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1、第八章第八章 抗原抗体反应抗原抗体反应 及应用及应用一、抗体的制备一、抗体的制备抗体的一些基本概念抗体的一些基本概念单克隆抗体 (Monoclonal Antibody,McAb) 单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体多克隆抗体 (Polyclonal Antibody) 多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体 抗原（抗原（antigen ，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）Ag1234Ag 单克隆抗体 B1B2B3B4B3B3B3B32 多克隆抗体341单克隆抗体的特点单克隆抗体的特点n特异性强，具有抗原结合位点的专一性。（不是抗原的专一性！）n因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一
2、株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应。 抗体的性质相同，容易纯化、标记。 多克隆抗体的特点多克隆抗体的特点 多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。n特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，所以多抗更容易有交叉反应。n 比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体，多种抗 体都可与抗原结合。n 抗体的纯化、标记比单抗难 因为含有各种不同类型、亚类的抗体， 提纯、标记的方法有所差别。同时，血 清中含有的杂蛋白比较多。抗体的制备抗体的制备1、单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备无法采用生物化学的方法从多抗中分离必须采用细胞杂交的方法来制备能否筛选到理想的单克隆抗体有技
3、术问 题也有机遇问题 制备单克隆抗体的基本原理：制备单克隆抗体的基本原理： 致敏的致敏的B淋巴细胞淋巴细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 （myeloma） （能够分泌特异性的抗体 ， （不能分泌特异性的抗体， 不能在体外长期生存 ） 但能在体外长期生存） 阳性杂交瘤细胞阳性杂交瘤细胞 (hybridoma) （既能分泌特异性抗体， 又能够在体外长期生存）克隆化培养克隆化培养 （产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）生产单克隆抗体生产单克隆抗体 12222122 2、多抗的制备、多抗的制备q常用的免疫动物q免疫的基本步骤q如何免疫兔子1）常用的免疫动物兔子（rabbit）：最常用于自制抗体， 抗体量较多。（新西
4、兰,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但 抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过 程要麻醉动物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于较大批量地 生产抗体（商品）。马（horse）：常用于大批量生产治疗用 抗体（商品）。豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。2）免疫的基本步骤基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全 佐剂（含矿物油,卡介苗等)。加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次， 间隔2-4周，用佛式不完全佐剂 (不含卡介苗)。n取血测效价： 加强免疫两次或三次以后的第7天取血。n放血制备血清： 最后一次免疫后7-10天放
5、血。 (在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存) 1.1.周围周围6 6个孔放不同稀释度的相应个孔放不同稀释度的相应AbAb。 2.2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。该抗体的效价。 3.3.可进行任意稀释。可进行任意稀释。 3) 如何免疫兔子n2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20g，大鼠200g）n基础免疫0.5ml抗原(含0.250.5mg蛋白或108颗粒抗原)0.5ml佛式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml）制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）n加强免疫间
6、隔2-4周,可进行多次0.5ml抗原(蛋白量减半)0.5ml佛式不完全佐剂(IFA)制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射n免疫34次以后从耳静脉取血检测效价酶联法：1:104以上，能达到1:106。免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64n效价达到要求的可放血制备血清可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉) 单抗与多抗的区别单抗与多抗的区别 单抗 多抗抗体组成 单一 复杂 抗体性质 个体的属性 群体综合的性质纯化标记 容易，效果好 难度高一些 种属来源 绝大多数是小鼠 兔子、羊、豚鼠等制备周期 长 (最短4个月） 短（2个月）制备技术 复杂 简单经费 多 少 什么情况需
