单击此处编辑母版标题样式,,,,*,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,,酶的生物改造,——,酶的定向进化研究进展,介 绍 提 纲,定向进化技术概述,,,定向进化技术的应用,,,定向进化的方法,1,、,酶分子改造的方法,基于序列的理性设计：,化学修饰和定点突变,,,利用已知酶分子的特征、空间结构、结构和功能之间关系，以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造；,,利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：,定向进化,,,不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因，并定向筛选出所需突变酶；,,,,一、定向进化概述,实例：木糖异构酶的定点突变改造,实例：木糖异构酶的定点突变改造,突变前蛋白与木糖复合物模型 突变后蛋白与木糖复合物模型,,,,氨基酸残基与木糖之间距离比突变前下降，不利于体积更大的葡萄糖底物，易于结合底物木糖，对木糖活性提高,,2,、生物自然进化的局限性,自然进化过程：,,突变→自然选择→遗传后代,,自然进化结果：,,生物多样性,,基因多样性：为完成同一功能所表现出的,,多个基因或同一个基因（同源性）,,局限性：,周期长，效率低 ；,,,可控性差；,,,基因工程技术使得人类快速筛选工业菌种成为可能，在几天和数月内即可完成；还可以让人类按照自己的意愿和需要改造菌种，甚至可以产生自然界中原本不存在的全新酶，以适应大工业生产的需要。
哲理上,,,承认了人类对蛋白质的认知的严重不足,;,,---,技术上,,,将大自然已经实践了几亿年的达尔文进化原理应用于试管中,,,以,随机突变与随机杂交,方法来改变蛋白质的性能,,,再辅以筛选来获得优异的变种Frances Arnold, Caltech, 1993),,,3,、酶的定向进化技术,定义：,,,从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人为获得）出发，经过基因突变和重组，构建一个人工突变基因库，通过筛选最终获得预先期望具有某些特性的进化酶；,,,,,,,所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制,(,随机突变、重组和自然选择,),，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶4,、定向进化的原理,在待进化酶基因的,PCR,扩增反应中，利用,Taq DNA,聚合酶不具有,3’->5’,校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶,(,或蛋白质,),，从而排除其他突变体定向进化的基本规则是“,获取你所筛选的突变体,”。
定向进化,=,随机突变,+,选择,前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的,,蛋白质,稳定性,,活性,,有机溶液中的活性,,不同的底物的利用,,酸碱度,,蛋白质的表达,,亲和性,,专一性,1,2,3,4,……,性能,代数,,达到目的,,,,随机突变,,随机杂交,筛选,目标蛋白,酶定向进化的过程和应用范围,二、酶定向进化的应用,酶定向进化的典型例子,枯草杆菌蛋白酶,E,热稳定性的分子进化,β,－内酰胺酶的活性提高了,32,000,倍；,,β,－半乳糖苷酶的底物特异性提高了,1000,倍，且活性提高,66,倍；,,天冬氨酸转氨酶对,β,－支链氧代氨基酸活性提高,10,5,倍且对缬氨酸的催化效率提高,2.1×10,6,倍等定向进化的成功例子,成功的例子,Reetz,等,(1997),将脂酶水解对硝基,-2-,甲基癸酯的对映体选择性提高了,40,倍,,You,和,Arnold (1996),提高了枯草杆菌蛋白酶,E,的表达水平和在有机溶剂中的活性，使酶的总活力提高了,500,倍,,Zhao,和,Arnold,（,1998,）在保持酶活力不变的条件下将枯草杆菌蛋白酶,E,的作用温度提高了,17,度,三、酶定向进化的基本过程,随机突变,,,不同的定向进化方法,,构建突变基因文库,,,载体的选择，基因重组，组建基因文库,,突变基因的筛选,,,平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法,,,,1,、定向进化的方法,无性进化方法：易错,PCR,法，盒式诱变,,有性进化方法,,,1,）,DNA,改组法（,DNA Shuffling),,2,）体外随机重组法（,RPR),,3,）交错延伸法,(StEP),,基因家族的同源重组,,外显子的改组,,杂合进化,,,无性进化：易错,PCR,方法,,无性进化：易错,PCR,方法,,方法：向,单一酶分子基因内,随机引入突变,(,在,PCR,扩增过程中调整反应条件），制造突变酶库以便筛选；,,特点：,遗传变化仅发生在单一分子内部,，,属于无性进化,,改变,4,种底物的浓度比，或降低一种,dNTP,的量（降至,5,％,-10,％）,,,加入,dITP,来代替被减少的,dNTP.,缓冲液中另加,0.5mmol/L