2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体

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1、 2002年年12月月30日，日， 两场筹备了两场筹备了10年的年的“太太空婚礼空婚礼”首次在神舟四号飞船上举行，首次在神舟四号飞船上举行，植物细胞植物细胞“新人新人”黄花烟草黄花烟草和和革新一号烟草革新一号烟草叶肉细胞叶肉细胞原原生质体生质体，动物细胞动物细胞“新人新人”是小鼠是小鼠B淋巴细胞淋巴细胞和和骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞，两批新人同时在，两批新人同时在 “产房产房”电融合电融合仪内孕育新生命。仪内孕育新生命。“太空婚礼太空婚礼”这两场这两场“太空婚礼太空婚礼”实质是哪两项细胞工程技实质是哪两项细胞工程技术术植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术动物细胞融合技术动物细胞融合技术(1)(1)(

2、2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图一一. .动物细胞融合动物细胞融合请同学们阅读课本请同学们阅读课本P52P52动物细胞融合动物细胞融合思考：思考： 什么是动物细胞融合？什么是动物细胞融合？ 动物细胞融合的原理、方法、过程及结果动物细胞融合的原理、方法、过程及结果。 动物细胞融合技术的应用。动物细胞融合技术的应用。 A细胞细胞B细胞细胞人工诱导人工诱导1.11.1动物动物细胞融合的概念细胞融合的概念杂交细胞杂交细胞 动物细胞融合（也称细胞杂动物细胞融合（也称细胞杂交）：是指交）：是指两个或多个细胞两个或多个细胞融融合形成一个合形成一个单核细胞单核细胞的过程。的过程。一、动物细胞融合

3、一、动物细胞融合细胞膜的流动性细胞膜的流动性灭活病毒、灭活病毒、PEGPEG、电激等、电激等融合后的细胞进行有丝分裂，融合后的细胞进行有丝分裂，形成完整的杂交细胞形成完整的杂交细胞诱导的手段？诱导的手段？融合后细胞的类型？融合后细胞的类型？ABAB杂种细胞遗传物质杂种细胞遗传物质有什么特点？有什么特点？三种三种AAAA、ABAB、BBBB（A A、B B）含两种生物的遗传物质含两种生物的遗传物质1.21.2动物细胞融合过程动物细胞融合过程原理？原理？1.21.2动物细胞融合过程动物细胞融合过程 为什么灭活的为什么灭活的病毒能作诱导剂病毒能作诱导剂？灭活丧灭活丧失感染性失感染性保留融合活性保留融

4、合活性1.31.3动物动物细胞融合技术的意义和应用细胞融合技术的意义和应用突破有性杂交方法的局限，使远突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能缘杂交成为可能最主要用途：制造单克隆抗体最主要用途：制造单克隆抗体强化巩固：强化巩固：1.1.植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？胞壁？ 酶解法，如纤维素酶或果胶酶酶解法，如纤维素酶或果胶酶2.2.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？么？无需，因为动物细胞无细胞壁无需，因为动物细胞无细胞壁3.3.植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的植物体细胞杂交诱导原生质体融合常

5、用的方法有哪些？方法有哪些？离心、电激等物理方法；离心、电激等物理方法；PEGPEG等化学方法等化学方法5.5.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形成完整的杂种个体，动物细进行组织培养形成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？胞融合后能形成杂种动物个体吗？不能不能4.4.动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？有其他方法吗？能能 ，还可以利用，还可以利用灭活的病毒灭活的病毒进行诱导进行诱导比较项比较项目目细胞融合细胞融合的原理的原理细胞融合的细胞融合的方法方法诱导手段诱导手段用途用