7、要制备单抗什么情况需要制备单抗n抗原不纯，无法分开n多抗效果不好（已排除非特异性反应）n希望将抗体用于治疗，研制成药品n希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂抗体的纯化抗体的纯化q盐析法（硫酸铵沉淀)q辛酸-硫酸铵沉淀法q离子交换法q亲和层析法q凝胶过滤法1、盐析法、盐析法（硫酸铵沉淀)原理在高浓度中性盐存在下，蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀硫酸铵是最常用的中性盐不同蛋白质的盐析常数不同硫酸铵的加入量通常以饱和度表示 (100%饱和度:767g/L)n主要步骤在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀；4高速离心，弃上清，溶解沉淀； 可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度: 50%饱和度: 0.313g/m
8、l 45%饱和度: 0.277g/ml 40%饱和度: 0.243g/ml最后一次离心后，用少量PBS溶解沉淀，透析，测定浓度。特点成本低，步骤简单。抗体的回收率比较高。抗体纯度比较低，电泳后可见到明显的杂带。需要高速离心机。2、正辛酸、正辛酸-硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法n原理两步沉淀：先加正辛酸去杂蛋白. 正辛酸是一种有机酸，在酸性条件下(pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀。后加硫酸铵使抗体沉淀.主要步骤：调节样品的pH值，加入正辛酸(25ul/ml)，搅拌30分。室温高速离心(10000g，30分钟)，收集上清液；再加入硫酸铵（40%饱和度）；4高速离心(10000g，15分钟)，弃上清；溶
9、解沉淀，透析，测定浓度。n特点成本较低，步骤较复杂。抗体回收率很低。抗体纯度高，电泳后杂带很少。需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。3、离子交换法、离子交换法n原理利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离。DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)将样品的pH值调至等电点以上，使样品带负电荷.采用盐溶液洗脱，通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分. + - - - - - - - - 带负电荷 的被吸附上带负电荷少的先被置换带负电荷多的后被置换 NaCl Tris 梯度混合仪 连续梯度洗脱:n主要步骤
10、 先用硫酸铵沉淀抗体，粗提；将样品过柱；洗去没有结合的物质；用梯度NaCl溶液洗脱，等量收集洗脱液；紫外分光光度计测量，保留A280值明显升高的样品；汇集样品，浓缩，测定浓度。特点成本较低，步骤较简单。抗体回收率较高。抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适合于各种标记。纯化后抗体体积大，需要浓缩。需要冷柜，自动收集器。4、亲和层析法、亲和层析法n原理利用蛋白质之间的特异性结合 （抗体-抗原，受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合，捕捉与它相配的物质。洗脱一般采用改变pH值的方法使用前样品结合(Binding)洗脱(Elution)n主要步骤 将Protein A与活化的柱子相结合(买商品柱)；将腹
11、水或血清处理后过柱；用结合缓冲液洗柱子，直到A280值为零；用甘氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液；测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品；汇集样品，浓缩，测定浓度。葡萄球菌A蛋白 (staphylococcal protein A,SPA)金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白分子量42000,等电点pH5.1可与大多数动物Ig的Fc段结合一个SPA分子有4个相似的活性部位与IgG的结合最强,与IgM,IgA的结合较差 特点成本高，步骤较简单。抗体回收率低。抗体纯度高，适合于各种标记。纯化后抗体体积大，需要浓缩。需要自动收集器。5、凝胶过滤法、凝胶过滤法(分子筛分子筛)n原理将样品混
12、合物通过一定孔径的凝胶介质，由于流经路径的差异,使不同分子质量的组分分离。大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD)n主要步骤将腹水或血清处理后上柱，样品要浓； (可用G-200，柱子要长，80-100cm)待样品入柱后,用缓冲液过柱；等量收集洗脱液,测定洗脱液的A280值。收集第一峰。n特点特点成本高，步骤较简单。抗体回收率较高，分离条件缓和，抗体活性不受影响。抗体纯度较高。需要自动收集器。二、抗体酶二、抗体酶抗体酶（抗体酶（Abzyme)概念概念：抗体酶：抗体酶 或催化抗体（或催化抗体（Cat
