现代生物学方法论,吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室,核酸技术,盛永杰,核酸技术-用来研究核酸（DNA和RNA）的技术,纯化,定量,重量上的丰度：光谱定量,数量上的绝对丰度：定量PCR,高通量相对丰度：DNA芯片,高通量绝对丰度：序列分析基因表达（SAGE）,分子量大小：凝胶电泳,合成,从头合成：寡聚核苷酸的合成,基因扩增：PCR反应,概述,其他核酸技术,测序,基因的表达与克隆,印记杂交（Southern与Northern）,生物芯片,荧光原位杂交,启动子技术,SELEX技术,反义技术,RNAi技术,非编码RNA,核酸的生物信息学,概述,一、反义技术,反义技术的概念,反义技术的分子机制,反义核酸的设计及注意事项,核酶,脱氧核酶,1.1 反义技术概述（antisense technology),反义技术是根据核酸杂交原理特异性抑制特定基因,(mRNA)表达的一种生物技术，包括反义RNA、反义,DNA、核酶以及脱氧核酶概念,1.1.2 反义技术的主要应用方向：,1 通过抑制基因表达活性研究特定基因在生理、病理条件,下的生物学功能2 研究和开发以疾病相关基因为靶的反义药物,反义药物-利用反义技术研制的药物，以特异的基因为靶，,并与之特异性互补结合的一段约20个核苷酸组成的人工合成,的寡核苷酸。
1998年FDA批准了第一个反义药物Vitravene,(巨细胞病毒性视网膜炎）,1.2 反义技术分子机制的模型,1）仅由结合介导的机制,反义核酸与特定的序列结合，从而抑制该RNA与蛋白、,其他核酸或其他因子的相互作用，最终影响RNA的,代谢与功能2）结合激活不稳定的机制通过反义结合，影响RNA的稳定性、RNA加工、亚细胞定位,和转运等3）其他机制,1.2.1 机制,1.2.2 影响反义核酸生物学活性的因素：,反义核酸浓度,靶,RNA,浓度,靶,RNA,代谢速率,抑制机制的类型和效率等,1.2.3 反义技术需要注意的问题,反义核酸的纯度,反义核酸的结构,靶,RNA,结构,反义核酸在组织和细胞内的转运和分布,反义核酸与非核酸因子的结合及其影响,不同抑制机制的作用,能够有效起抑制作用的反义核苷酸特性：,DNA,序列的特异性和唯一性,导入细胞的高效性,无非特异性结合蛋白,反义寡核苷酸,mRNA,特异形成杂交体,靶蛋白或靶,mRNA,水平下降,反义寡核苷酸无毒性,反义寡核苷酸不引起炎症反应或免疫反应,1 靶目标的选择尽量避免易突变区,一般选择目标为起始密码子（AUG)或其附近的,15-25个碱基序列，以及该靶mRNA的5帽区，,3非翻译区,2 长度,反义核苷酸一般是15-20bp长的单链，但是设计病毒,和质粒载体可用较长的或全长DNA序列。
3 反义核苷酸的修饰,4 缺陷的避免,避免回文结构以形成二聚体，,GC含量不能太高避免产生高毒性和非特异性，GC,含量高的序列可用硫代磷酸型寡聚体1.3 反义核苷酸设计原则：,1.4 核酶,（Ribozyme,catalytic RNA,RNA enzyme、RNAzyme）,具有催化活性的RNA分子,核酶的发现,1981年,Cech发现四膜虫前体rRNA可以在没有蛋白质,存在的情况下自身催化切除内含子，完成加,工过程1983年,Altman在研究RNaseP时发现，该酶中的RNA,分子单独完成前体tRNA加工1989年,Cech与Altman共同获得了诺贝尔化学奖,剪切型核酶,剪接型核酶,根据催化反应,锤头核酶,发夹核酶,丁型肝炎病毒（HDV)核酶,RNaseP,组II,内含子,组I,内含子,1.4.2 核酶的分类,自身剪切类核酶：,在自然界发现的自身剪切类核酶有锤头核酶、,发夹核酶、肝炎,病毒（HDV)核酶、VS核酶、glmS核酶,和CPEB3核酶自身剪切类核酶共同特征：,1 分子小，一般为35-155个核苷酸2 剪切自身或异体RNA序列中的保守位点的磷酸二酯键，,相当于内切核酸酶，产物带有5-OH和2，3-环状膦酸酯。
