单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,,*,,,,,,,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,,*,第十章 免疫细胞的分离和功能检测,,1,第十章 免疫细胞的分离和功能检测 1,目 录,,第一节,吞噬细胞的分离和收集,,第二节,外周血单个核细胞的分离和纯化,,第三节,淋巴细胞及其亚群的分离,,2,目 录 第一节 吞噬细胞的分离和收集2,免疫细胞的分离及检测,※,检测,:,各类免疫细胞及其亚群的数量和,功能测定,※,方法：,体外法为主,※,目的：,判断机体免疫状态,※,意义：,探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效,免疫细胞的分离,是指将各种参与免疫反应的,细胞从血液或组织中分离出来,3,免疫细胞的分离及检测※检测:各类免疫细胞及其亚群的数量和功能,免疫细胞种类,4,免疫细胞种类4,,﹡,大吞噬细胞,:,即单核,-,吞噬细胞系统,,,﹡,小吞噬细胞,:,即中性粒细胞,第一节 吞噬细胞的分离和收集,吞噬细胞的种类,5,﹡大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统第一节 吞噬细胞的,特征性标志,CD14,分离技术,Pecoll,密度梯度分离法,流式细胞仪分离技术,免疫磁珠分离法,:,为目前较常用的方法,黏附法,一、吞噬细胞的分离,（一）单核细胞的分离,6,特征性标志 CD14一、吞噬细胞的分离（一）单核细胞的分离,免疫磁珠分离法,,7,免疫磁珠分离法 7,☆,斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞,,☆,动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取,（二）巨噬细胞的分离,8,☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 （二）巨噬细胞的分离8,聚合物加速沉降法,可从外周血中分离出白细胞,RBC,血浆,(,抗凝血,),,WBC,RBC,,Ficoll,分离法,可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞,（三）中性粒细胞的分离,9,聚合物加速沉降法RBC血浆(抗凝血)WBCRBC Ficol,Ficoll-Hypaque,密度梯度离心分离中性粒细胞,10,Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞10,吞噬细胞的吞噬活动大体分为,趋化,、,吞噬,和,胞内杀灭,作用三个阶段,,,据此建立相应的检测方法。
一）中性粒细胞功能检测技术,（二）巨噬细胞功能检测技术,二、相关功能检测,11,吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段,,细胞趋化功能的检测,吞噬功能的检测,杀菌功能的检测,（一）中性粒细胞功能检测,12,细胞趋化功能的检测（一）中性粒细胞功能检测12,体内试验法,:,皮肤窗法,体外试验法：滤膜渗透法,琼脂糖平板法,趋化功能检测,——,检测细胞运动功能,皮肤窗法 在,受检者前臂屈侧中央,3㎜,范围内,,,搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第,2,，,5,，,8,，,12,，,24,，,36,小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等健康正常人一般,2,～,3h,后开始聚集，达,50,～,100,个，,6,小时可达,1000,个以上,13,体内试验法:皮肤窗法趋化功能检测——检测细胞运动功能皮肤窗法,,原理及技术要点,,在一特制的分上下两层的小盒,,,将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，,37℃,温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。
滤膜渗透法,14,原理及技术要点滤膜渗透法14,原理及技术要点,,在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液,,,左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育,4,～,8,小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离,A,和向右孔的移动距离,B,，计算趋化指数趋化指数,= A/B,趋化指数越大,,,表明中性粒细胞运动功能越强,,琼脂糖平板法,15,原理及技术要点趋化指数= A/B琼脂糖平板法15,显微镜检查法,,,,吞噬指数,=,（一）中性粒细胞吞噬功能检测,16,显微镜检查法吞噬指数=（一）中性粒细胞吞噬功能检测16,NBT,还原试验,,,,,,,,,,原理,:,N-N-,C + H,+,N=N-R-,N-NH,2,C,N=NH,四氮唑基（淡黄色）,甲,chan,（紫黑色）,杀菌功能检测,17,NBT还原试验原理:N-N-N-NH2四氮唑基（淡黄色）甲c,,方法,:,,1.,抗凝血,+,硝基蓝四氮唑（,NBT,）,,37,℃孵育,25min,2.,推片染色、镜检正常值,:,NBT,阳性细胞率应≥,95%,NBT,还原试验,18,方法:1.抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT）,37℃孵,炭粒廓清试验,,正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除,90,％炭粒,,,脾巨噬细胞约吞噬清除,10,％炭粒。