13、alytic antibody)是一种新型人工酶制剂，是一种具是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的特性。酶的特性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。高效催化能力巧妙结合的产物。IgGIgG与抗原形成与抗原形成 的交联晶格的交联晶格抗体酶的催化特征抗体酶的催化特征l1、与天然酶相比抗体酶的特点、与天然酶相比抗体酶的特点l 能催化一些天然酶不能催化的反应能催化一些天然酶不能催化的反
14、应l 有更强的专一性和稳定性有更强的专一性和稳定性l 催化作用机制不同催化作用机制不同l2、抗体酶和非催化性抗体作用的比较、抗体酶和非催化性抗体作用的比较l 更高的反应特异性更高的反应特异性l 反应的可逆性反应的可逆性l 反应过程反应过程 普通酶催化作用机制是“锁钥学说” 及“诱导契合学说”； 而抗体酶的催化机制目前还没有完全搞清楚，Janda曾提出“识别开关” 机制，即抗体将底物“钓进”抗体结合部位，然后使其与抗体结合，打开底物转化为反应过渡态的“开关”，导致共价键断裂，形成产物。抗体酶催化反应的介质效应抗体酶催化反应的介质效应l 酯解反应中介质效应酯解反应中介质效应 ： 抗体酶在有机溶剂中
15、具抗体酶在有机溶剂中具稳定性。稳定性。l 脱羧反应中介质效应脱羧反应中介质效应 ；有机溶剂引起脱羧反应；有机溶剂引起脱羧反应速率增加。速率增加。l 酰基转移反应中介质效应酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，活：在疏水溶剂中，活性较高。性较高。三、抗体酶的催化反应类型三、抗体酶的催化反应类型l1、转酰基反应、转酰基反应l2、水解反应、水解反应l3、Claisen重排反应重排反应l4、酰胺合成反应酰胺合成反应l5 Diels-Alder反应反应l6、转酯反应转酯反应l7、光诱导反应、光诱导反应l8、氧化还原反应、氧化还原反应l9、脱羧反应、脱羧反应l10、顺反异构化反应、顺反异构化反应四、抗体
16、酶的制备四、抗体酶的制备l1 1、细胞融合法：、细胞融合法：l 用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原；（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原；l 然后对此抗原进然后对此抗原进行行免疫免疫，使宿主有机体针对，使宿主有机体针对 抗原产生抗体；抗原产生抗体；l 产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合，融产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合，融 合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外 培养；培养；l将杂交体克隆化，即能产生单一均匀的抗体。将杂交体克隆化，即能产生单一均匀的抗体。2 2、抗体结合位点化学修饰法：
17、、抗体结合位点化学修饰法：抗体酶和酶一样也可以用抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法化学修饰法加以改加以改造。造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催引入具有催化功能的基因。化功能的基因。游离巯基游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。3. 3. 引入辅助因子法引入辅助因子法 很多天然酶活性中心都含有很多天然酶活性中心都
18、含有金属离子金属离子。LernerLerner等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。的选择性水解。他们用他们用CoCo3+3+盐作为金属离子辅因子，所用半抗原分子盐作为金属离子辅因子，所用半抗原分子带有一肽键，且通过羧根及仲胺基与金属离子相连。带有一肽键，且通过羧根及仲胺基与金属离子相连。将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白免疫动物产生将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白免疫动物产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键些抗体酶能选择性水解甘氨酸
19、和丙氨酸之间的肽键 . .4 4用生物工程的方法产生抗体用生物工程的方法产生抗体 Fab片断由轻链和重链的片断由轻链和重链的VH及及CH1部分组成，作部分组成，作为一种催化剂，抗体酶有这样的片断就行，无须为一种催化剂，抗体酶有这样的片断就行，无须完整的抗体分子。完整的抗体分子。 从人或动物的抗原中抽取基因，然后从人或动物的抗原中抽取基因，然后PCR技术重技术重新铸造轻链和重链，这样就可以把这些基因组合新铸造轻链和重链，这样就可以把这些基因组合成成100万个含有成对轻链和重链的基因库。万个含有成对轻链和重链的基因库。 这些基因库是存储在细菌里，通过随机地将基因这些基因库是存储在细菌里，通过随机地
20、将基因和轻重链结合，基因是通过细菌、酵母和轻重链结合，基因是通过细菌、酵母 、丝状真、丝状真菌等表达出来，就可大量制造菌等表达出来，就可大量制造Fab片断了。片断了。 5 5、拷贝法拷贝法：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。6 6、共价抗原免疫法、共价抗原免疫法以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合部位将产生与亲以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合部位将产生与亲和基团电