3 催化机制都是一般酸碱催化，质子的转移是共同的4 属于金属酶，催化反应都需要二价金属离子锤头核酶：,小分子自身分裂RNA，自身分裂是顺式（cis)反应，分子间分裂是反式（trans)反应箭头指向切割位点,最小锤头核酶由三个结构域组成：,1 分裂结构域GUX（X可以是A、U、C但不可以为G）,2 催化结构域：其中有13个核苷酸是保守的,2 底物结合结构域,二价金属阳离子（种类、离子强度）,温度,pH,值,影响,锤头核酶,活性的主要因素,自身剪接类核酶：,I类内含子、II类内含子、类-I类内含子（groupI,like-intron)-GIR1分支核酶和剪接体，以及具有3，,5-RNA连接酶活性的天然核酶,I类内含子的特征：,长度,140-4200nt,，剪接位点序列为,5UG3,催化核心是保守的,有内部的引导序列（,IGS,）,通过转酯反应实现自身的剪接，需要辅因子,II类内含子特征,：,最大的核酶之一，长度为,400-1000nt,II,类内含子不富含高度保守的序列（结构域,V,和结,构域,IV,可读框除外），但是采用高度保守的二级结,构，,6,个结构域围绕大的中心接合以特定的位置排列。
RNP类核酶,核糖核蛋白酶（ribonucleoprotein enzyme,RNPzyme)，,由RNA和蛋白质成分组成的酶分类：,根据RNP酶中RNA和蛋白质分子对起结构与功能的贡献,是不同1 RNP核酶：由一个催化RNA和多个蛋白质组成，,RNase P、剪接体和核糖体等2 RNP酶：催化作用依赖于蛋白质和RNA的密切合作，端粒酶3 RNP蛋白质酶：由结构RNA和蛋白质酶组成，信号识别颗粒SRP核酶的应用,核酶在抗,HIV,中的应用,核酶抗肝炎病毒的应用,核酶在抗生殖道感染的应用,核酶在抗白血病中的应用,核酶在抗移植排斥反应中的应用,1.5 脱氧核酶,（Deoxyribozyme,catalytic DNA,DNA enzyme、DNAzyme）,单链,DNA,和单链,RNA,的区别,1 RNA,中有,2-OH,，,DNA,则没有,2 RNA,中有尿嘧啶（,U),，,DNA,则是,5-,甲基尿嘧啶（,T),3,糖环的折叠上，,RNA,的优势构象是,C,3,-endo,，而,DNA,的优势构象是,C,2,-endo,1994,年,Breaker R R,与,Joyce G F,通过体外筛选得到具有催化活性的,DNA,Breaker R R,Joyce G F,与核酶相比，脱氧核酶具有明显的优势：,1 相对分子质量小，合成成本低，稳定性高，选择性强，,不仅可以精确的切割或连接底物RNA/DNA，而且可以,催化更广泛的化学反应。
2 脱氧核酶具有与一般药物相似的动力学特点，作用程序,和时间容易控制脱氧核酶可以催化反应类型,切割,RNA,的脱氧核酶,切割,DNA,的脱氧核酶,聚核苷酸激酶活性的脱氧核酶,连接酶活性的脱氧核酶,催化卟啉环金属螯合反应,的,脱氧核酶,N-,糖基化激酶活性,的脱氧核酶,常见的几种脱氧核酶,10,23,结构脱氧核酶,8,17,结构脱氧核酶,手枪型脱氧核酶,二分结构脱氧核酶,R=A or G,Y=C or U,substrate,Cleavage site,10,23,结构脱氧核酶,1 在模拟的生理条件（2mmol/LMgCl2、150mmol/LKCl、,pH7.5、37），以多转化率分裂靶RNA2 选择靶位点灵活，能够用任一靶RNA形成Watson-Crick碱基,配对，能够在任一嘌呤和嘧啶之间分裂RNA影响,10,23,脱氧核酶,活性的主要因素,活性中心核苷酸的组成,二价金属阳离子（种类、离子强度）,反义臂长度与核苷酸组成,效应物分子的作用,8,17,结构脱氧核酶,1 原型酶只分裂底物5-AG-3，A不与脱氧核苷,酸配对,2 靶部位的下游有“rG-dT”摆动配对脱氧核酶的应用,脱氧核酶在基因治疗中的应用,在抗肿瘤方面应用,抗,HIV,病毒方面应用,其它针对,mRNA,的应用,在,PCR,技术上的应用,作为分子生物学分析的工具,根据酶活性部位柔性的基本理论，考虑RNA柔性比DNA大，设计一个以锤头核酶为催化结构域和以DNA为骨架的环状RNA-DNA酶。
