 吴晓玉， 刘好桔， 王园秀 (江西农业大学生物科学与工程学院南昌市发酵应用技术重点实验室 南昌 330045 )基金项目：江西农业大学博士基金(2727) Supported by the PhD Foundation of Jiangxi Agricultural University (2727)作者简介： 孔令保, 男， 江西省南昌市人，博士，美国芝加哥大学医学院博士后， 讲师，主要从事 HCV、HBV 等病毒的致病机制和抗病毒药物的研发，发表 SCI 论文 12 篇，核心期刊论文 3 篇。电话：（0791）
2、3813459， E-mail:摘 要： 目的 丙型肝炎病毒 NS5B 基因转染人肝癌细胞系 Hep3B 细胞，检测NS5B 的表达与细胞内 RNA 聚合酶活性。方法 使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒 NS5B 基因的重组载体 pcDNA-5B 转染到 Hep3B 细胞。RT-PCR 和 Western blot 鉴定 NS5B 基因的表达，荧光素酶试验检测 NS5B 的细胞内 RNA 依赖的 RNA聚合酶活性。结果 RT-PCR 和 Western blot 证实转染的 NS5B 基因在 Hep3B 细胞成功地进行转录和翻译，荧光素酶试验表明 Hep3B 细胞表达的 NS5B 蛋白具有细胞内
3、 RNA 依赖的 RNA 聚合酶活性。结论 人肝癌细胞系 Hep3B 细胞可以成功表达 NS5B 基因，且表达的 NS5B 蛋白具备细胞内 RNA 依赖的 RNA 聚合酶活性。关键词： 丙型肝炎病毒； NS5B； Hep3B 细胞； 活性Expression and activity analysis of hepatitis C virus NS5B in Hep3B cellsKONG Ling-bao WU Xiao-yu LIU Zhi-wen LIU Hao-ju WANG Yuan-xiu(Nanchang Key Laboratory of Fermentation Applic
4、ation Technology, College of Life Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China,)Abstract: objective To investigate the expression and activity of transfected hepatitis C virus (HCV) NS5B in human hepatic carcinoma cell line Hep3B and provide a tool for studying th
5、e mechanisms of HCV replication and for the identification of NS5B inhibitors.Methods The recombinant vector pcDNA-5B expressing wild-type HCV NS5B gene was transfected to Hep3B cells using Lipofectamine 2000 reagent kit. Expression of the transfected NS5B gene was determined by RT-PCR and Western b
6、lot analysis. Luciferase assays analyzed intracellular NS5B polymerase activity.Results The results form both RT-PCR and Western blot analysis demonstrated the expression of transfected NS5B gene in Hep3B cells. luciferase assays revealed RNA -dependent RNA polymerase(RdRp) activity of expressed NS5
7、B protein in Hep3B cells.Conclusion The enzymatically active HCV NS5B can be expressed by human hepatic carcinoma cell line Hep3B, Key words: HCV; NS5B; Hep3B cells; Activity 丙型肝炎病毒( Hepatitis C virus, HCV) 是引肝炎的主要病原因子,对人类健康和生命危害巨大。全世界感染的总人数已经超过了 1.8 亿。高达 85% 的感染者可发展成慢性肝炎。慢性肝炎又可进一步发展成肝硬化，肝细胞癌 1。迄今为止
8、还没有疫苗预防 HCV 感染，也没有一种专门针对 HCV 的治疗药物。现有的主要治疗手段是聚乙二醇化 IFN- 加核苷类似物病毒唑的联合治疗，但这种治疗手段效率低，副作用大 2，所以迫切需要开发一些更安全有效的抗病毒药物。HCV 非结构蛋白 NS5B 全长 591 个氨基酸，具有 RNA 依赖的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)活性。在 HCV 基因组复制过程中, HCV正、负链的合成均需要 NS5B 的参与。 NS5B 的活性丧失会导致 HCV 在感染细胞内的复制停止。由于正常的宿主细胞不存在 NS5B 或其类似物的表达，抑制NS5B 的活
