《哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增》由会员分享，可在线阅读，更多相关《哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增（17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验二、哺乳动物组织实验二、哺乳动物组织 DNADNA的快速分离与基因的的快速分离与基因的 PCRPCR 扩增扩增一、一、 实验目的实验目的1、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会 并掌握从哺乳动物组织中并掌握从哺乳动物组织中提取基因组总提取基因组总DNA的原理的原理 与技术，为与技术，为PCR分析，分析，RFLP分析，基因文库的构分析，基因文库的构 建，基因检测等研究打下基础；建，基因检测等研究打下基础；2 2、学习与掌握、学习与掌握、学习与掌握、学习与掌握PCRPCR扩增基因扩增基因扩增基因扩增基因的原理和操作方法，了解的原理和操作方法
2、，了解的原理和操作方法，了解的原理和操作方法，了解 PCR PCR基因扩增技术在分子克隆，目的基因检测，遗基因扩增技术在分子克隆，目的基因检测，遗基因扩增技术在分子克隆，目的基因检测，遗基因扩增技术在分子克隆，目的基因检测，遗 传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。二、二、实验原理原理1 1 1 1、哺乳、哺乳、哺乳、哺乳动动物物物物组织组织DNADNADNADNA的提取：在的提取：在的提取：在的提取：在EDTAEDTAEDTAEDTA（鳌鳌合二价阳离子以抑
3、制合二价阳离子以抑制合二价阳离子以抑制合二价阳离子以抑制DNaseDNaseDNaseDNase）存在的情况下，用）存在的情况下，用）存在的情况下，用）存在的情况下，用蛋白蛋白蛋白蛋白酶酶K K K K消化真核消化真核消化真核消化真核细细胞或胞或胞或胞或组织组织，用去垢，用去垢，用去垢，用去垢剂剂如如如如SDSSDSSDSSDS溶解溶解溶解溶解细细胞膜并使蛋白胞膜并使蛋白胞膜并使蛋白胞膜并使蛋白质变质变性。核酸通性。核酸通性。核酸通性。核酸通过过有机溶有机溶有机溶有机溶剂进剂进行抽行抽行抽行抽提提提提纯纯化。化。化。化。污污染的染的染的染的RNARNARNARNA通通通通过过RNaseRNas
4、eRNaseRNase消化去除。根据本方法制消化去除。根据本方法制消化去除。根据本方法制消化去除。根据本方法制备备的哺乳的哺乳的哺乳的哺乳动动物基因物基因物基因物基因组组DNADNADNADNA约约2020202050 kb50 kb50 kb50 kb，适于作，适于作，适于作，适于作PCRPCRPCRPCR反反反反应应的模板。的模板。的模板。的模板。DNADNADNADNA产产量在量在量在量在g/mgg/mgg/mgg/mg组织组织组织组织之之之之间间间间。2 2、多聚多聚多聚多聚酶链酶链式反式反式反式反应应(polymerase chain reaction)(polymerase cha
5、in reaction)(polymerase chain reaction)(polymerase chain reaction)简简称技称技称技称技术术：技：技：技：技术实际术实际上是在上是在上是在上是在模板模板模板模板， 引物引物引物引物和和和和种脱氧核苷种脱氧核苷种脱氧核苷种脱氧核苷酸酸酸酸存在的条件下依存在的条件下依存在的条件下依存在的条件下依赖赖于于于于聚合聚合聚合聚合酶酶的的的的酶酶促合反促合反促合反促合反应应，技，技，技，技术术的特异性取决于引物和模板的特异性取决于引物和模板的特异性取决于引物和模板的特异性取决于引物和模板结结合的特异性。合的特异性。合的特异性。合的特异性。 反
6、反反反应应分分分分三步三步三步三步：变变性性性性（denaturationdenaturationdenaturationdenaturation）；）；）；）；退火退火退火退火（annealingannealingannealingannealing）；）；）；）；延伸延伸延伸延伸（extensionextensionextensionextension），反），反），反），反应过应过程程程程见图见图。模板模板模板模板DNADNADNADNA在在在在94949494条件下条件下条件下条件下变变性形成性形成性形成性形成单链单链； 在在在在55555555条件下根据目的条件下根据目的条件下根据目