Hammerhead ribozyme,DNA,20 mer,随机DNA,体外筛选,5轮筛选,5-ACA TGG CTA CCC AAG CAT GA-3,cRD,E,Scheme for construction of circular RNA-DNA enzyme,环状核酶的构建,锤头核酶,单链DNA,10-23结构脱氧核酶,单链DNA载体M13mp18,5-ACA TGG CTA CCC AAG CAT GA-3,cRD,E,环状RNA-DNA酶,可复制 的环状DNAzyme,C-D,Z482,以高活性、结构稳定的10-23 DNAzyme为催化中心，以单链载体M13mp18为骨架构建了环状可复制的10-23 DNAzyme,环状脱氧核酶的构建,以10-23 DNAzyme-hammerhead ribozyme 为催化中心，以单链载体pBlue script II KS(+)为骨架构建了复合酶DNAzyme-RNAzyme单链DNA载体M13mp18,10-23结构脱氧核酶,编码锤头核酶DNA,10-23结构脱氧核酶,单链DNA载体pBluescript II KS(+),Hammerhead,ribozyme activity,DNAzyme-RNAzyme,锤头核酶,单链DNA,cRD,E,10-23 DNAzyme activity,Transcription,in vitro,“Translation”,Replication,pepzyme activity,Circular DNAzymes,环状脱氧核酶-核酶复合酶的构建,核酶与脱氧核酶的转换,核酶与脱氧核酶的转换,conversion,双功能脱氧核酶的设计与构建,二 RNA干涉,(RNA interference,RNAi),2.1 RNA 干涉现象的发现,1990,年，为加深矮牵牛花,(petunias),的紫色，,Jorgensen,等导入了一个强启动子控制的色素基因,.,可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色,.,这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，,Jorgensen,把这个现象命名为共抑制,(,cosuppression,),。
1995,年，康奈尔大学的,Su,Guo,在用反义,RNA(antisense,RNA),阻断线虫基因表达的试验中发现，反义,RNA(antisense,RNA),和正义,RNA(sense,RNA),都阻断了基,因的表达1998,年，,Andrew Fire,等的研究证明，在正义,RNA,阻断,了基因表达的试验中，真正起作用的是双链,RNA,，同时包,含了正义链和反义链的双链,RNA(double-stranded RNA,，,dsRNA,),阻断基因表达的效果要比单独注射正义链或者反义,链强得多1998 年2 月19 日 自然杂志(Nature),Fire 与 Mello 发现RNAi 的实验,带有肌肉蛋白编码信息的RNA 被注射到线虫(C.elegans),体内.单链RNA 没有产生任何效果.但当双链RNA 注射之,后，线虫开始抽搐，这是一种类似于携带有肌肉蛋白缺陷,型基因的线虫所表现出的表型2006 年诺贝尔生理学或医学奖,Andrew Z.Fire,Craig C.Mello,颁奖声明,获得者发现了一种可以针对特定基因降解其mRNA 的方式，在这种RNA 干涉现象中，双链RNA(double-stranded RNA)以一种非常明确的方式抑制了基因表达。
植物、动物、人类都存在RNA 干涉现象，RNA 干涉对于基因表达的调控、对病毒感染的防护、控制跳。