《【2017年整理】地高辛标记及检测试剂盒I(POD)说明书》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【2017年整理】地高辛标记及检测试剂盒I(POD)说明书（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1DIG Random Labeling and Detection Kit （POD） (for color detection with DAB)DNA 探针标记和检测试剂盒 产品编号：MK1008保存期：一年 -20冰冻保存。用途：用于 DNA 探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。工作量：可用于标记 0.13g 的探针 6 次及 1000 张切片的原位杂交或 12 次 1010cm 膜上杂交检测。原理 所谓 DNA 探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的
2、。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 D1G-11-dUTP 作为合成底物，以单链 DNA 作为模板，在 Klenow 酶的作用下，合成掺入地高辛的 DNA 链。以地高辛标记的探针与靶基因 DNA 链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB 显色。敏感性很高。 可用于膜上杂交和原位杂交。试剂盒内容：1. DIG Random Labeling Mix(高效)， 25l2.BiotinMouse AntiDigo
3、xin 200l 3. SABCPOD 200l4. DAB Stock Solution 5ml5. Blocking Reagent， 5g特点：（1） 标记属高效标记反应。以 1g DNA 探针为例，1 小时反应即可产生 0.8g 标记探针，20小时可产生 2g 左右的标记探针。（2） 试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP 和 Klenow 酶等混合在一起。一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。（3） 标记反应适于下述对象 ：a.DNA 从 10ng3g 。b.不等的 DNA 长度 100bp10kb。c.线形排列或呈高度卷曲之 DNA。d.低融点琼脂中的 DNA。
4、（4） 检测系统抗体为抗地高辛单抗+SABC。抗地高辛单抗标记生物素，效价 1：1000-2000（膜上杂交）或 1：1000（原位杂交）。（5） 显色剂为 DAB，非常稳定。用时 1：40 稀释。（6） 试剂盒敏感性达到 0.1pg，足够检测出 1g 基因组 DNA 中的单个基因。（7） 除用于各种膜上杂交之外，还可用于原位杂交(ISH)。操作程序一 随机引物标记操作程序如下：2用灭菌去离子蒸馏水稀释 1g DNA 至总体积 16l。 DNA 热变性：把 DNA 瓶置于沸水中，水浴 10 分钟。然后，迅速地插入碎冰中 3 分钟以上。加 4l DIG Random Labeling Mix(高
5、效),混匀后再离心 2000/r.p.m5 分钟。置 37反应至少 120 分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至 20 小时可明显增加地高辛标记 DNA 的产量。应根据需要控制反应时间。加入 21 10mM EDTA 以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20保存至少一年以上。且可反复使用。 可根据下表估计标记产量：DNA 模板量 标记一小时 标记二十小时10ng 45ng 600ng30ng 130ng 1050ng100ng 270ng 1500ng300ng 450ng 2000ng1000ng 850ng 2300ng3000ng 1350ng
6、 2650ng二 核酸探针膜上杂交原理和操作（一）杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成 DNA 的一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成 DNA 的二级结构。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使氢键断裂，DNA 双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链，DNA 单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。（二）杂交膜的选择杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高
7、。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液(0.1SSC，0.1%SDS)煮沸 5-10 分钟后去除探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。（三）探针浓度探针浓度是获得理想杂交检测的关键因素，浓度太高则会导致本底太深；若浓度太低又会导致信号减弱。为了解决过高探针浓度所引起的高背景，必须进行模拟杂交实验。所谓模拟杂交实验，即选择几小片杂交膜，在未转移 DNA 的情况下，进行封闭、不同浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被接受的最高探针浓度为正式杂交实验的浓度。模拟杂交实验不 同浓度的探针可以参考下述
8、方法配制：取 5l 标记反应液加 1ml 探针稀释液，混匀。取 0.5ml 等倍释后，再取 0.5ml 继续等倍稀释。假设 20l 标记反应液中含 1g 标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。（四）预杂交和杂交液预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种基本杂交液配方：Standard buffer: 5SSC,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。Standard
