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1、粪便中芽孢杆菌的分离和鉴定1、 实验原理：通过对粪便的处理，对其进行细菌分离，选择出芽孢杆菌。芽孢杆菌多为革兰氏阳性菌，需氧或者兼性厌氧。通过普通培养基进行细菌培养，观察其菌落的形态、特征。对典型的菌落进行革兰氏染色和芽孢染色。之后进行普通培养基、血琼脂培养基、固体培养基培养。之后进行过氧化氢、VP实验、淀粉水解、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、甲基红实验、吲哚产生实验、苯丙氨酸脱酸实验、葡萄糖的水解实验、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、乳糖的分解实验、液化明胶实验、硫铵水解实验等生理生化实验。对细菌进行16srDNA序列测序，测GC碱基的所占比例、PCR测序，确定具体为何种芽孢杆菌，最后进行小鼠毒性实验。
2、2、 实验材料粪便锥形瓶、烧杯、载玻片、玻璃棒 、胶头滴管玻、璃珠、培养皿、移液管、移液枪及枪头小试管、试管、细玻璃棒、接种环、接种针、搪瓷缸、水浴锅、纱布、冰箱、摇床、酒精灯、蒸馏水、无菌水、恒温培养箱、高压锅、电炉、pH试纸、PH计吸水纸、显微镜、秒表、天平、电子称、电子天平、温度计、记号笔、滤纸、塞子、纱布、冰箱PCR仪、微量移液器、一次性手套、小鼠、手术刀、注射器草酸铵结晶紫溶液、碘液、石碳酸溶液、95%酒精、碱性美蓝溶液、3%过氧化氢溶液、肌酸/肌酐、40%氢氧化钾、无菌羊血清、3%淀粉溶液、柠檬酸钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂、磷酸一氢钾、氯化钠、溴麝香草酚蓝酒精溶液、硝酸钾、蛋白胨
3、、1%氢氧化钠、对氨基苯磺酸、5mol/L醋酸、-萘胺、脱脂棉、二苯胺、浓硫酸、葡萄糖、甲基红溶液、DL-苯丙氨酸、酵母浸液、10%氯化铁、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、甘露醇、0.2%溴麝香草酚蓝水溶液、1%溴麝香草酚蓝水溶液、HL-葡萄糖培养管、硫胨、牛肉膏、明胶、对位二甲氨基苯甲醛、无水乙醇、青霉素、反应缓冲液、2mM脱氧核苷三磷酸底物、耐热DNA聚合酶、3、 实验步骤3.1粪便的处理;取样品1g，加至带玻璃珠的含100mL无菌水的锥形瓶中，静置20min后，在摇床上20r/min充分振荡30min，将样品液于80水浴15min，取10mL样品液均匀涂布在制备好的普通营养琼脂平板上
4、，37过夜培养 3.1.1普通肉汤培养基 配方：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钾1g、蒸馏水1000mL 配制：按上述要求称量（先称盐类、蛋白胨、牛肉膏），至于铝锅或者搪瓷缸； 将上述成分混合加热溶解后，以0.1mol/L氢氧化钠调整PH为7.47.6 3.1.2普通琼脂培养基的制作 配方：普通肉汤500ml（牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾、蒸馏水）、琼脂10g（在液体培养基加入琼脂1.5%2%为固体培养基、加入0.30.5%为半固体培养基）配制： 1）将称好的琼脂加到普通肉汤内，加热煮沸待琼脂完全融化，分装试管或用于制备琼脂平板。分装试管每管约45ml。分装完毕塞好棉塞，
5、包扎好待灭菌。 2)高压蒸汽灭菌后，趁热将试管口的一端放在玻璃棒上，使之有一定的浓度，凝固后即成普通琼脂斜面。也可直立，凝固后即成高层琼脂。 3)剩余部分的普通琼脂以手掌感触，若将琼脂瓶紧紧手中感觉烫，但仍能紧握时，即为倾倒平皿的合适温度（5060）.每只灭菌培养皿倒入1015ml，将培养皿盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养皿平铺于皿底，即成普通琼脂平板。3.1.3鲜血琼脂培养基的制备 1）将灭菌的普通琼脂培养基加热融化，待冷却至50，加入无菌的脱纤绵羊或者家兔的鲜血5%6%混合后，分装灭菌试管，立即摆成斜面或者倾注于灭菌平皿（琼脂温度过高加入后为紫褐色，过低时鲜血加入不凝固，不易混合。
