单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,10反胶束萃取,随着基因工程和细胞工程的发展，尽管传统的分离方法(如溶剂萃取技术)已在抗生素等物质的生产中广泛应用，并显示出优良的分离性能，但它却难以应用于蛋白质的提取和分离其主要原因有两个：一是被分离对象蛋白质等在40-50便不稳定，开始变性，而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性；二是萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效因此研究和开发易于工业化的、高效的生化物质分离方法己成为当务之急反胶束萃取法就是在这一背景下发展起来的一种新型分离技术10.1 反胶束溶液形成的条件和特性,优点,：从所得结果来看，反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点此外，反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质(胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶可见，反胶束萃取技术为蛋白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径。
反胶束溶液的概念：,反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统反胶束(,reversed micelle),是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体，所以,表面活性剂,是反胶束溶液形成的关键,10.1.1 表面活性剂,表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶束常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见表10.1在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂,AOT(AerosolOT)，,其化学名为丁二酸2乙基己基磺酸钠，结构式见图,这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170,nm，,有利于大分子蛋白质进入常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下：,(1),CTAB(cetyl-methyl-ammonium bromide),溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴,(2),DDAB(didodecyldimethyl ammonium bromide),溴化十二烷基二甲铵,(3,)TOMAC(triomethyl-ammonium chloride),氯化三辛基甲铵,将阳离子表面活性剂如,CTAB,溶于有机溶剂形成反胶束时，与,AOT,不同，还需加入一定量的助溶剂(助表面活性剂)。
这是因为它们在结构上的差异造成的临界胶束浓度,(,Critical Micelle Concentration CMC),临界胶束浓度,是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用,CMC,来表示，这是体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关CMC,的数值可通过测定各种物理性质的突变(如表面张力、渗透压等)来确定由于实验方法不同，所得的,CMC,值往往难于完全一致，但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用,CMC,范围来表示更为方便10.1.3,胶束与反放束的形成,将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(,CMC,),时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束(,normal micelle,)结构示意见图,a,在胶束中，表面活性剂的排列方向是极性基团在外，与,水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心、在此核心可以溶解非极性物质若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度(,CMC,)，,便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束，其结构示意见图,b,在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核(,po1ar core,)。
此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池”(,water pool,)当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活蛋白质的溶解过程和溶解后的情况示意于图中b,a,c,反胶团的大小与溶剂和表面活性剂的种类与浓度、温度、离子强度等因素有关，一般为,520,nm,，,其内水池的直径,d,用下式计算,d=,6W,0,M,surf,N,W,0,有机相中水与表面活性剂的摩尔比，称为含水率（,water content）,M，,分别为水的相对分子质量和密度,surf,界面处一个表面活性剂分子的面积,N,阿佛加德罗常数,常用于制备反胶团溶液的表面活性剂是二(2乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠，,AOT,在异辛烷中形成的反胶团直径(,d,),可用下述经验式推算,d=0.3W,0,+0.24 (nm),式中右侧第一项为反胶团的水核直径，第二项(,2.4,nm,),为,AOT,分子长度的二倍一般反胶团的,W,0,不超过40因此，,AOT,形成的反胶团水核直径一般不超过,l 2nm，,其中大致可容纳一个直径为,510,nm,的蛋白质。