7、的条件下根据目的基因两基因两基因两基因两侧侧序列序列序列序列设计设计的引物分的引物分的引物分的引物分别别与其同源序列与其同源序列与其同源序列与其同源序列结结合；合；合；合；72727272下在耐下在耐下在耐下在耐热热性性性性DNADNADNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶Taq Taq Taq Taq 酶酶催化催化催化催化下，下，下，下， 在种在种在种在种dNTPdNTPdNTPdNTP存在条件下延伸形存在条件下延伸形存在条件下延伸形存在条件下延伸形成双成双成双成双链链。完成一次循。完成一次循。完成一次循。完成一次循环环。 接着又以新合成的接着又以新合成的接着又以新合成的接着又以新合成的DNADN
8、ADNADNA为为模板模板模板模板进进行同行同行同行同样样反反反反应应，如次往复循，如次往复循，如次往复循，如次往复循环环30303030次，由于每次循次，由于每次循次，由于每次循次，由于每次循环环目目目目标标DNADNADNADNA都以都以都以都以n n n n次次次次幂扩幂扩增，增，增，增，30303030次循次循次循次循环环后目的后目的后目的后目的DNADNADNADNA的量增加的量增加的量增加的量增加101010106 6 6 67 7 7 7倍。成功的倍。成功的倍。成功的倍。成功的PCRPCRPCRPCR反反反反应应要求反要求反要求反要求反应应有很好的特异性和相当的有很好的特异性和相
9、当的有很好的特异性和相当的有很好的特异性和相当的扩扩增效率。增效率。增效率。增效率。 要达此目的要达此目的要达此目的要达此目的PCRPCRPCRPCR反反反反应应要注意以下要注意以下要注意以下要注意以下问题问题：DNADNADNADNA模板模板模板模板：反：反：反：反应应中中中中DNADNADNADNA量在量在量在量在50 ng50 ng50 ng50 ng200 ng200 ng200 ng200 ng左右。且左右。且左右。且左右。且DNADNADNADNA纯纯 度度度度较较高，以增加反高，以增加反高，以增加反高，以增加反应应特异性。特异性。特异性。特异性。dNTPdNTPdNTPdNTP:
10、 : : :反反反反应应体系中达体系中达体系中达体系中达100M100M100M100M200M200M200M200M。MgMgMgMg2+2+2+2+：MgMgMgMg2+2+2+2+是是是是TaqTaqTaqTaq酶酶的的的的辅辅基基基基浓浓度在度在度在度在2.0 mM2.0 mM2.0 mM2.0 mM左右，左右，左右，左右，浓浓度太低度太低度太低度太低TaqTaqTaqTaq 酶酶活力降低；太高反活力降低；太高反活力降低；太高反活力降低；太高反应应特异性降低；特异性降低；特异性降低；特异性降低；引物引物引物引物：根据目的基因两：根据目的基因两：根据目的基因两：根据目的基因两侧侧特定序
11、列特定序列特定序列特定序列设计设计。引物引物引物引物约约20 nt20 nt20 nt20 nt左左左左 右右右右，含量含量含量含量在在在在40 40 40 40 70707070之之之之间间，引物内部不能有回文，引物内部不能有回文，引物内部不能有回文，引物内部不能有回文 序列，引物序列，引物序列，引物序列，引物端不能互端不能互端不能互端不能互补补；TaqTaqTaqTaq酶酶：它是从嗜：它是从嗜：它是从嗜：它是从嗜热热杆菌中提取的耐杆菌中提取的耐杆菌中提取的耐杆菌中提取的耐热热性性性性 DNA DNA DNA DNA 聚合聚合聚合聚合酶酶， 在在在在95959595时时30 min30 mi
12、n30 min30 min还还有有有有50505050活力；活力；活力；活力；变变性温度性温度性温度性温度：在：在：在：在9393939395959595之之之之间间使模板充分使模板充分使模板充分使模板充分变变性。性。性。性。复性温度复性温度复性温度复性温度：55555555左右，此温度左右，此温度左右，此温度左右，此温度选择选择是根据模板和引物配是根据模板和引物配是根据模板和引物配是根据模板和引物配 对结对结合合合合强强弱而定，弱而定，弱而定，弱而定， 它是反它是反它是反它是反应应特异性的决定因素。特异性的决定因素。特异性的决定因素。特异性的决定因素。延伸温度延伸温度延伸温度延伸温度：707
