单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,,*,1. 诱变机制,诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂,,种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式按照遗传物质结构变化的特点讨论几种有代表性的诱变剂的作用机制1,,（1）碱基置换（substitution）,定义,：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（point mutation）它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换分类：,转换（transition,），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；,,颠换（transversion）,，即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能根据化学诱变剂是,直接,还是,间接,地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论2,,3,,★直接引起置换的诱变剂,定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。
种类：很多例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异羟胺只引起G┇C→A : T，,,其余都是可使G┇C=A : T发生互变的能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有（参见下表）4,,若干诱变剂的作用机制及诱变功能,诱变因素 在DNA上的初级效应 遗传效应,,碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换,,羟 胺 与胞嘧啶起反应 GC→AT的转换,,亚硝酸 A、G、C的氧化脱氨作用 AT=GC双向转换,,交 联 缺失,,烷化剂 烷化碱基（主要是G） AT=GC双向转换,,烷化磷酸基团 AT→TA的颠换,,丧失烷化的嘌呤 GC→CG的颠换,,糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）,,丫啶类 碱基之间的相互作用（双链变形） 码组移动（＋或－）,,紫外线 形成嘧啶的水合物 GC→AT转换,,形成嘧啶的二聚体 码组移动（＋或－） 交 联,,电离辐射 碱基的羟基化核降解 AT=GC双向转换,,DNA降解 码组移动（＋或－）,,糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）,,丧失嘌呤 加热 C脱氨基 CG→TA转换,,Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动,5,,亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。
HNO,2,,胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）,,,HNO,2,,腺嘌呤（A） 次黄嘌呤（,H）,,,HNO,2,,鸟嘌呤（,G） 黄嘌呤（X）,,这些反应及形成物均可在,DNA,复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换碱基转换的分子机制——以亚硝酸为例,6,,7,,腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（,H）后引起的转换过程：,①腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（,He）,,② He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK）,,③DNA,复制时，,HK,与胞嘧啶（,C）,配对,,④,DNA,第二次复制时，,C,与,G,正常配对，实现了转换8,,亚硝酸引起的AT-GC转换细节,9,,这类诱变剂主要是一些,碱基类似物,,,如：5-,溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5—,AU）、,叠氮胸腺嘧啶（AIT）等,等,；,,,作用方式,：,通过活细胞的代谢活动参入到,DNA,分子中，主要是在,DNA复制时碱基类似物插入DNA中，,引起碱基对配对错误，造成碱基置换以,5-,溴尿嘧啶(5-BU)为例：,5-BU是胸腺嘧啶（,T）的,,的,类似物,，酮式的,5-BU可以和,A,配对，烯醇式的5-BU,,可以和,G,配对，在,DNA,分子复制的过程中，由于5-BU的插入和互变异构导致碱基置换。
★间接引起置换的诱变剂,10,,5-BU引起的转换,11,,5-BU引起的转换,从上图中，还可以看到5-BU的掺入引起的G┇C回复到A,׃,T,的过程通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了也可以知道，为什么像5-,BU,这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的,DNA,分子却不起作用12,,13,,（2）移码突变,frame-shift mutation 或 phase-shift mutation，指诱变剂使DNA分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变由移码突变所产生的突变株，称为,移码突变株,（frame-shift mutant）与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和α-氨基丫啶等，以及一系列称为ICR类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂14,,图8-14——能诱发移码突变的几种代表性化合物,引起移码突变的诱变剂：主要是吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等等。
这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤—嘧啶对十分相似15,,丫啶类化合物的诱变机制：,至今还不很清楚有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个,嘌呤–嘧啶,对,十分相似，故能,嵌入,两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变16,,丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：,17,,18,,（3）染色体畸变（chromosomal aberration）,某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）——染色体畸变，它包括：,,染色体结构上的变化：,,缺失（deletion）,,重复（duplication）,,易位（translocation）,,倒位（inversion）,,染色体数目的变化,19,,★染色体结构上的变化,分为染色体内畸变和染色体间畸变两类染色体内畸变,：只涉及一条染色体上的变化，,,如发生染色体的部分,缺失,或,重复,时，其结果可造成基因的减少或增加；,,如发生,倒位,或,易位,时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。
倒位,--------是指断裂下来的一段染色体旋转180,,后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反；,,易位,--------是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上染色体间畸变,：指非同源染色体间的,易位,20,,染色体畸变,21,,转座因子,（transposible element）,由40年代B. McClintock对的遗传研究而发现染色体易位，自1967年以来，已在微生物和其它生物中得到普遍证实，并已成为分子遗传学研究中的一个热点旧概念,：,基因是固定在染色体DNA上的一些不可移动的核苷酸片段新发现,：,有些DNA片段不但可在染色体上移动，还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还从一个细胞转移到另一个细胞在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生转座因子（transposible element）,：,在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序也称作,跳跃基因（jumping gene）,或,可移动基因（movable gene）。
