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1、ICS7108099G17备案号：20517-2007HG中华人民共和国化工行业标准HGT3935-2007哺乳类动物细胞培养基Cellculturemedia200704-13发布20071001实施中华人民共和国国家发展和改革委员会发布HGT3935-2007刖青本标准附录A为资料性附录。本标准由中国石油和化学工业协会提出。本标准由全国化学标准化技术委员会有机分会(SACTC63SC2)归口。本标准由北京清大天一生物技术有限公司负责起草。本标准主要起草人：陈文庆、罗海春。HGT3935-2007哺乳类动物细胞培养基1范围本标准规定了哺乳类动物细胞培养基的要求、试验方法、检验规则及标志、包装
2、、运输、贮存。本标准适用于哺乳类动物细胞培养基。该产品主要用于哺乳类动物细胞培养。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBTt91-2000包装储运图示标志(eqvISO7SO；1997)GBT1250极限数值的表示方法和判定方法GBT6679-2003固体化工产品采样通则中华人民共和国药典2005年版二部附录中华人民共和国药典2005年版三部附录中华人民共和国药典2
3、005年版二部纯化水3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。每升标示量markerliter在产品包装上标注的配制1L液体细胞培养基所需干粉细胞培养基的质量，单位为g。4分类和命名哺乳类动物细胞培养基按主要成分的不同分为四型，其命名及对应主要成分见表l。HGT3935-2007表1哺乳粪动物细胞培养基型号命名及对应主要成分型号命名8主要成分氯化钙、九水硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、L精氨酸盐酸盐卜胱氨酸盐酸盐、L-谷氪酰胺、甘氮酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、I，亮氨酸、L_DMEM粉末细胞培养基救氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、I，苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨
4、酸、o酪氨酸、L-缬氨酸、n葡萄糖、酚红、丙酮酸钠、n泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、L-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺氯化钙、九水硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、无水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、L-丙氨酸、I精氨酸盐酸盐、L-天冬氨酸、L半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L_谷氨酸、L一谷氪酰胺、甘氨酸、Lu组氨酸盐酸盐、L-羟脯氨酸、I，异亮氨酸、L亮氨酸、L一赖氨酸盐酸盐、L_蛋氨酸、L_苯丙氨酸、卜脯氨酸、L-丝氨酸、I一苏氨酸、L-色氨酸、199粉末细胞培养基I，酪氨酸、L-缬氨酸、硫酸腺嘌呤、腺苷酸、脱氧核糖、肛葡萄糖、谷胱甘肽(还原型)、盐酸鸟嘌呤、次黄嘌呤、酚红
5、、n核糖、乙酸钠、胸腺嘧啶、屎嘧啶、黄嘌呤、维生素C、维生素E、维生素H、D泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、L一肌醇、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素A醋酸酯氯化钙、九水硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、L_精氪酸盐酸盐、L一天冬氨酸、L一天冬酰胺、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L组氨酸盐酸盐、MEM粉末细胞培养基I一异亮氨酸、L_亮氨酸、L一赖氨酸盐酸盐、L_蛋氨酸、L-苯丙氨酸、卜丝氨酸、Lf苏氨酸、L-色氨酸、卜酪氨酸、L-缬氨酸、n葡萄糖、酚红、丁二酸、丁二酸钠、口泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、L肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄紊、盐酸硫胺四水
6、硝酸钙、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、L一精氨酸、L_天冬酰胺、L-天冬氨酸、L_胱氨酸盐酸盐、L一谷氨酸、L一谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、卜羟脯氨酸、L异亮氨酸、I，亮氨酸、L一赖氨酸盐酸盐，L_蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L_脯氨酸、L丝氨酸、L一苏RPMIt640粉末细胞培养基氨酸、L一色氨酸、L一酪氨酸、卜缬氨酸、n葡萄糖、谷胱甘肽(还原型)、HEPES、酚红、维生素H、D泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I。一肌醇、烟酰胺、对氮基苯甲酸、盐酸毗哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生索Blz8每一型号可根据配方不同分为若干亚型。5性状粉红色或类白色固体粉末。6要求哺乳类动物细胞培养基应符合表2所示的