21、荷性质相反的基团，如亲核性，亲电性氨基和基团电荷性质相反的基团，如亲核性，亲电性氨基酸，酸性氨基酸，碱性氨基酸等。酸，酸性氨基酸，碱性氨基酸等。五、抗体酶的筛选五、抗体酶的筛选1、ELISA法法；用用ELISA法筛选对半抗原有亲和力的单法筛选对半抗原有亲和力的单 克隆抗体，克隆抗体，然后大量培养,分析单克隆抗体的酶学活性。2、酶学活性检测法、酶学活性检测法：直接用反应底物检测细胞培养液中：直接用反应底物检测细胞培养液中抗体的酶活性。抗体的酶活性。3、短过渡态类似物法、短过渡态类似物法：以过渡态类似物中含有的必需基团的基本结构单元做为筛选单克隆抗体的标准。对该化合物亲和力越强的化合物,其催化效率
22、越高4、基因筛选法、基因筛选法 ：应用基因探针，对基因抗体库进行分：应用基因探针，对基因抗体库进行分析和筛选。析和筛选。六、抗体酶的应用前景六、抗体酶的应用前景1 1、 抗体酶在帮助戒毒方面的应用抗体酶在帮助戒毒方面的应用 Landry等用可卡因水解的等用可卡因水解的过渡态类似物过渡态类似物-磷酸单酯磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因刺酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。激功能。因此，用人工抗体酶的被
23、动免疫也许能阻断可卡因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的因上瘾，达到戒毒目的 。2.2.抗体酶用于肿瘤治疗抗体酶用于肿瘤治疗 前药(prodrug) 是指由具有生物活性的药物经化学修饰后转变为体外无活性的化合物。这种化合物在体内经酶或非酶作用，脱去保护基，释放出母体药物而发挥作用。 目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗技术，即将目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗技术，即将 能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面
24、。于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力。三三 免疫反应的基本特点和标记技术免疫反应的基本特点和标记技术一、抗原抗体反应的一般规律一、抗原抗体反应的一般规律二、抗原抗体间主要的反应二、抗原抗体间主要的反应三、免疫标记技术三、免疫标记技术一、抗原抗体反应的一般规律一、抗原抗体反应的一般规律1 1、特异性、特异性2 2、可逆性、可逆性3 3、定比性、定比性4 4、阶段性、阶段性5 5、条件依赖性、条件依赖性 特异性示意图特异性示意图 特异性：特异性：抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体结
25、合。抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体结合。决定因素：决定因素：由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。的互补性决定的。 抗体分子抗体分子N端可变区形成端可变区形成3nm1.5nm0.7nm的槽沟，只的槽沟，只有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入。有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入。最适比例性最适比例性 抗原抗体的结合抗原抗体的结合抗原抗体的结合抗原抗体的结合反应具有一定的量比反应具有一定的量比反应具有一定的量比反应具有一定的量比关系。关系。关系。关系。只有当抗原抗体两者只有当抗原抗体两者只有当抗原抗体两者只有当抗原抗
26、体两者的分子比例合适时，的分子比例合适时，的分子比例合适时，的分子比例合适时，才能发生最强的结合才能发生最强的结合才能发生最强的结合才能发生最强的结合反应。反应。反应。反应。 以沉淀免疫反应为以沉淀免疫反应为以沉淀免疫反应为以沉淀免疫反应为例例例例 可逆性可逆性 概念：概念：是指抗原与抗体结合成复合物后，在是指抗原与抗体结合成复合物后，在 一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性。一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性。 解离后抗原抗体仍保持原有特性。解离后抗原抗体仍保持原有特性。 一定条件：低一定条件：低pHpH、高浓度盐等。高浓度盐等。 常用于解离抗原抗体复合物的物质有：常用于解离抗原抗体复
27、合物的物质有： 3mol/L3mol/L硫氰化钾、硫氰化钾、pH2.4 0.1mol/LpH2.4 0.1mol/L甘氨酸、甘氨酸、 7mol/L7mol/L尿素等。尿素等。抗体抗体混混有有S SP PA Ag g抗体抗体- -SPAgSPAg抗体抗体- -SPAgSPAg分分离离剂剂一一、抗抗原原抗抗体体结结合合二二、分分离离抗抗体体 可逆性示意可逆性示意图图抗体抗体n抗原抗体反应抗原抗体反应可分为两个阶段阶段。n第一为抗原与抗体发生特异性性结合的阶段阶段，此阶阶段段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。n第二为可见反应阶段阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、ph、温度、补体）的