6、途植物体植物体细胞杂细胞杂交交细胞膜的细胞膜的流动性流动性纤维素酶、纤维素酶、果胶酶果胶酶去除去除细胞壁后诱细胞壁后诱导原生质体导原生质体融合融合离心、电刺离心、电刺激、振动、激、振动、聚乙二醇聚乙二醇克服远源克服远源杂交不亲杂交不亲和，获得和，获得杂种植株杂种植株动物细动物细胞融合胞融合细胞膜的细胞膜的流动性流动性用用胰蛋白酶胰蛋白酶使细胞分散使细胞分散后诱导细胞后诱导细胞融合融合除应用植物除应用植物细胞杂交手细胞杂交手段外，段外，还有还有灭活病毒灭活病毒获得杂种获得杂种细胞、细胞、制备制备单克隆抗单克隆抗体体1.4 1.4 比较动、植物细胞杂交技术比较动、植物细胞杂交技术【例例1】能使动物

7、细胞融合的特有的诱导因子是能使动物细胞融合的特有的诱导因子是 （ ）A.离心离心 B.灭活的病毒灭活的病毒 C.电刺激电刺激 D.振动振动【例例2】融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（ ）A.具有原来两个或多个细胞的遗传信息具有原来两个或多个细胞的遗传信息 B.能无限增殖能无限增殖 C.可形成新个体可形成新个体 D.培养过程会贴壁培养过程会贴壁【例例3】动物细胞融合的作用中最重要的是（动物细胞融合的作用中最重要的是（ ）A.克服远源杂交不亲和克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体制备单克隆抗体 C.培育新物种培育新物种 D.生产杂种细胞生产杂种细胞 BBA强

8、调：强调：效应效应B淋巴细胞是淋巴细胞是能够产生抗体的能够产生抗体的B淋巴细淋巴细胞，下文将其简称为胞，下文将其简称为B淋淋巴细胞巴细胞抗体：能够与抗原发生特抗体：能够与抗原发生特异性结合的异性结合的免疫球蛋白免疫球蛋白。能产生抗体的细胞是能产生抗体的细胞是浆细浆细胞（即效应胞（即效应B细胞）。细胞）。二、单克隆抗体二、单克隆抗体B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞效应效应效应效应B B B B淋巴淋巴淋巴淋巴细胞细胞细胞细胞记忆记忆记忆记忆B B B B淋巴淋巴淋巴淋巴细胞细胞细胞细胞分化分化分化分化抗体的传统生产方法抗体的传统生产方法抗原抗原 反复注射动物反复注射动物从动物的从动

9、物的血清血清中分离抗体中分离抗体该法制备抗体的缺点：该法制备抗体的缺点：产量低、纯度低，且抗产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度体的特异性差、灵敏度低。低。单克隆抗体！单克隆抗体！能否用单个能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体单一类型的抗体呢？呢？读下面一读下面一段资料，段资料，找出单克隆抗体的概念找出单克隆抗体的概念 人人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B B细胞细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B B细胞只分细胞只分泌一

10、种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个一抗体，必须用单个B B细胞进行无性繁殖，即克隆。细胞进行无性繁殖，即克隆。2.1单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念单克隆单克隆抗体：抗体：单个单个B B细胞克隆产生的细胞克隆产生的化学性化学性质单一、特异性强质单一、特异性强的抗体的抗体提示提示1 1：对：对B B细胞进行细细胞进行细胞培胞培养可养可行吗？行吗？提示提示2 2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？问题：问题：如如何大量生产单克隆抗体何大量生产单克隆抗体？请尝试设？请尝试设计一

11、个方案。计一个方案。2.2单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞能无限增殖骨髓瘤细胞能无限增殖杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术设计方案：设计方案：动物细胞融合技术动物细胞融合技术单克隆单克隆抗体抗体 既能产生特异性抗体，既能产生特异性抗体， 又能大量增殖的细胞又能大量增殖的细胞19751975年英国科学家年英国科学家米尔斯坦米尔斯坦和和柯勒柯勒的实验的实验为什么给小鼠注射特定的为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？抗原蛋白？ 会有几种融合方式？会有几种融合方式？ 杂交瘤细胞是如何筛选出杂交瘤细胞是如何筛选