据此给小鼠静脉注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能二）巨噬细胞功能检测,19,炭粒廓清试验 （二）巨噬细胞功能检测19,Mф +CRBC,孵育,涂片、染色、镜检,计算、吞噬率、吞噬指数,吞噬率＝（吞噬,CRBC,的,Mф,,数,/,计数的,Mф,,数）,×100,％,吞噬指数,＝,Mф,吞噬的,CRBC,总数,/,计数的,Mф,,数,吞噬功能检测,返回章目录,20,Mф +CRBC孵育涂片、染色、镜检计算、吞噬率、吞噬指数吞,PBMC,包括,:,淋巴细胞、单核细胞,各种血细胞比重不同,,,利用密度梯度离心进行分离,常用分层液：,ficoll,－,hypaque,,,percoll,,第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化,21,PBMC包括:淋巴细胞、单核细胞第二节 外周血单个核细胞的,细胞,,比重,,血小板,,1.030~1.035,,PBMC,,1.075~1.090,,多核白细胞,,1.092,,红细胞,,1.093,,,外周血各细胞成分的密度,22,细胞比重血小板1.030~1.035PBMC1.075~1.,,Ficoll,分离液法,是一种单次差速密度梯度离心的分离法,,,主要用于分离外周血中的单个核细胞。
原理,:,Ficoll,分层液：密度,1.077±0.001,离心：密度梯度离心,分离：各类细胞按其相应密度重新分布,,一、,Ficoll,分离法,23,Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心,Ficoll,分层液分离单个核细胞示意图,24,Ficoll分层液分离单个核细胞示意图24,78,％,98,％,Percoll,分离单个核细胞示意图,返回章目录,25,78％98％Percoll分离单个核细胞示意图返回章目录25,﹡,红细胞的去除,:,低渗裂解法、氯化铵裂解法,﹡,血小板的去除 ：胎牛血清梯度离心法,﹡,单核细胞的去除：黏附法,羰基铁吞噬法（磁铁吸引法）,苯丙氨酸甲酯去除法,,第三节 淋巴细胞及其亚群的分离,一、淋巴细胞的纯化,26,﹡红细胞的去除:低渗裂解法、氯化铵裂解法 第三节 淋巴细胞,免疫磁珠分离法,流式细胞术分离法,其他方法,,二、淋巴细胞亚群的分离,27,免疫磁珠分离法二、淋巴细胞亚群的分离27,,原理,,,将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克隆抗体与磁珠结合形成,免疫磁珠（,IMB,）,,,当特异性单克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁场可以将,IMB,所结合细胞与其他细胞分离。
包被磁珠的抗体可以是第一抗体或第二抗体免疫磁珠分离法,28,原理 免疫磁珠分离法28,免疫磁珠分离法,29,免疫磁珠分离法29,,488 nm,激光,,,,,,,,,,+,-,,,,,,,,,,,,,,,,,,前向散射光,检测器,,荧光检测器,电磁场,单个细胞被分类,进入检测管,流式细胞术分离原理示意图,30,488 nm 激光+-前向散射光荧光检测器电磁场单个细胞被分,E,花环沉降法,31,E花环沉降法31,T,细胞功能检测,B,细胞功能检测,NK,细胞功能检测,三、相关功能检测,32,T细胞功能检测三、相关功能检测32,T,细胞增殖试验,T,细胞介导的细胞毒试验,MHC-,肽四聚体技术,淋巴细胞内细胞因子检测,T,细胞功能检测,33,T细胞增殖试验T细胞功能检测33,淋巴细胞,DNA,合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,T,淋巴细胞增殖试验,34,淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大T淋巴细胞增殖试验,非特异性刺激物,:,,PHA ------ T,细胞,,ConA ------ T,细胞,,PWM ------ T,、,B,细胞,,LPS ------ B,细胞,特异性刺激物：,异种抗原,同种组织抗原,淋巴细胞转化的刺激物,35,非特异性刺激物:淋巴细胞转化的刺激物35,形态学检查法,3H-TdR,掺入法,MTT,比色法,淋巴细胞转化的检测方法,36,形态学检查法 淋巴细胞转化的检测方法36,形态学检查法,37,形态学检查法37,,,转化的淋巴细胞,未转化的淋巴细胞,淋巴母细胞 