6、混合时切勿产生气泡）。待凝固后，至37无菌检验24h，无杂菌生长方可应用。 2）无菌血液采用无菌操作采自健康动物，将血液加到盛有5%灭菌枸橼酸钠或者3%灭菌肝素的100ml三角瓶内，至冰箱待用。 3.2细菌的分离： 将上清液接种于营养肉汤，37,200r/min培养24h，,取培养液80水浴15min，杀死非芽孢杆菌，接种于营养肉汤，37，200r/min富集培养20h。 3.3：细菌的纯化： 取富集菌液梯度稀释10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，选择三个合适的梯度混菌划线分离（划线法先将平板置于30（24-48 h）或37（18-24h），无菌检查，表面冷凝水干燥）。每个梯度二
7、个平皿，将平板倒置，于35-37 24-48h。对长出的单菌落进行编号，选择生长快、菌落大，表面干燥，粗糙，不透明的菌落转接于斜面培养。挑取少许菌苔涂片，做芽胞染色判断是否为芽孢杆菌。 3.3.1细菌的制涂片备：取一块干净的载玻片，各滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环 以无菌操作法在火焰旁从菌种上挑取少许菌体于水滴中，混匀并涂成薄膜，干燥，固定。 3.3.2革兰氏染色 1）涂片、干燥、固定 2）滴加草酸铵结晶紫溶液，经12min，用冲洗瓶水洗，直立，干燥。 3）滴加碘液13min，水洗。 4）加95%酒精脱色，0.51min，水洗。 5）加稀释的石碳酸复红/黄水溶液复染1030s，水洗。 6）
8、用吸水纸吸干，干燥，有油镜观察。 结果判定：革兰氏阳性菌呈蓝紫色；革兰氏阴性菌呈红色。 3.3.3芽孢染色 1）涂片，干燥，固定。 2）滴加石碳酸复红染液，加热至产生蒸汽，染色5min，水洗。 3）脱色：滴加95%酒精，脱色2min，至淡红色为止，水洗。 4)复染;滴加碱性美蓝溶液，60s，水洗。 5）干燥，镜检 结果判定：芽孢呈红色，菌体呈蓝色3.4生理生化实验3.4.1过氧化氢酶（触酶）试验 实验步骤：方法一：取干净的载玻片，在上面滴一滴3%过氧化氢溶液，挑取一环斜面培养的试验菌，放在过氧化氢溶液中混匀，若有气泡出现，则为过氧化氢酶试验阳性；无气泡产生者为阴性。方法二：取2ml3%的过氧化
9、氢加入到干净的小试管中，用细玻璃棒蘸取实验菌，插入到过氧化氢液面以下，若有气泡为阳性方法三：将1mL3%过氧化氢滴加在生长物菌落上，有气泡产生为阳性。 注意：试验菌不应培养在含有血液的培养基，易造成假阳性反应；不能铂环代替玻璃棒，会反应产生气泡；每次反应应设立对照，阳性对照菌为金黄色葡萄球菌，阴性为链球菌3.4.2VP实验1、培养基：同MR试验2、试剂：奥美拉式试剂：0.3g肌酸或者肌酐溶于100ml40%氢氧化钾即成贝立脱氏试剂：甲液为6%-萘酚酒精溶液，乙液为16%的氢氧化钠溶液硫酸铜试剂：1g硫酸铜溶于40ml氨水中，再加10%氢氧化钠至1000ml3、实验步骤： 1）将被检细菌接种到葡
10、萄糖蛋白胨水中，置37培养48h。 2）在培养物中加入等量的奥美拉式试剂（或硫酸铜试剂），混合，或1ml培养物加入0.5ml贝立脱氏试剂甲液和乙液振荡混合，观察结果。 3）结果判定：在5min内呈现粉红色为阳性；长时间无反应，置37培养4h或室温过夜。颜色仍不变者为阴性3.4.3淀粉水解实验 1、培养基 配方：营养琼脂90ml、无菌羊血清（只对不易生长的细菌才加）5ml、无菌3%淀粉溶液 配制：将琼脂加热融化，冷却至50时，以无菌操作法加入无菌羊血清及无菌淀粉溶液，混合均匀后倾注平板。 试剂：革兰氏碘液 2、实验步骤：1）将待检菌划线接种于上述平板上，置37培养24h2）形成菌落后，在菌落处滴