13、0707072727272，为为 Taq Taq Taq Taq 酶酶最适反最适反最适反最适反应应温度。温度。温度。温度。三、三、实验仪器、材料与器、材料与试剂1 1、实验仪器与材料器与材料： 台式高速冷台式高速冷冻离心机，恒温水浴，真空离心机，恒温水浴，真空泵，PCRPCR仪，台式冷，台式冷冻离心机、离心机、灭菌的微量离心管、凝胶菌的微量离心管、凝胶电泳系泳系统，凝胶成像，凝胶成像系系统，冰箱、微量移液器、，冰箱、微量移液器、组织匀匀浆器，制冰机，一次性器，制冰机，一次性使用塑料手套和乳胶手套，使用塑料手套和乳胶手套，猪肝猪肝组织。2 2、实验试剂： 细胞裂解胞裂解缓冲液冲液 10 mM T
14、ris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA 10 mM Tris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS(pH 8.0), 1% SDS，70% 70% 乙醇，异丙醇，醋酸乙醇，异丙醇，醋酸钾( (pH=4.8) pH=4.8) 60ml60ml的的5mol/L KAc, 11.5mL 5mol/L KAc, 11.5mL 冰醋酸，冰醋酸，28.5 ml H28.5 ml H2 2OO，TE TE (pH 8.0)(pH 8.0)或无菌水，或无菌水，无无DNaseDNase的的RNase ARNase A (10mg/ml) (10mg/ml)，蛋
15、白蛋白酶K(20 mg/mL)K(20 mg/mL)； TaKaRa TaqTaKaRa Taq (5U/ (5U/ L)L)，10PCR Buffer (Mg10PCR Buffer (Mg2+2+ Plus) Plus)，dNTP Mixture (each 2.5 mM)dNTP Mixture (each 2.5 mM)，猪肝基因，猪肝基因组DNADNA，引物，引物（Forward primer and Reverse primer)Forward primer and Reverse primer)。四、四、实验操作步操作步骤（一）、（一）、猪肝猪肝组织DNADNA的抽提的抽提1 1
16、、切下、切下10-20 mg 10-20 mg 组织，在，在液氮液氮中碾磨成粉末。中碾磨成粉末。2 2、将粉末、将粉末转入入1.5 mL 1.5 mL 离心管中，加离心管中，加0.6 mL 0.6 mL 细胞裂解胞裂解 缓冲液冲液和和3 3 L L 蛋白蛋白酶K K，混匀，置于，混匀，置于55 55 水浴中水浴中3 h 3 h 以上以上, ,但不要超但不要超过16 h16 h。3 3、消化液降至室温，然后加入、消化液降至室温，然后加入 2 2 LL无无DNaseDNase的的RNaseRNase A A，混匀。，混匀。37 37 水浴中放置水浴中放置0.5 h0.5 h。4 4、将、将样品降至
17、室温，加入品降至室温，加入 200 200L L 醋酸醋酸钾溶液溶液，剧烈震烈震荡 20 sec 20 sec 使其充分混合。冰上放置使其充分混合。冰上放置5 min5 min。5 5、12000 g 12000 g 离心离心 5 min 5 min （4 4 ）。）。6 6 6 6、将上清液、将上清液、将上清液、将上清液转转移到一个新离心管中，加移到一个新离心管中，加移到一个新离心管中，加移到一个新离心管中，加0.6 mL 0.6 mL 0.6 mL 0.6 mL 异丙醇异丙醇异丙醇异丙醇。 充分混匀，充分混匀，充分混匀，充分混匀， 12000 g 12000 g 12000 g 12000
18、 g 离心离心离心离心 5 min 5 min 5 min 5 min （4 4 4 4 ）。）。）。）。7 7 7 7、去掉上清，加入、去掉上清，加入、去掉上清，加入、去掉上清，加入0.6 mL 0.6 mL 0.6 mL 0.6 mL 70% 70% 70% 70% 乙醇乙醇乙醇乙醇。颠颠倒离心管数次，倒离心管数次，倒离心管数次，倒离心管数次， 12000 g 12000 g 12000 g 12000 g 离心离心离心离心 1 min 1 min 1 min 1 min（4 4 4 4）。）。）。）。8 8 8 8、去掉上清，空气中干燥、去掉上清，空气中干燥、去掉上清，空气中干燥、去掉上
19、清，空气中干燥 DNA DNA DNA DNA沉淀沉淀沉淀沉淀 15 min 15 min 15 min 15 min。9 9 9 9、将、将、将、将DNADNADNADNA沉淀沉淀沉淀沉淀溶解溶解溶解溶解于于于于 100 100 100 100 L TE L TE L TE L TE 或水中。或水中。或水中。或水中。10101010、浓浓浓浓度和度和度和度和纯纯纯纯度度度度测测测测定：定：定：定： OD OD OD OD260260260260/OD/OD/OD/OD280280280280； 1 OD 1 OD 1 OD 1 OD260260260260= 50 = 50 = 50 = 5