Mn,2+,,,提高镁离子浓度（常规,PCR,时浓度为,）；,,,添加一定浓度的锰离子；,,易错,PCR,方法实例,,1993,年，,Chen and Arnold,在非水相,DMF,中，定向进化枯草杆菌蛋白酶,E,活力获得成功，在,60,％和,85,％的,DMF,中，活力分别提高,256,和,131,倍；,,优点,：,操作简便，随机突变丰富,；,,缺点,：正突变概率低，突变基因文库较大，文库筛选工作量大；,,适用范围,：适用于较小基因的定向进化,有性进化：,DNA,改组方法（,1994,，,Stemmer,),有性进化：,DNA,改组方法,方法,：从正突变基因库中分离得到的,DNA,序列用酶随机切割，得到的随机片断经不加引物的多次,PCR,循环，获得全长基因，实现优势突变的组合；,,特点,：遗传变化仅发生在来自,不同基因片断之间的,,重组，所以称为有性进化；,,实例,：对内酰胺酶进行,DNA,改组，,3,次循环得到的进,,化酶对抗生物素头孢噻呜抗性增加,32000,倍；,,优点,：将已有的正突变基因结合，正突变效率高；,,缺点,：无引物,PCR,之前必须把,DNase I,去除干净，以,,防突变基因的被切割；,,,,有性进化：体外随机重组法（,1998,，,Arnold,),能以单链,DNA,为模板，以随机序列引物进行,PCR,反应，再除去模板，互为模板和引物进行装配和扩增,有性进化,:,交错延伸法,（,1997,，,Arnold),将常规的退火和延伸合并成一步，缩短反应时间,基因家族的同源重组,方法,：单一酶分子基因进化过程中集中有利突变速度较慢，从自然存在的基因家族出发，由于基因之间存在显著差异，所得突变库体现了基因多样性和增加了有利突变的概率；,,实例,：,Stemmer,等从,4,种微生物中选择编码头孢菌素的,4,个同源基因，分别进行单独进化和同源重组，结果单独进化抗性提高,8,倍、而同源重组比其中,2,种微生物分别提高,270,和,540,倍；,,,国内海藻糖的酶法制备即采用该方法；,,特点,：由于定向进化的高效性，被认为是,DNA,改组的发展方向；,The Molecular Breeding directed molecular evolution process,,对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较，以一,,定的标准程序计算出各氨基酸序列的共有序列；,,人工合成同序基因后重组表达。
Martin Lehmann,等（,2000,～,2002,）把这种方法应用在真菌植酸酶家族设计合成了同源植酸酶基因，并表达出具热稳定性的同源植酸酶外显子改组,真核基因中外显子编码一个折叠结构域，故内含子（转录后被剪切剩下外显子）间的重组，可使独立外显子组装成编码新蛋白质的基因，可导致蛋白质的快速进化；,,在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一与,DNA,改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而,DNA,改组不受任何限制，发生在整个基因片段上；,杂合进化,,把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的酶杂合体纤维素酶定向进化,2.,基因文库的构建,定义,：通过,DNA,重组技术将随机突变获得的各种突变基因与适宜载体进行重组，获得重组载体；再通过细胞转化等方法将重组载体转入合适的细胞或进行体外包装成为有感染活性的重组,噬菌体，形成突变基因文库载体的选择,：质粒载体,,噬菌体,DNA,载体,:,λ,噬菌体、,M13,噬菌体,,黏粒载体：,人工构建的载体,,噬菌粒载体,,,,,,基因重组,：,,体外通过,DNA,连接酶的作用，将基因与载体,DNA,连接在一起形成重组,DNA,的过程。
重组方法,：黏性末端连接,,平头末端连接,,修饰末端连接,,组装突变基因文库,,将重组,DNA,转入受体细胞或包装成为有感染活性的重组噬菌体的过程组装方法：,重组质粒载体,---,转化（原核和真核）,,重组噬菌体载体,-,包装,,,,,,,,3,、基因突变库的筛选方法,目标,,根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从突变基因文库中得到所需的突变基因难点,,突变库容量大，一般达到,10,6,，工作量巨大,,关键,,高通量筛选：通量大，效率高,,方法,,平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法,平板筛选方法,依据细胞生长情况筛选,,热稳定性：温度梯度和高温环境,,抗生素耐受性：抗生素浓度梯度,,pH,稳定性：,pH,梯度,,极端环境：高盐、低温、高浓毒物质,,平板筛选方法,依据颜色变化筛选,,大肠杆菌,ß-,半乳糖苷酶基因显色：噬菌体,DNA,载体（蓝色）,,反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚,,,脂肪酶筛选,海因酶筛选,平板筛选方法,依据透明圈大小筛选,,淀粉酶的进化：淀粉平板培养基,,豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基,,,荧光筛选方法,利用自身荧光激发特性,,,生成产物本身是具有荧光激发特性的物质,,,利用荧光报告基因,,,辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因：,,原理：萘,→萘酚→醌类化合物（能激发荧光）,,,绿色荧光蛋白基因：获,2008,年诺贝尔化学奖,,,,2008,年诺贝尔化学奖介绍,获奖,,,2008,年度诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科学家马丁,·,沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。
