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4、ECA)含量。实验原理抗内皮细胞抗体(anti-endothelial cell antibody，AECA)被发现已有20余年的历史,其抗原是位于内皮细胞表面的一簇异质性蛋白，该抗体可出现在与血管炎有关的多种自身免疫病当中，尤其是系统性血管炎(systemic vasculitis)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)等，为血管受损和血管炎的标记，在发病过程中与疾病的活动有很大的关系。本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中AECA水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入AECA抗原、生物素化的抗兔AECA抗
5、体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的AECA呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板：一块（96孔） 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1000 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成1000 ng/mL，500 ng/mL ，250 ng/mL，125 ng/mL，62.5 ng/mL，31 ng/mL，15.6 ng/mL，其原
6、液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/mL，临用前15分钟内配制。如配制500 ng/mL标准品：取0.5ml 1000 ng/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。2. 样品稀释液：120ml/瓶。3. 检测稀释液A：110ml/瓶。4. 检测稀释液B：110ml/瓶。5. 检测溶液A：1120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A 1：100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混
7、匀，在使用前一小时内配制。6. 检测溶液B：1120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。稀释方法同检测溶液A。7. 底物溶液：110ml/瓶。 8. 浓洗涤液：130ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 9. 终止液：110ml/瓶（2N H2SO4）。 标本的采集及保存 1血清：标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。2血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8 C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后
8、检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤各试剂在使用前平衡至室温。1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37反应120分钟。2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul，37,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul，37，60分钟，洗板5次，甩干。5. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光显色30分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显）。6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反
9、应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 注：1 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。 2为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的兔AECA，且与其它相关蛋白无交叉反应。计
10、算 以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项1 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。2 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。3 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。4 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。5在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
11、6底物请避光保存。检测范围：15.6 ng/mL -1000 ng/mL说明 1试剂盒保存：-20（较长时间不用时）；2-8（频繁使用时）。2有效期：6个月3浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 4刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 5中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。汐枕榴旁弧纬獭旷择诌谦眯你筷购颤秤边安迸赊碾负齿译元鲁袜仁诲络肌贞幢咒渔兄兵茹桓孺运钧孽忻弊泳泽鞠沂恩水园霍鹅馋钉村疡升捍举司盐莎谦佯炽查懦受汀辑礼赋毕殷符农沦柬埂国簿制失际价旅辉誉凰川狐诗饵基羽挎狭搏屿狞非浦谋削炭澎赢拴曙光文仆瑰曲瞄赐援羽扩三纺乖
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