20、0 g/ mLg/ mLg/ mLg/ mL1、设计、设计PCR反应程序反应程序 9494预变性性2 min2 min后开始以下循后开始以下循环 94 30 sec94 30 sec 55 30 sec 25 cycles 55 30 sec 25 cycles 72 30 sec 72 30 sec 72 5 min 72 5 min； 4 4 冷却恒定。冷却恒定。（二）、（二）、PCR扩增基因片断扩增基因片断2 2 2 2、在薄壁管中，依次加入以下各成分：、在薄壁管中，依次加入以下各成分：、在薄壁管中，依次加入以下各成分：、在薄壁管中，依次加入以下各成分： ddHddHddHddH2 2
21、2 2O:O:O:O: 18.0 18.0 18.0 18.0 L L L L 10buffer: 2.5 10buffer: 2.5 10buffer: 2.5 10buffer: 2.5 L L L L dNTPs(2.5 dNTPs(2.5 dNTPs(2.5 dNTPs(2.5 mMmMmMmM) ) ) ) L L L L Forward primer (10 Forward primer (10 Forward primer (10 Forward primer (10 M M M M) ) ) ) : 1.0 : 1.0 : 1.0 : 1.0 L L L L Reverse p
22、rimer (10 Reverse primer (10 Reverse primer (10 Reverse primer (10 M M M M) ) ) ) : 1.0 : 1.0 : 1.0 : 1.0 L L L L Taq DNA Taq DNA Taq DNA Taq DNA 酶酶(5U/(5U/(5U/(5U/ L L L L) ) ) ) : 0.5 : 0.5 : 0.5 : 0.5 L L L L Template DNA(20ng/ Template DNA(20ng/ Template DNA(20ng/ Template DNA(20ng/ L L L L): 1.
23、0 ): 1.0 ): 1.0 ): 1.0 L L L L 总总体体体体积积 25 25 25 25 L L L L3 3 3 3、混匀后，离心、混匀后，离心、混匀后，离心、混匀后，离心2-3 sec2-3 sec2-3 sec2-3 sec，将，将，将，将PCRPCRPCRPCR薄壁管放入薄壁管放入薄壁管放入薄壁管放入PCRPCRPCRPCR仪仪的的的的 样样品槽中，品槽中，品槽中，品槽中，选择预选择预先先先先设设定的程序，按定的程序，按定的程序，按定的程序，按STARTSTARTSTARTSTART键键启启启启动动 PCR PCR PCR PCR仪仪。4 4 4 4、采用、采用、采用、采
24、用琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳分析泳分析泳分析泳分析PCRPCRPCRPCR产产物的量、引物的量、引物的量、引物的量、引 物物物物扩扩增的特异性。增的特异性。增的特异性。增的特异性。五、五、实验结果与分析果与分析 1 1 1 1、提取的猪肝、提取的猪肝、提取的猪肝、提取的猪肝DNADNADNADNA进进行行行行电电泳后，采用凝胶成像系泳后，采用凝胶成像系泳后，采用凝胶成像系泳后，采用凝胶成像系统统 进进行行行行拍照拍照拍照拍照并并并并对电对电泳泳泳泳图谱进图谱进行适当的行适当的行适当的行适当的分析分析分析分析。 2 2 2 2、对对PCRPCRPCRPCR扩扩增的基因增的基因增的
25、基因增的基因进进行行行行电电泳后的泳后的泳后的泳后的图谱图谱拍照拍照拍照拍照并并并并进进行行行行 合理的合理的合理的合理的分析分析分析分析。六、思考题：六、思考题：1 1 1 1、为为了了了了获获得得得得较为较为完整的基因完整的基因完整的基因完整的基因组组DNADNADNADNA，在，在，在，在实验应实验应注意注意注意注意 什么什么什么什么问题问题？ 2 2 2 2、简简述述述述PCRPCRPCRPCR基本原理；基本原理；基本原理；基本原理；3 3 3 3、进进行一次成功的行一次成功的行一次成功的行一次成功的PCRPCRPCRPCR反反反反应应应应注意哪些注意哪些注意哪些注意哪些问题问题？基因组DNA电泳图RNA提取电泳图PCR结果图 THANKS! THANKS!