12、出来的？有何特点？来的？有何特点？ 是否所有的杂交瘤细胞都是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？能产生专一性抗体？ 如何大规模进行培养得到如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？大量的单克隆抗体？多种杂交多种杂交多种杂交多种杂交 细胞细胞细胞细胞灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞经免疫经免疫经免疫经免疫的小鼠的小鼠的小鼠的小鼠提取提取杂交瘤杂交瘤杂交瘤杂交瘤细胞细胞细胞细胞第一次筛选第一次筛选第一次筛选第一次筛选用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基第二次筛选第二次筛选第二次筛选第二

13、次筛选能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养体外培养体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体1.动物特异性免疫动物特异性免疫2.分离分离B淋巴细胞（淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意）。注意B淋巴细胞淋巴细胞是一个系列。（是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）3.细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:（BB;BG;

14、GG）4.第一次筛选：在第一次筛选：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（只（只有有BG杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G-BnG。而。而BB,GG在此培养基上不能存活。）在此培养基上不能存活。）5.第二次筛选：在第二次筛选：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列 ，每孔只每孔只放一个杂交瘤细胞。放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞

15、。的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。6.选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射到或注射到小鼠腹腔内小鼠腹腔内增殖增殖。 7.提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：、单抗的制备过程要点：单抗制备过程分哪几步？单抗制备过程分哪几步？请用箭头把以下代表单克隆抗请用箭头把以下代表单克隆抗体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺序是？序是？ 3 3 3 3）、为何要进行两次筛选？）、为何要进行两次筛选？）、为何要进行两次筛选？）、为何要进行两次筛选？4 4）、如何进行第）、如何进行第2 2次

16、筛选？次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第第2 2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：问题强化：1 1）、本过程利用了哪些原理？）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲

17、细胞的遗传物质，不仅具有不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领本领，因而可以获得大量单克隆抗体，因而可以获得大量单克隆抗体2.3单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用诊断试剂诊断试剂最广泛应用最广泛应用准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速单克隆抗体最主要的优点：单克隆抗体最主要的优点：特异性强，灵敏特异性强，灵敏度高，并能大量制备。度高，并能大量制备。“生物导弹生物导弹” 单克隆抗体药物单克隆抗体药物 单抗导向，药物为弹头单抗导向，药物为弹头治疗疾病和运载药物治疗疾病和运载药物主要用于治疗主要用于治疗癌症治疗癌症治疗，单克隆抗体作为载体

18、，运载抗，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成癌药物，形成“生物导弹生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。准确杀伤癌变细胞。【例例4 4】科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（ ）A.A.经过免疫的经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞 C.C.经过免疫的经过免疫的T T淋巴淋巴细胞细胞B.B.不经过免疫的不经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D.D.不经过免疫的不经过免疫的B B淋淋巴细胞巴细胞【例例5 5】单克隆抗体是由下列哪种细胞产生

19、的单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的 （ ）A.A.B B淋巴细胞淋巴细胞 B BT T淋巴细胞淋巴细胞 C C骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 D D杂交瘤细胞杂交瘤细胞AD【例例6】用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中列实验步骤中错误错误的是（的是（ ）A A将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B B淋巴淋巴细胞细胞B B用纤维素酶处理用纤维素酶处理B B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C C用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B B淋巴淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合细胞

20、与小鼠骨髓瘤细胞融合D D筛选杂交细胞，并从中选出能产生所需抗体的筛选杂交细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体细胞群，培养后提取单克隆抗体B两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三三个个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒灭活病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势(1)(1)若若A A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B B细胞是取自小鼠细胞是取自小鼠体内的体内的 细胞，细胞，从小鼠体内提取