28、影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。此阶阶段段反应慢，往往需要数分钟至数小时。n实际上这两个阶段阶段以严格区分，而且两阶段阶段的反应所需时间亦受多种因素和反应条件的影响，若反应开始时抗原抗体浓度较大且两者比较适合，则很快能形成可见反应。 二、抗原抗体间主要的反应二、抗原抗体间主要的反应1、凝集反应、凝集反应3、补体结合反应、补体结合反应2、沉淀反应、沉淀反应颗粒性抗原和抗体反应出现肉眼可见的凝聚团现象需要补体参与，以绵羊血和溶血素为指示剂的抗原抗体结合检测反应。可溶性抗原和抗体反应出现肉眼可见的沉淀物现象凝集反应凝集反应颗粒性抗原颗粒性抗原
29、( (细菌、血细胞等细菌、血细胞等) )与相应抗体在适量电解与相应抗体在适量电解质环境中相互作用，经过一定时间出现肉眼可见凝集质环境中相互作用，经过一定时间出现肉眼可见凝集现象，称凝集反应。现象，称凝集反应。2、间接凝集反应将可溶性抗原事先偶联到无关颗粒(如乳胶粒)上转化为颗粒性抗原再进行凝集反应。 1 1、直接凝集反应、直接凝集反应 颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。 凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应当可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的适当条件下当可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的适当条件下相遇，经过一定时间出现肉眼可见的沉淀现象，称沉相遇
30、，经过一定时间出现肉眼可见的沉淀现象，称沉淀反应。淀反应。1 1、环状沉淀实验、环状沉淀实验 当反应于试管内进行时，称环状沉淀实验。当反应于试管内进行时，称环状沉淀实验。2 2、琼脂扩散试验、琼脂扩散试验 抗原与抗体在含电解质的凝胶介质（琼脂）内自由扩抗原与抗体在含电解质的凝胶介质（琼脂）内自由扩散，当抗原抗体以适当比例相遇时可出现白色沉淀线，称散，当抗原抗体以适当比例相遇时可出现白色沉淀线，称琼脂扩散试验。琼脂扩散试验。1:21:41:81:16 1:32 1:64 1:128各管抗原倍比稀释各管抗原倍比稀释加入抗血清加入抗血清各管抗体量不变各管抗体量不变振摇振摇 混匀、混匀、37孵育孵育沉
31、淀量不同沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管。出现沉淀量最多的管为最适比例管。轻摇轻摇 絮状沉淀试验絮状沉淀试验絮絮 状状 沉沉示示 意意 图图淀淀AgAbAg琼脂扩散试验琼脂扩散试验 某些小分子物质结合到抗原或抗体上，不影响抗某些小分子物质结合到抗原或抗体上，不影响抗原抗体反应但使之更容易观察从而提高检测的灵敏度，原抗体反应但使之更容易观察从而提高检测的灵敏度，称为免疫标记技术。称为免疫标记技术。与抗原或抗体结合的小分子物质称为标记剂。近年免与抗原或抗体结合的小分子物质称为标记剂。近年免疫标记技术发展很快，各类物质被试用作标记物，其疫标记技术发展很快，各类物质被试用作标记物，其中以中以荧
32、光素荧光素、放射性同位素放射性同位素和和酶标记酶标记最为成熟，合称最为成熟，合称三大标记技术。三大标记技术。三、免疫标记技术三、免疫标记技术1、免疫荧光技术、免疫荧光技术免疫荧光技术是一种将免疫反应的特异性与荧免疫荧光技术是一种将免疫反应的特异性与荧光标记分子的可见性结合起来的方法，因常用荧光标记分子的可见性结合起来的方法，因常用荧光物质标记抗体，又称荧光抗体法。光物质标记抗体，又称荧光抗体法。生物标记荧光素的要求生物标记荧光素的要求1、具有与蛋白质共价结合的能力、具有与蛋白质共价结合的能力2、荧光效率高、荧光效率高3、能与背景物质形成鲜明对比、能与背景物质形成鲜明对比4、不影响蛋白质的生物、
33、免疫活性、不影响蛋白质的生物、免疫活性5、标记方法安全、简便、标记方法安全、简便6、标记物稳定，易保存、标记物稳定，易保存异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITCFITC）的标记原理的标记原理与方法与方法荧光素荧光素-N=C=S + NH2-抗体抗体荧光素荧光素-N-C-N-抗抗体体H S H呈现明亮的黄绿色荧光四乙基罗丹明（四乙基罗丹明（rhodaminerhodamine，RIB200RIB200）的标记原理与方法的标记原理与方法荧光素荧光素-SO3Na + PCl5荧光素荧光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl荧光素荧光素-SO2 Cl + NH2-抗体抗体 荧光素荧光素-SO2
34、 -NH-抗体抗体 + HCl 呈橘红色荧光标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离、分离 目的：去除游离荧光素目的：去除游离荧光素 方法：柱层析方法：柱层析2、鉴定、鉴定 抗体活性抗体活性 标记物结合度标记物结合度 F/P比值比值放射免疫测定是一种以放射线同位素作为标记物，将放射免疫测定是一种以放射线同位素作为标记物，将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性这两大同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性这两大特点结合起来的测定技术。特点结合起来的测定技术。2、放射免疫测定、放射免疫测定 (radioimmunoassay RIA) 放射免疫技术灵敏度极高，能测得毫微克至微微放射