当蛋白质分子与反胶团直径相比大得多时(例如，当相对分子质量超过,100200,kD,)，,难于溶解到反胶团中当反胶团的含水率,W,0,较低时，反胶团水池内水的理化性质与正常水相差悬殊例如，以,AOT,为表面活性剂，当,W,0,6-8,时，反胶团内微水相的水分子受表面活性剂亲水基团的强烈束缚，表观粘度上升50倍，疏水性也极高随,W,0,的增大，这些现象逐渐减弱，当,W,0,16,时，微水相的水与正常的水接近，反胶团内可形成双电层但即使当,W,0,值很大时，水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同，特别是在接近表面活性剂亲水头的区域内10.1.4,反胶团的溶解作用,由于反胶团内存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境因此，反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子关于反胶团溶解蛋白质的形式，有人提出了四种模型，如图所示,其中,(,a),为水壳模型，蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁(表面活性剂)隔开；,(,b),蛋白质分子表面存在强烈疏水区域，该疏水区域直接与有机相接触；,(,c),蛋白质吸附于反胶团内壁；,(,d),蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。
表面性质不同的蛋白质可能以不同的形式溶解于反胶团相,，,但对于亲水性蛋白质，目前普遍接受的是水壳模型因为许多实验数据均间接地证明了水壳模型的正确性例如：,(1),反胶团内酶的结构和活性与,W,0,值密切相关，说明酶对其周围存在的水层非常敏感；,(2),反胶团内酶反应动力学行为与在正常的水相中相似，活性与,pH,的关系同样表现为钟状曲线b,c,d,a,反胶团的溶解作用,10.2,反胶束萃取蛋白质的基本原理,三元相图及萃取蛋白质,对一个由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系统，存在有多种共存相，可用三元相图表示，图是水,AOT,异辛烷系统的相图示例，从图中可知，能用于蛋白质分离的仅是位于底部的两相区，在此区内的三元混合物分为平衡的两相：一相是含有极少量有机溶剂和表面活性剂的水相；另一相是作为萃取剂的反胶束溶液这共存的两相组成，用系线(图中虚线)相连这一体系的物理化学性质非常适合于萃取操作，因为界面张力在,0.12mN/m,范围内，密度差为,10-20,，反胶束溶液粘度适中，大约为,1,mPas,这一数量级蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏观两相(有机相和水相)界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生,静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而实现了蛋白质的萃取，其萃取过程和萃取后的情况见图，改变水相条件(如,pH,值和离子种类及其强度等)又可使蛋白质由有机相重新返回水相实现反萃取过程。
水,AOT,异辛烷系统相图,反胶束萃取蛋白质的示意团,蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与分配特性,蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包括表面活性剂与蛋白质的静电作用力和位阻效应1)静电作用力：,在反胶束萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电的分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的一种推动力其中一个最直接的因素是,pH,值，它决定了蛋白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷当,pHpI,时，蛋白质呈电中性；,pHpI,时，蛋白质带正电荷；,pHpI,时，蛋白质带负电荷，即随着,pH,的改变，被萃取蛋白质所带电荷的符号和多少是不同的因此，如果静电作用是蛋白质增溶过程的主要推动力，对于阳离子表面活性剂形成的反胶束体系，萃取只发生在水溶液的,pHpI,时，此时蛋白质与表面活性剂极性头间相互吸引，而,pHpI,时，静电排斥将抑制蛋白质的萃取，对于,推动力,阴离子表面活性剂形成的反胶束体系，情况正好相反此外，离子型表面活性剂的反离子并不都固定在反胶束表面，对于,AOT,反胶束，约有,30,的反离子处于解离状态，同时，在反胶束“水池”内的离子和主体水相中的离子会进行交换，这样，在萃取时会同蛋白质分子竞争表面活性剂离子，从而降低了蛋白质和表面活性剂的静电作用力。
另一种解释则认为离子强度(盐浓度)影响蛋白质与表面活性剂极性头之间的静电作用力是由于离解的反离子在表面活性剂极性头附近建立了双电层，称为德拜屏蔽，从而缩短了静电吸引力的作用范圈，抑制了蛋白质的萃取，因此在萃取时要尽量避免后者的影响2)位阻效应,许多亲水性物质，如蛋白质、核酸及氨基酸等，都可以通过溶入反胶束“水池”来达到它们溶于非水溶剂中的目的，但是反胶束“水池”的物理性(大小、,形状等)及其中水的活度是可以用,W,0,的变化来调节的，并且会影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，达到选择性萃取的目的，这就是所谓的位阻效应反胶束萃取中蛋白质的分配特性,蛋白质在两相间的分配系数,反胶束浓度,M,与表面活性剂浓度,S,surf,的关系为,M=,S,surf,/N(N,为聚焦数),反胶束萃取蛋白质的动力学,萃取过程中，蛋白质在互不相溶的两相间的传递可分为三步：蛋白质从水溶液主体扩散到界面；在界面形成包容蛋白质的反胶束；含有蛋白质的反胶束在有机相中扩散离开界面反萃取过程则相反，含有蛋白质的反胶束从有机相主体扩散到界面；包容蛋白质的反胶束在界面崩裂；蛋白质从界面扩散到水溶液主体蛋白质进入或离开反胶束相的传递通量可用下式计算：,萃取过程,反萃取过程,10.3 影响反胶束萃取蛋白质的主要因素,上式,上式,蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关，所以，任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。
影响反胶束萃取蛋白质的主要因素，见下表，只要通过对这些因素进行系统的研究，确定最佳操作条件，就可得到合适的目标蛋白质萃取率，从而达到分离纯化的目的水相,pH,值对萃取的影响,水相的,pH,值决定了蛋白质表面电荷的状态、从而对萃取过程造成影响只有当反胶束内表面电荷，也就是表面活性剂极性基团所带的电荷与蛋白质表面电荷相反时，两者产生静电引力，蛋白质才有可能进入反胶束故,对于阳离子表面活性剂、溶液的,pH,值需高于蛋白质的,pI,值，反胶束萃取才能进行；对于阴离子表面活性剂，当,pHpI,时，萃取率几乎为零，当,pHpI,时，萃取率急剧提高，这表明蛋白质所带的净电荷与表面活性剂极性头所带电荷符号相反，两者的静电作用对萃取蛋白质有利，如果,pH,值很低，在界面上会产生白色絮凝物，并且萃取率也降低这种情况可认为是蛋白质变性之故水相,pH,值对几种相对分子质量较小的蛋白质。