他们三人因为在绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究和应用方面做出的突出贡献将各分得,2008,年度,1,／,3,的诺贝尔化学奖奖金2008,年诺贝尔化学奖介绍,评论,,生物学有些现象只能在打碎细胞以后才能做，所以实际上是从“死物”上来推测生物的情况而下村修、钱永健和马丁,·,沙尔菲发明的用荧光分子标记其他分子的方法，使科学家们能在活细胞、活生物上直接观察一些生物现象所以，可以说是把一些“死物学”变成了真正的“生物学,（北大饶毅）,,绿荧光水母,—,通过体内绿色荧光蛋白发光,科学家形虫体内植入,,绿色荧光蛋白质,绿色荧光蛋白的应用,分子标记：,GFP,标记的微管结构,绿色荧光蛋白的应用,分子标记：,FISH,分析菌株,,（,a,）未加探针；（,b,）,DAPI,染色（,c,）,α-,探针杂交（,d,）,Msint-1268,探针杂交菌株,Y1,；（,e,）,Msint-1268,探针杂交,M. trichosporium,OB3b,,绿色荧光蛋白的应用,药物筛选,绿色荧光蛋白的应用,融合表达：,线粒体中表达的,GFP,绿色荧光蛋白的应用,生物传感器：,GFP,在植物研究中的应用,噬菌体表面展示法,,内涵,,,利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子展示技术,,,特点,,,有效性高，是前景广阔的筛选方法,噬菌体显示筛选模式,噬菌体显示的几种类型,M13,噬菌体,pIII,和,pVIII,的显示,酵母细胞表面展示法,,通过锚定在酵母细胞表面的特点蛋白质与某些外源蛋白质或多肽形成稳定的化合物，使外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分子展示技术。
核糖体显示技术,RNA-,蛋白质融合技术,RNA-,蛋白质的融合,寡霉素与核苷酸的连接,Myc ds-DNA,的富集,实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的,定向进化,,高通量筛选方法的建立,,,,生物信息学技术手段的建立,,,,天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造,,,研究内容及执行情况,,,高通量筛选方法的建立,,,基于酶联免疫分析方法，选用医用检测试剂盒作为检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合使用,96,孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法,建立了改进的可高通量操作的质粒快速检测方法，改进后的质粒快检工作量为原方法的,1/3,左右，可用于高通量筛选和鉴定所构建的基因工程菌生物催化的数据整合和信息分析,峰值运算速度达3000亿次/秒的集群系统,,基因表达,,蛋白质表达,,蛋白质,-DNA,相互作用,,蛋白质,-,蛋白质相互作用,,基因和其他功能相互作用,,蛋白质定位,,网络调节,,功能注解,,,…,生物信息学技术手段的建立,天冬氨酸转氨酶热稳定性改造,,天冬氨酸转氨酶的作用,,－－酶法制备,L,－苯丙氨酸的关键酶,,；,,,L-,苯丙氨酸的主要用途,,,氨基酸输液,,,L-,苯丙氨酸是人体八大必须氨基酸之一，是氨基酸输液的主要成份,；,,甜味剂的合成,,由,L-,苯丙氨酸和,L,－天冬氨酸合成的阿斯巴甜是二十世纪九十年代以来最受关注的非糖型肽类甜味剂，形成了对,L-,苯丙氨酸的强烈需求；,,,,肉桂酸酶法,苯丙酮酸酶法,结构分析软件,Rasmol,,分析酶的三维结构,序列分析软件,Clustal W,分析酶的一维结构,利用生物信息学技术进行酶结构分析,应用,DeepView,（蛋白质结构预测软件）,,确立天冬氨酸转氨酶的热稳定性有关的功能区域,引入随机引物，建立突变基因文库,Compound Library,Unique Compound in Each Well,Assay,Target,Plate Reader,Same Assay and Target in Each Well,Mother Plate,Daughter Plate,Assay Plate,采用高通量筛选的技术 对构建的突变菌库进行筛选,,筛选,得到酶热稳定性提高的,12,株菌株,天冬氨酸转氨酶热稳定性的进化,,未突变前酶的热稳定性,*,热稳定性定义为,55℃,下放置,10min,后酶活性与放置前酶活性的比值,,。