35、免疫技术灵敏度极高，能测得毫微克至微微克克(10-910-12克克)的含量，广泛用于激素、核酸、的含量，广泛用于激素、核酸、病毒抗原、肿瘤抗原等微量物质测定。但需特殊仪病毒抗原、肿瘤抗原等微量物质测定。但需特殊仪器及防护措施，并受同位素半衰期的限制。器及防护措施，并受同位素半衰期的限制。常用标记方法常用标记方法1、常用放射性核素、常用放射性核素2、125I 的标记方法的标记方法 直接法（氯胺直接法（氯胺T法）法） 间接法（连接法）间接法（连接法）直接法（氯胺直接法（氯胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T间接法（连接法）间接法
36、（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+ Na125I氯胺T125INSHPP间接法（连接法）间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHH-C-C-N-蛋白质H O H+ NH2-蛋白质125I125I标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离、分离 目的：去除游离放射性核素目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析方法：柱层析2、鉴定、鉴定 游离放射性核素含量游离放射性核素含量 免疫活性免疫活性 比放射性（比放射性（mCi/mg
37、）应用意义应用意义3、免疫酶技术、免疫酶技术酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析（ELISA）是是将将酶酶作作为为标标记记物物质质，使使之之和和抗抗原原（或或抗抗体体）结结合合形形成成酶酶与与抗抗原原（或或抗抗体体）复复合合物物，然然后后再再根根据据待待测测抗抗体体（或或抗抗原原）与与复复合合物物专专一一且且定定量量的的结结合合关关系系，在在特特异异抗抗原原抗抗体体反反应应后后，在在相相应应而而合适的酶底物作用下，产生可见的不溶性有色产物。合适的酶底物作用下，产生可见的不溶性有色产物。 免疫酶技术可用于组织切片、细胞培养标本等组织细胞抗原的免疫酶技术可用于组织切片、细胞培养标本等组织细胞抗原的 定
38、性定位。也可用于可溶性抗原或抗体的测定。定性定位。也可用于可溶性抗原或抗体的测定。 常用的为辣根过氧化物酶常用的为辣根过氧化物酶 (HRP)，其次有碱性磷酸酶等。其次有碱性磷酸酶等。 ELISA方法是将可溶性抗体或抗原吸附到方法是将可溶性抗体或抗原吸附到聚苯乙烯等固相载体上，再进行免疫酶反应，聚苯乙烯等固相载体上，再进行免疫酶反应，用分光光度计比色以定性或定量，是目前应用用分光光度计比色以定性或定量，是目前应用最广泛的生物学技术之一最广泛的生物学技术之一。酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)ELISA技术的原理与方
39、法技术的原理与方法间接法间接法 夹心法夹心法 竞争法竞争法间接法间接法夹心法夹心法竞争法竞争法n酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELISAELISA（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay） 是一类常用的免疫酶技术。是将已知是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)(HRP) 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）。）。ELISAELI
40、SA检测抗原检测抗原 Ag +Ag + Ab* Ab* Ag-Ab* Ag-Ab*ELISAELISA检测抗体检测抗体 Ab +Ab + Ag* Ag* Ab-Ag* Ab-Ag*ELISAELISA检测抗体检测抗体Ag + Ab1 Ag + Ab1 Ag-Ab1 Ag-Ab1Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2* Ag-Ab1-Ab2* 竞争竞争ELISAELISA检测抗原检测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法竞争法模式。其原理原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标
41、本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。固定固定OD值值实验材料：实验材料：n羊抗人血清白蛋白抗体（一抗）羊抗人血清白蛋白抗体（一抗）n已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线）已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线）n待检人血清白蛋白待检人血清白蛋白n辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗）辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗）n包被液包被液CBSCBS：PH9.6PH9.6，0.05mol/L0.05mol/L碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液n洗板液或稀释液：洗板液或稀释液：PH7.4PH7.4，0.01mol/L PBS0.01mol/L