过渡型,细胞大小,(,直径,μm),12,～,20,12,～,16,6,～,8,核大小、染色质,增大、疏松,增大、疏松,不增大、密集,核仁,清晰、,1,～,4,个,有或无,无,有丝分裂,有或无,无,无,胞质、着色,增多、嗜碱,增多、嗜碱,极少、天青色,浆内空泡,有或无,有或无,无,伪足,有或无,有或无,无,未转化和转化淋巴细胞的形态特征,38,转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞,原理,:,刺激物,37,℃,56h,G,1,期→,S,1,期,,合成,DNA,↑,,3,H-TdR,37,℃,16h,DNA,-,3,H-TdR,测淋巴细胞内放射量（,cpm,）,计算,SI,判断淋巴细胞转化程度,外周血（,T,）,G,0,期,3H-TdR,掺入法,39,原理:刺激物37℃56hG1期→ S1期 合成DNA↑ 3H,评价,:,该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作,;,设备昂贵、放射污染,。
刺激指数（,stimulating index,SI,）,,SI=,试验管,cpm,均值,/,对照管,cpm,均值,,3H-TdR,掺入法,40,评价:该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作;设备昂,原理,:,外周血,T,细胞,,PHA,发生增殖,,MTT,含蓝色甲颗粒,,的,T,细胞,,MTT,,PHA,,有机溶剂,测吸光度（,A,）值,,计算,SI,判定细胞增殖结果,SI=,(SI≧2,具有意义,),,MTT,比色法,41,原理:外周血T细胞 PHA发生增殖 MTT含蓝色甲颗粒,原理,:,靶细胞抗原,T,细胞,观察杀伤活力,致敏,CTL,靶细胞,（三）,T,细胞介导的细胞毒试验,42,原理:靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞（三）T细,试验方法,:,同位素法,,淋巴细胞（,CTL,）,+,含,51Cr,的肿瘤细胞,肿瘤细胞破坏,51Cr,释放 测定,γ,射线,51Cr,特异释放率,=,,×100%,（三）,T,细胞介导的细胞毒试验,43,试验方法: 同位素法 51Cr特异,（三）,T,细胞介导的细胞毒试验,背景无效应细胞,效应细胞,/,靶细胞,1:1,效应细胞,/,靶细胞,5:1,效应细胞,/,靶细胞,20:1,细胞溶解,44,（三）T细胞介导的细胞毒试验背景无效应细胞效应细胞/靶细胞,MHC-,肽四聚体技术,原理,,根据,T,细胞活化的双识别原理,,,用生物工程技术将,MHC,分子在体外组装，并结合抗原表位肽，形成抗原肽,-MHC,分子复合物，结合流式细胞仪定量检测抗原特异性,T,细胞。
T,,,,,45,MHC-肽四聚体技术原理 根据T细胞活化的双识别原理,用,技术要点,:,,1.,在体外将特异性抗原肽段、可溶性,MHCI,类分子重链及,β,2,微球蛋白正确折叠,,,形成,MHC-,抗原肽复合物，并纯化该复合物2.,用生物素标记,MHC-,抗原肽复合物3.,生物素标记的,MHC-,抗原肽复合物与荧光标记的亲和素以,4: 1,的比例相混合，即得到荧光标记的四聚体,MHC,-,肽四聚体技术,46,技术要点 : MHC-肽四聚体技术46,MHC-,肽四聚体技术,47,MHC-肽四聚体技术47,原理,:,用刺激剂体外激活淋巴细胞,,,用蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定,TH1/ TH2,细胞的百分率淋巴细胞内细胞因子检测,48,原理:淋巴细胞内细胞因子检测48,分泌的细胞因子,Thl Th2,,,IL-2 ++ -,IFN-γ ++ -,TNF-β ++ ++,IL-3 + ++,GM-CSF + ++,TNF-α - ++,IL-4 - ++,IL-5 - ++,IL-6 - ++,IL-10 - ++,,Thl,和,Th2,分泌的细胞因子,49,分泌的细胞因子 Thl Th2,特异性抗原皮肤试验,,PHA,皮肤试验,体内试验,50,特异性抗原皮肤试验体内试验50,溶血空斑试验,酶联免疫斑点试验,体内试验,,B,细胞功能检测,51,溶血空斑试验B细胞功能检测51,溶血空斑试验,溶血斑,补体,抗血清包被,绵羊红细胞,52,溶血空斑试验溶血斑补体抗血清包被52,酶联免疫斑点法,抗体产生,B,细胞,抗原包被,酶联抗抗体,凝胶底物,显色,53,酶联免疫斑点法抗体产生抗原包被酶联抗抗体凝胶底物53,刺激体内抗体产生的特异性抗原有,白喉类毒素,、,破伤风类毒素,、,多价肺炎链球菌,等。
将适量抗原皮下或肌肉注射免疫,,,并于免疫前及免疫后,1,周、,2,周、,3,周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内,B,细胞的功能体内试验,54,刺激体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价,染色计数,离心取上清,测,LDH,或,AKP,测发光强度,测,CPM,值,形态法,酶释法,放射性核素释放法,流式细胞术,靶细胞溶解,常用靶细胞,: K562,细胞株,NK,细胞活性检测,返回章目录,55,染色计数离心取上清测发光强度测CPM值形态法靶细胞溶解常用靶,谢 谢！,56,谢 谢！56,。