21、分离该细胞之从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射前，应给小鼠注射_类物质。类物质。（2）d过程过程是一个是一个_过程，该过程的进过程，该过程的进行常用行常用_或或_的诱导。的诱导。(3)(3)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成 种种类型的类型的C C细胞，因此需用细胞，因此需用_培养基筛选出培养基筛选出D D细胞细胞用于培养，用于培养，D D细胞的名称是细胞的名称是 ，其特点是，其特点是_。效应效应B 抗原抗原 细胞融合细胞融合 聚乙二醇聚乙二醇 灭活的病毒灭活的病毒 选择性选择性 3既能无限增殖又能产生特异性抗体既能无限增殖又能产生特异性抗体 杂交

22、瘤细胞杂交瘤细胞(4)(4)在培养时通过在培养时通过_分裂方式大量繁殖。分裂方式大量繁殖。D D细细胞体外培养需要注意的条件是（要求答胞体外培养需要注意的条件是（要求答5 5项）项）_。（5 5）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特点是与常规抗体相比，其特点是_。特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 有丝有丝有丝有丝无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和pHpH；适宜的气体环境适宜的气体环境 1515、（1）单克隆抗体是指）单克隆抗体是指 。（2 2）制备单克隆抗体的步骤：）制备单克

23、隆抗体的步骤：将将_注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细胞，其中至少胞，其中至少1 1个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体。个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体。将步骤将步骤获得的获得的B B淋巴细胞与步骤淋巴细胞与步骤培养的骨髓瘤细胞培养的骨髓瘤细胞在在_的诱导下融合。的诱导下融合。将诱导后产生的多种细胞，放在将诱导后产生的多种细胞，放在_培养基的多孔培养基的多孔培养板上培养，筛选。培养板上培养，筛选。这样获得的杂交瘤细胞既具有这样获得的杂交瘤细胞既具有B B淋巴细胞淋巴细胞_的能力，又具有的能力，又具有_的本领。的本领。检测和分离带有抗检测和分离带有抗X X抗体的阳性细

24、胞，培养板中每孔放抗体的阳性细胞，培养板中每孔放一个细胞进行培养。一个细胞进行培养。将阳性细胞进行增殖，从而制备出大量抗该抗原的单克将阳性细胞进行增殖，从而制备出大量抗该抗原的单克隆抗体。隆抗体。化学性质单一，特异性强的抗体化学性质单一，特异性强的抗体 抗原抗原 聚乙二醇聚乙二醇选择性选择性 无限增殖无限增殖 产生专一抗体产生专一抗体（3）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：体外培养法，可获得体外培养法，可获得10 g/mL的抗体；的抗体；动物体内动物体内诱生法可获得诱生法可获得520mmg/mL的抗体。你选择的方法及原的抗体。你选择的方法及原因是因是 。

25、（4 4）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因为它是用小鼠的为它是用小鼠的_细胞制备的，其化学本质是细胞制备的，其化学本质是_，应用于人体，会作为，应用于人体，会作为 产生产生 ，解决这个问题的方法是，解决这个问题的方法是_。大量生产选大量生产选，小规模生产选，小规模生产选效应效应B蛋白质蛋白质异物异物免疫反应免疫反应采用人的效应采用人的效应B细胞制备细胞制备15、右图为某同学根据杂交瘤技术、右图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。据图回答：体的实验方案。据图回答：（1）该方案能达到预期效果吗）该方案能达到预期效果吗？。原因是。原因是_。（2）图中）图中为为 过程，过程，常用常用 作为诱导剂。该细作为诱导剂。该细胞继承了胞继承了_ ，因此不仅能分泌，因此不仅能分泌_，还有，还有 本领。本领。不能不能 没有将抗原注入小鼠体内，无法获得没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生专一抗体的产生专一抗体的B淋巴细胞淋巴细胞 细胞融合细胞融合 灭活病毒灭活病毒 双亲细胞的遗传物质双亲细胞的遗传物质 特异性抗体特异性抗体 大量增殖大量增殖制备单克隆抗体制备单克隆抗体（3）该方案的目的是）该方案的目的是_。