11、加革兰氏碘液，以铺满菌落周围为宜，观察颜色变化。3）结果判定：培养基呈现蓝色，能水解淀粉的细菌其菌落周围出现无色透明圈。3.4.4柠檬酸盐利用试验 1、培养基：西蒙式培养基 配方：柠檬酸钠1g、硫酸镁（Mgso4.7H2o）0.2g、磷酸氢二钾1g、琼脂20g、磷酸二氢铵1g、氯化钠5g、1%溴麝香草酚蓝酒精溶液10ml、蒸馏水1000ml 配制：将除琼脂和溴麝香草酚蓝溶液外的各成分溶解后，调解pH6.87.0，加入琼脂融化，再加入溴麝香草酚蓝溶液，分装试管，经121灭菌15min，制成斜面备用。 2、实验步骤1）将待检菌在培养基上先划线再穿刺，37培养观察24d。2)结果判定：阳性者在培养基
12、斜面上生长，并且西蒙式培养基由草绿色变为蓝色。3.4.5硝酸盐还原试验1、需氧菌培养基： 配方：硝酸钾0.2g、蛋白胨5g、蒸馏水1000mL配制：将各成分溶解，调pH7.4，试管分装，经121灭菌20min试剂：甲液：将0.8g对氨基苯磺酸溶解于100mL5mol/L醋酸即成 乙液：将0.5g-萘胺徐徐加热溶解于100mL5mol/L醋酸后，用脱脂棉过滤即可。二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。2、 实验步骤; 1)将待检菌接种到培养基上，同时设立对照，37培养观察4d，每天取培养液少许放入两支返京的小试管中，每个试管再滴加甲液和乙液各一滴，对照管同样处理
13、，观察结果。 2）结果判定：如试管菌液呈现红色、橙色者为阳性反应。如无红色出现，则可加一滴二苯胺试剂，此时若呈现蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐的存在；若不呈蓝色反应，则表示硝酸盐和形成的硝酸盐已被还原成其他物质，仍应记为硝酸盐还原实验阳性反应。3.4.6甲基红（MR）试验1、培养基： 配方：蛋白胨0.7g、磷酸氢二钾0.5g、葡萄糖0.5g、氯化钠0.5g，蒸馏水100ml 配制:将上述成分混合于蒸馏水中，加热溶解，调解pH7.27.4，滤纸过滤，分装与小试管内，每管35ml，加塞包好，经115灭菌20min后备用。 试剂：甲基红0.02g、95%酒精60ml、蒸馏水40ml2、 实验步骤：
14、 1）将待检菌接种于培养基，置37培养48h。 2）取少量培养液于另一小试管，加入几滴指示剂，观察颜色变化，若无颜色变化可继续培养45d再进行试验。 3）结果判定：培养液呈现红色表示为阳性；呈现黄色为阴性。3.4.7苯丙氨酸脱氨实验1、培养基 配方：DL-苯丙氨酸2g、氯化钠5g、琼脂12g、酵母浸膏3g、磷酸氢二钠1g、蒸馏水1000ml 配制：将上述培养基配方中的各成分混合于蒸馏水中，加热溶解后，调解pH为7.4，过滤分装，115灭菌20min。趁热制成斜面备用 试剂：10%三氯化铁溶液 器材：恒温培养箱、高压锅、电炉、搪瓷缸、。接种针、ph试纸、小试管2、 实验步骤 1）挑取大量待检菌培养物，接种到上述培养基斜面上，37培养1824h，在生长好的细菌的培养基斜面上滴加0.2ml（45滴）10%三氯化铁溶液 2）结果判定：斜面变绿为阳性；否则阴性3.4.8葡萄糖酵解实验（O/F试验、HL试验） 1、培养基： 配方：蛋白胨0.2g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.03g、葡萄糖1g、琼脂0.5g、蒸馏水100ml、1%溴麝香草酚蓝水溶液0.3ml 配制：除指示剂意外，溶解以上各成分、调解pH6.87.0，再加入指示剂，分装试管，115灭菌20min。 2、实验步骤：取两支HL葡萄糖培养管，至沸水中10min，冷却后将实验菌穿刺接种。其中一支用灭菌的液体石蜡覆盖隔绝空气，为封闭管