9、buffer+50% formamide50% formamide(deionized),5SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02% (w/v)SDS,2% Blocking Reagent。3High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine（五） Southern BlottingDNA 片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975
10、 年 Southern 发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链 DNA 转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操作均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的应用。 Southern 印迹杂交包括两个主要步骤把电泳分级的 DNA 转移到固相支持膜上。与标记的 DNA 探针杂交。1 Southern 转移首先将 DNA 用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。试剂a.0.25M HC1b.变性液：0.5N NaoH,1.5
11、M Nac1c.中和度：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1d.20SSC：0.3M 柠檬酸钠,3M Nac1e.2SSC：0.03M 柠檬酸钠,0.3M Nac1程序：（1 ）将胶浸入 0.25M HC1 中 10 分钟。HC1 处理的作用主要是通过去嘌呤使 DNA 分子断裂，因而有利于高分子量 DNA 的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于 10kb 的 DNA 片段时可省略此步骤。（2 ）进入变性液之前，用蒸馏水漂洗 20-30 分钟。（3 ）把胶浸入变性液中，室温浸泡 15 分钟2 次。（4 ）蒸馏水漂洗凝胶 2 次。（5 ）把胶浸入中和液中，室温泡 15 分钟2
12、 次。（6 ）在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维膜。硝酸纤维膜用 2SSC 浸泡。剪两张 Whatman3#滤纸和一叠吸水用的粗滤纸注意不能用手指直接触及膜面。（7 ）准备转移用平器和支架，平器中放 20SSC。架子上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。（8 ）依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物(500-1000g)注意：要检查 PH 值，用硝纤膜时 PH9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的 DNA 难以被吸到硝酸纤维膜上。（9 ）于室温转移 12-20 小时。 （10 ）取出转移膜，用 2SSC 漂洗数次，以去掉可能粘附于膜上的凝
13、胶。（11 ）固定：可选择下述方法之一进行 DNA 固定紫外线固定：使用长波紫外线照射 10-20 分钟，简单漂洗后干燥备用。 尼龙膜置+120烘烤 30 分钟。硝纤膜置真空烤箱中，80减压烘烤 2-2.5 小时，以避免硝纤膜自熔。若无真空烤箱，亦可在普通烤箱中 65-70烘烤 3-4 小时，也能达到固定目的。 固定后，将膜封于塑料袋中，保存于干燥处待杂交。注意事项 转移液的盐浓度对转移具有一定影响。应选择 20SSC 快。10SSC 转移速度较快，对于高分子量 DNA(10Kb)效果比较理想。因此要根据不同目的选择适当的转移液。 转移时不能移动上边重物，防止出现“重影”现象。4硝酸纤维膜对于
14、 0.5kb 以下的小分子 DNA 结合不牢，转移时容易丢掉。要探测小片时最好用尼龙膜。2 . Southern 印迹杂交杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择 5-25ng/ml ，应通过模拟杂交实验来选择合适的探针浓度。试剂a.Standard bufferb.Standard buffer+50% formamidec.High SDS bufferd.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDSe.Wash Solution :0.5XSSC,0.1%SDS程序将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋
15、中，每边各留 2-4mm 空隙。灌注杂交液的一边留 1cm 空隙。在角上剪开一个小口，灌注预杂交液，从切口处赶走气泡，用封膜机封口，浸入水浴中。根据所选择的不同预杂交液，采用不同的温度预杂交 4-20 小时：Standard buffer:预杂交温度 65-68 ，Standard buffer+50% formamide:37-42，High SDS buffer:37-42。使用双链 DNA 探针时，沸水浴 10 分钟以变性探针。然后迅速插入冰中。按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度 5-25ng/ml 。按每 100cm2 膜加入至少 3.5ml 配制杂交液。使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交 16-20 小时。 杂交结束后，取出杂交袋，剪开一个小口，将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20以备下次使用。这样至少可保存