7、技术要求。HGT3935-2007表2技术要求指标项目DMEM199MEMRPMI1640粉末细胞培养基粉末细胞培养基粉末细胞培养基粉末细胞培养基澄清度澄清pH值8(每升标示量L)320640390630390-690640830干燥减量的质量分数50渗透压6(mOsmkgH20)238291238299228301223273细菌内毒素(EUmI)10细菌数(CFUg)200微生物限度霉菌数(CFUg)50细胞形态正常细胞生长试验细胞生长试验合格8每种亚型允许的pH偏差范围为士030。b每种亚型允许的渗透压偏差范围为5。7试验方法除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和中华人民共和国
8、药典2005年版中规定的纯化水。71澄清度的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水1000mL，搅拌至溶解。按中华人民共和国药典2005年版二部附录B进行。72pH值的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水1000mL，搅拌至溶解。按中华人民共和国药典2005年版附录H进行。73干燥减的测定按中华人民共和国药典2005年版二部附录L干燥失重测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10。74渗透压的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水l000mL，搅拌至溶解
9、。按中华人民共和国药典2005年版二部附录G渗透压摩尔浓度测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5。75细菌内毒素的测定按中华人民共和国药典2005年版附录E细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。称取1100每升标示量的实验室样品，精确至00001g，加人细菌内毒素检查用水(市售)10mL溶解，吸取该溶液01mL加细菌内毒素检查用水(市售)39mL，混匀即得试验溶液。76微生物限度的测定按中华人民共和国药典2005年版附录J微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。3HGT3935-2007检查法采用平皿法。称取实验室样
10、品1g，精确至001g，加入无菌纯化水10mL溶解，混匀即得试验溶液。77细胞生长试验771方法提要7711本试验所用容器具及溶液均为无菌，试验操作过程均为无菌操作。7712细胞在37恒温条件下，在含体积分数为10小牛血清的细胞培养液中生长48h72h，观察细胞形态并进行细胞计数细胞生长48h72h后，更换不含小牛血清的细胞培养液，继续培养48h，观察细胞形态并进行细胞计数。772试剂和材料7721小牛血清：中华人民共和国药典2005年版三部附录D。7722平衡盐溶液：称取氯化钾02g，精确至001g；无水磷酸二氢钾02g，精确至001g，氯化钠80g，精确至001g；无水磷酸氢二钠115g，
11、精确至0001g；加纯化水1000mL，混匀、过滤除菌即得。7723VERO细胞：代次不超过150代。7724细胞培养液：按产品使用说明书要求配制。7725胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶(活力1：250)25g，精确至001g，加1000mL平衡盐溶液，混匀、过滤除菌即得。773仪器7731医用净化工作台：洁净级别为百级。7732二氧化碳恒温培养箱：能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为(5土01)，能在(37士1)恒温。7733细胞培养瓶：T25型、无菌。7734显微镜：倒置、相差。7735血球计数板。7736盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。774试验步骤7741制备细胞悬液77411将细胞培养
12、液从细胞培养瓶内吸出，用平衡盐溶液洗细胞一次。77412向细胞培养瓶内加入胰蛋白酶溶液1mL，于(37士1)消化3min5min。在显微镜下观察，当细胞变圆接近脱壁时，将胰蛋白酶溶液倒掉。77413根据细胞密度加入一定量细胞培养液，用吸管吹打，使细胞脱壁制成细胞悬液A。7742细胞培养77421吸取一定量的细胞悬液A，加到细胞培养瓶内。77422向细胞培养瓶内加入10mL含体积分数为10小牛血清的细胞培养液，使细胞接种密度为5104细胞mL。77423将细胞培养瓶送入二氧化碳恒温培养箱，在(37士1)及二氧化碳体积分数为(5士01)条件下进行培养。77424培养48h72h，观察细胞形态，并按
13、7743计数。77425当细胞密度达到1105细胞mL时更换不含小牛血清的细胞培养液10mL，继续培养48h，观察细胞形态并计数。7743细胞计数，77431将需要计数的细胞按7741方法制备细胞悬液B。77432吸取细胞悬液B100pL转移至离心管中，视细胞量确定是否稀释及稀释倍数。HGT3935-200777433将盖玻片盖于计数板中心的计数室上方。调整计数板中的细胞数量在100个300个。沿盖玻片边缘点加细胞悬液使其通过毛细作用自然渗入，不要留有气泡，不要外溢，显微镜下计数。77434观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，一般遵循“计左不计右，计上不计下”的原则。将计数板观察细胞数代人下列公式：计数板观察细胞数104稀释倍数4一细胞数mL775分析结果的表述培养48h72h的细胞形态为成纤维样，贴壁生长，正常细胞形态参见附录A。72h内细胞数量应达到1105细胞mL。继续培养48h的细胞形态为成纤维样，贴壁生长，正常细胞形态参见附录A。细胞计数应不小于1105细胞mL。8检验规则81表2技术要求中的所有项目均为出厂检验项目。82使用同一台混合设备一次混合量所生产的均质产品为一批。每批均必须检验。83按GBT6679-2003的规定采样。将所采样品均匀分成两份，分别装于两个清洁干燥的无菌、密闭、避光容器内，粘贴标签，注明生产企业名称、产品名称、批号、生产日期，采