22,,转座因子的种类（1）,插入序列（IS，insertion sequence）,：特点是分子量最小（仅0.7~1.4kb），只能引起转座（transposition）效应而不含其它基因可以在染色体、F因子等质粒上发现它们已知的IS有5种，即 IS1、IS2、IS3、IS4和IS5E . coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通过这些同源序列间的重组，就可使 F因子插入到E . coli的核染色体组上，从而使后者成为Hfr菌株因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同IS引起的突变可以回复，其原因可能是IS被切离，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变23,,转座因子的种类（2）,转座子（Tn，transposon，又称转位子，易位子）,：IS和Mu噬菌体相比，Tn的分子量是居中的（一般为2~25kb）它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入。
24,,转座因子的种类（3）,Mu噬菌体（即 mutator phage，诱变噬菌体）,：它是E . coli的一种温和噬菌体与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，Mu噬菌体并没有一定的整合位置与以上的IS和Tn两种转座因子相比，Mu噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20多个基因Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变25,,2.自发突变机制,自发突变,是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变几种自发突变的可能机制,,★微生物自身有害代谢产物的诱变效应,：,,过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物它对Neurospora（脉孢菌）有诱变作用，这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂KCN，则又可提高突变率这就说明，过氧化氢很可能是“自发突变”中一种内源性诱变剂在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因26,,★互变异构效应：,碱基T、G的第六位上是酮基，会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现,,C、A的第六位上是氨基，会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现,,平衡一般趋向于酮式或氨基式，在DNA双链结构中一般总是以A︰T和G┇C碱基配对的形式出现,,在偶然情况下，在DNA复制到达这一位置的瞬间，在T以稀有的烯醇式出现时，其相对位置上就出现G,,同样，如果C以稀有的亚氨基形式出现在DNA复制到达这一位置的瞬间，则在新合成DNA单链中与C相对应的位置上就将是A。
这可能就是发生相应的自发突变的原因要预言在某一时间、某一基因发生自发突变是不可能的在运用数学方法对这些偶然事件做大量统计分析后，可以发现并掌握其中的规律例如，据统计，碱基对发生自发突变的几率约为10,–,8,~ 10,–,9,27,,★环出效应,：,即环状突出效应有人提出，在DNA的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变下图就是环出效应的设想机制在上链中，标记B处发生“环出”，故只有A及C能获得复制， 从而发生自发突变而在下链中，复制仍正常进行,28,,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,已知的DNA损伤类型很多，机体对其修复的方式也各异发现较早和研究得较深入的是紫外线（U.V.，ultraviolet ray）的作用嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除紫外线的主要作用是使,同链,DNA的相邻嘧啶,间,形成共价结合的,胸腺嘧啶二聚体,二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡在,互补双链间,形成嘧啶二聚体的机会较少。
但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡29,,30,,光复活作用,（photoreactivation）,定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用这一现象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomyces griseus（灰色链霉菌）中发现的后来，在许多微生物中都得到了证实最明显的是在E.coli的实验中：,,对照：8×10,6,个/ml E.coli,U.V.,100个/ml E.coli,,试验：8×10,6,个/ml E.coli,U.V. 360~490nm,2×10,6,个/ml E.coli,,,可见光，30分,,经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种,光激活酶（photoreactivating enzyme）,即光裂合酶（photolyase）结合，当形成的复合物暴露在可见光（300~500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能每一E.coli细胞中约含有25个光激活酶分子。
由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液31,,图:光复活作用,32,,暗修复作用,（dark repair）,又称切除修复（excision repair）是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、X射线和γ射线等）损伤后的DNA的机制这种修复作用与光无关有四种酶参与——①,内切核酸酶,在胸腺嘧啶二聚体的5’一侧切开一个3’-OH和5’-P的单链缺口；②,外切核酸酶,从5’-P至3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；③,DNA聚合酶,以DNA的另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-OH端起逐个延长，重新合成一段缺失的DNA链；④通过,连接酶,的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH末端与原链的5’-P末端相连接，从而完成了修复作用33,,暗修复作用,（dark repair）,1、由,核酸内切酶,切开二聚体的5’末端，形成3’-,OH,和5’-,P,的单链缺口,,2、,核酸外切酶,从5’-,P,到3’-,OH,方向切除二聚体，并扩大缺口3、,DNA,聚合酶,以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-,OH,端起合成缺失片段。
4、,连接酶,将新合成的3’-,OH,与原有的5’-,P,相连接34,,35,,紫外诱变方法:,设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等，,,紫外灯：波长为253、7,nm,,功率是15,W,,处理时的照射距离：20,cm — 30cm,,样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3,mm,,照射时，要用磁力搅拌器搅拌处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量36,,由于微生物接受的照射剂量与灯的功率、照射距离、照射时间、菌液浓度、菌液厚度、细胞本身特性等因素有关，所以单纯用时间表示照射剂量并不完全可靠一定的死亡率必定对应一定的照射剂量，所以，在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量生产上经常采用的剂量：,,死亡率为70%——80%左右37,,重组修复：,必须在,DNA,复制的情况下进行，所以又叫复制后修复细胞在不切除二聚体的情况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，但在每个二聚体附近留有一空隙通过染色体交换，空隙部位就不在面对着,胸腺嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种条件下，,DNA,聚合酶和连接酶起作用将空隙部位进行修复，,,重组修复中的,DNA,损伤并没有去除，但随着微生物的传代繁殖，损伤的比例逐渐降低。