9、性可特异性地阻断 HCV 复制而不会对宿主细胞产生毒副作用，因此NS5B 成为抗 HCV 药物筛选的一个非常理想的靶点 3，4 。本研究中,我们将丙型肝炎病毒 NS5B 基因转染人肝癌细胞系 Hep3B 细胞，检测 NS5B 的表达与细胞内活性，为开展 NS5B 抑制剂的筛选研究和 NS5B 催化的丙型肝炎病毒复制机制研究奠定基础。1 材料和方法1.1 材料人肝癌细胞系 Hep3B 由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）提供,NS5B 蛋白免疫血清由 University of Kentucky 的罗广湘教授惠赠，兔抗 actin 多克隆抗体购自 Santa Cruz 生物公司，包含 HCV
10、野生型 NS5B 基因的重组质粒 pcDNA-5B、 包含丧失酶活性的 HCV 突变型 NS5B 基因的重组质粒 pcDNA-5BGAA、 包含对应于 HCV 负链 RNA3末端区 简称为（-）3T序列(长度为 578 nt)的 DNA片段的重组质粒 pGEM-()3T 和包含依次反向连接在 CMV 启动子后面的萤火虫荧光素酶基因和 HCV 5非翻译区的重组质粒 pcDNA-(-)luc-(-)IRES 为以前构建 5-7 ， Ex-Taq DNA 聚合酶和 AMV RTase 购自大连宝生物工程公司，限制性内切酶 Pst I 和 DNA 回收试剂盒（DNA Extraction Kit）购自
11、晶美生物工程公司，海肾荧光素酶质粒 pRLCMV 和 Dual-luciferase Reporter Assay system kit 为 Promega 公司产品，转染试剂盒 LipofectaminTM 2000 为 Invitrogen 公司产品，TRIZOL 试剂为 MRC（Molecular Research Center, Inc.）产品，培养Hep3B 细胞的 DMEM 和胎牛血清（FBS）为 GIBCO 公司产品，ECL Chemiluminescence Detection Kit 为 Amersham 公司产品。1.2 细胞转染Hep3B 细胞用含有 10胎牛血清的 DM
12、EM 于 37，5% CO2中培养，按照转染试剂盒 LipofectaminTM 2000 (Invitrogen)说明书将重组质粒 pcDNA-5BGAA和pcDNA-5B 转染 HepG3B 细胞。1.3 RT-PCR细胞转染 48h 后，使用 Trizol 试剂提取总 RNA。RNase-free DNase I 处理去除 DNA,然后以此 RNA 为模板，使用 AMV RTase 和 NS5B 反向引物进行逆转录。获得的 cDNA 作为模板，使用 Ex-Taq DNA 多聚酶和 NS5B 引物对进行 PCR 反应。同时，也 RT-PCR 扩增 GAPDH 作为内参。使用的 NS5B 引
13、物对正向：5-CCTCGAGATGGCGTCAATGTCTTATACCTGG-3，反向： 5-GTTCACCGGTTGGGGAGG-3。使用的 GAPDH 引物对正向: ATCACTGCCACCCAGAAGAC_, 反向：ATGAGGTCCACCACCCTGTT。0.7% Agarose 电泳鉴定 PCR 产物。1.4 Western blot 检测细胞转染 48h 后，收集细胞制备电泳样品，12聚丙酰胺凝胶电泳，转膜，然后使用抗 NS5B 的兔血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 为二抗进行 Western blot 分析。蛋白带的检测用 ECL 试剂盒。1.5 荧光素酶试验重组
14、质粒 pcDNA-()luc-()IRES 用 PstI 酶切，回收酶切的约 6.0kb 大片断（简称 CLI：该片断中萤火虫荧光素酶基因和 HCV 5非翻译区依次反向连接在 CMV 启动子后面)。pcDNA-5B GAA（0.01g/孔）或 pcDNA-5B（0.01g/孔）、CLI（0.1g/孔）和内参报告质粒 pRL CMV（0.001g/孔）共转染 96 孔培养的 Hep3B 细胞，转染后 1、2、 3、4 、5 d，按照 Dual-luciferase Reporter Assay system kit 说明书收获裂解细胞和检测荧光素酶活性。试验重复 3 次，采用 SPSS11.5
15、统计软件分析 3 次检测的荧光素酶活性,结果以Error!SD 表示。2 结果2.1 RT-PCR 检测 NS5B 基因在 Hep3B 细胞的转录RT-PCR的结果表明：pcDNA-5B和 pcDNA-5BGAA转染的Hep3B细胞出现1.8kb的特异性NS5B目的带，而阴性对照空载体pcDNA3.1()转染和未转染的Hep3B细胞未见特异性的NS5B目的带出现。 同时所有细胞均检测到446bp的GAPDH内参带。表明野生型和突变型NS5B基因均已转录产生相应的mRNA（图1） 。图1 RT-PCR检测NS5B mRNAM:DNA/HindIII 标准; 1: pcDNA-5B GAA转染的H
16、ep3B细胞;2: pcDNA-5B转染的Hep3B细胞；3：空载体pcDNA3.1( )转染的Hep3B细胞（阴性对照） ；4：未转染的Hep3B细胞（阴性对照）2.2 Western blot检测NS5B蛋白的表达用抗NS5B的兔血清作为一抗，进行Western blot反应。实验结果表明：pcDNA-5B和 pcDNA-5BGAA转染的Hep3B细胞均含有 1条相对分子质量约为6610 3的目的带能和抗NS5B的兔血清反应，而阴性对照空载体pcDNA3.1()转染和未转染的Hep3B细胞不含有能与该抗体反应的蛋白。说明转染的野生型和突变型NS5B基因在Hep3B细胞中成功地进行翻译，产生野生型和突变型NS5B蛋白（图 2） 。图2 Western blot检测NS5B蛋白的表达1: pcDNA-5BGAA转染的Hep3B细胞;2: pcDNA-5B转染的Hep3B细胞；3：空载体pcDNA3.1()转染的He