42、PBSn底物溶液：底物溶液：OPD-HOPD-H2 2O O2 2n终止液：终止液：2mol/L H2mol/L H2 2S0S04 4n酶标反应板（一条酶标反应板（一条/ /人）人）三、操作步骤三、操作步骤1.包被抗原包被抗原 抗原用包被液（CBS）稀释至合适浓度，加入到酶标酶标板板中，100l/孔，放入湿盒中，4过夜。 次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包被的游离抗原。抗原抗原100ul/孔孔湿盒中，4过夜酶标板酶标板2.抗原与抗体的预孵育抗原与抗体的预孵育制作标准曲线：制作标准曲线： 在稀释板中，用PBS倍比稀释标准抗原，每种浓度的抗原最终为50l，分别
43、在各抗原孔中加入250l一定浓度的抗体，放入37恒温培养箱中30 min。待测抗原：待测抗原： 取50l未知浓度的抗原按照同上操作。待测抗原待测抗原50ul50ulPBSPBS 50ul50ul 稀释液稀释液50ul50ul100ul 100ul 标标准抗原准抗原250ul抗体抗体稀释板37，30 min3. 3. 与固相抗原的竞争结合与固相抗原的竞争结合 取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液100l，加入酶标板的抗原孔中，放入37恒温培养箱中60 min。洗板3次。 100ul稀释板稀释板酶标板酶标板37，60 min洗板3次4. 4. 酶标二抗的结合酶标二抗的结合 酶标抗体用稀释液稀释至工作浓
44、度后，加入每孔中，100ul/孔，置湿盒中放37 30min。洗板3次。5. 5. 加入底物显色液加入底物显色液（用前再配制，并置棕色瓶内） 每孔加入底物显色液，100ul/孔，湿盒中37保温一定时间。6. 6. 终止反应终止反应 待出现明显颜色反应（或一定时间）后，加入终止液， 50ul/孔以终止反应。7. 7. 结果测定结果测定 用酶标仪在492nm波长下测定OD值。 以标准抗原的浓度为横坐标，相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，计算未知抗原的浓度。酶标仪酶标仪4、免疫电子显微镜技术、免疫电子显微镜技术(immune electron microscopy)基本原理：用电子致密物质标记抗体，
45、然后与含有相应基本原理：用电子致密物质标记抗体，然后与含有相应抗原的生物标本反应，在电镜下观察到电子致密物质，抗原的生物标本反应，在电镜下观察到电子致密物质，从而准确地显示抗原所在位置从而准确地显示抗原所在位置 ，是一种在超微结构水，是一种在超微结构水平上的抗原定位方法。平上的抗原定位方法。免疫电子显微镜技术是将血清学标记技术与电子显微免疫电子显微镜技术是将血清学标记技术与电子显微镜相结合，在免疫反应高度特异、敏感、快速、简便镜相结合，在免疫反应高度特异、敏感、快速、简便的基础上，用电子显微镜进行超微结构水平研究的一的基础上，用电子显微镜进行超微结构水平研究的一项技术。项技术。5、免疫印迹、免
46、疫印迹(western blot)免疫印迹是在用于免疫印迹是在用于DNA分析的分析的DNA印迹印迹(Southern blot)技术基础上发展起来的蛋白质检测技术。技术基础上发展起来的蛋白质检测技术。 原理：将SDS-PAGE电泳的高分辨率与免疫反应的高度特异性相结合。待测样品经SDS-PAGE电泳分离后，转移到固相介质如醋酸纤维膜上，在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western Blot一般流程n蛋白样品的制备nSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色?通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备
47、总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法水溶液提取法水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液细胞裂解液细胞裂解
48、液细胞裂解液： 50 50 50 50 mmolmmolmmolmmol/L /L /L /L Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl, 150 , 150 , 150 , 150 mmolmmolmmolmmol/L /L /L /L NaclNaclNaclNacl ,5 ,5 ,5 ,5 mmolmmolmmolmmol/L EDTA, 1%NP40 /L EDTA, 1%NP40 /L EDTA, 1%NP40 /L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF 0.05% PMSF 0.05% PMSF 0.05% PMSF ， 2g/mL 2g/mL
49、 2g/mL 2g/mL AprotininAprotininAprotininAprotinin, , , , 0.5g/mL 0.5g/mL 0.5g/mL 0.5g/mL LeupeptinLeupeptinLeupeptinLeupeptin ， pH8.0pH8.0pH8.0pH8.0 有机溶剂提取法有机溶剂提取法有机溶剂提取法有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮
50、和丁醇等。丙酮和丁醇等。丙酮和丁醇等。丙酮和丁醇等。?通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的制备蛋白样品的制备蛋白样品的定量Bradford法 考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250有有红红、蓝蓝两两种种不不同同颜颜色色的的形形式式，在在一一定定浓浓度度的的乙乙醇醇和和酸酸性性条条件件下下，可可配配成成淡淡红红色色的的溶溶液液，与与蛋蛋白白结结合合后后形形成成蓝蓝色色化化合合物物，该该化化合合物物在在595nm处处有有最最大大吸吸收收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正
51、比 。(上样量上样量)试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释 至 4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）管号012345678ddH2O807070707070707070蛋白标准液01010101010101010样品101010101010101010HCL101010101010101010SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳原理原理： SDS SDS 是是一一种种离离子子性性的的界界面面活活性性剂剂, ,
52、它它有有强强离离子子性性的的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链硫酸根离子也带有疏水性的长碳链. . 当当 SDS SDS 与与蛋蛋白白质质混混合合时时, ,它它会会以以其其碳碳链链与与蛋蛋白白质质之之疏疏水水性性氨氨基基酸酸结结合合将将蛋蛋白白质质包包起起来来, ,而而以以硫硫酸酸根根离子外露与水分子作用离子外露与水分子作用. . 而而蛋蛋白白质质结结合合SDSSDS之之后后, ,由由于于SDS SDS 带带强强负负电电荷荷, ,使使蛋蛋白白质质原原先先的的带带电电价价微微不不足足道道, ,且且每每单单位位重重量量之之蛋蛋白白质质带带电电价价一一致致，所所以以决决定定不不同同蛋蛋白白的的泳泳动动速
53、速率率就就只剩下分子大小一项因素只剩下分子大小一项因素M丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的配胶的Tris缓冲液缓冲液MTEMEDM过硫酸铵过硫酸铵(时间时间)MTris-甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶成份凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）凝胶浓度（）线性分离范围（线性分离范围（KD)KD)151512-4312-43101016-6816-687.57.536-9436-945.05.057-21257-212转膜转膜膜的膜的膜的膜的选择选择选择选择尼龙膜尼龙膜尼龙膜尼龙膜硝酸纤硝酸纤硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜维素膜维素
54、膜封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格便宜价格便宜价格便宜价格便宜特殊要求下的选择特殊要求下的选择特殊要求下的选择特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：（尼龙膜：（尼龙膜：（尼龙膜： 480g/cm480g/cm2 2 ；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：80g/cm80g/cm2 2 ）目的蛋
55、白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度需要更大的机械强度需要更大的机械强度需要更大的机械强度转膜半干法半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 凝胶凝胶1 Kg支持物玻璃板玻璃板3MM滤纸滤纸吸水纸吸水纸醋酸纤维膜醋酸纤维膜滤纸滤纸20SSC重物重物转膜后检测n n丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。n n印度墨汁染色 只用于放射性
56、标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 封闭n n脱脂奶粉（5）n nBSAn nWestern Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育n把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。温育。37一小时，一小时，4 过夜。过夜。n倒掉一抗溶液，用倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜漂洗液滤膜3次，每次次，每次10min。n加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一一小时，小时，4 过夜。过夜。n倒掉一抗溶液，用倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜漂洗液滤膜3次，每次次，每次10min。二抗与底物反应显色二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（碱性磷酸酶法（AP）碱性磷酸酶也可催化化学发光底物CDP-Star，在目标核酸位置产生不稳定的中间产物而很快分解，并在这一过程中发光，通过X光片可以进行检测。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶常用的底物为鲁米诺
