第四章酶工程

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1、第四章第四章 酶工程酶工程主讲人：黄 循 吟一、概述问题：1、什么是酶？酶作为催化剂有何特点？ 2、什么是酶工程？发展历程如何？ 3、酶工程研究的内容是什么？酶 ：是具有催化活性的生物物质。作为催化剂，酶具有催化剂的共性：1）、只需要很少量就可以催化大量物质反应，在反应前后其质量不变；2）、它只能加速可逆反应达到平衡的时间，而不能改变反应的平衡点；3）、只能催化热力学允许发生的反应。 作为生物催化剂，酶具有自己的特性：1）、催化效率高；2）、专一性强；3）、反应条件温和；4）、活力可被调控；5）、对环境条件比较敏感。酶工程：利用酶的特异性催化功能或微生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定功能，并通

2、过工程化为人类生产有用的产品及提供有益服务的技术。酶 工程发展所经历的历程：1）、自然酶的开发应用；2）、固定化酶和固定化细胞；3）、多酶 反应器；4）、仿生技术。酶工程的技术内容：1）、各类自然酶的开发和生产；2）、酶的分离、纯化及鉴定技术；3）、固定化技术；4）、多酶 反应器的研制和应用；5）、与其它生物工程技术领域的交叉和渗透；6）、酶分子的改造与修饰；7）、酶的模仿技术；8）、酶 的动力学研究。其中，固定化技术是酶工程的核心技术。为什么这么说呢？ 因为只有固定化技术的发展和应用，酶在工业生产中的应用价值才得以真正体现。二、酶的开发与生产1、目的酶生产菌株的获得：1）、从自然界分离筛选；

3、2）、人工诱变育种；3）、遗传工程育种。2、酶的生产方式：通过各种方法得到优良的菌株，是酶生产的先决条件。要想有效地进行酶生产，还必须探讨该菌种产酶的最适培养条件。1）、培养方法；2）、工业大规模生产的工程和工艺条件；3）、是胞内酶还是胞外酶？4）、分离纯化的方法和条件；5）、酶纯度的鉴定。三、固定化技术（一）、概述：问题：什么是固定化技术？它产生的背景和发展历史如何？ 固定化技术是通过化学或物理方法把酶或细胞束缚在一定的区域内，将之固定后再进行催化作用。它产生的背景和发展历史：1）、发现于1916年；2）、诞生于60年代；3）、成熟于70年代；4）、实用化并大规模应用于80年代。（二）、酶的

4、固定化方法 自60年代以来，科学家对酶和细胞的固定化技术进行了大量的研究，迄今为止，具体的固定化方法多达一百种以上。根据所用载体及操作方法的差别可分为三类：1、载体结合法（将酶定位于载体表面）：1）、共价结合法：这是一种广泛应用的制备固定酶的方法。是将酶分子上非活性部位的功能基团与载体上的活性基团进行共价结合的方法。 在用共价结合法进行酶固定时，首先是利用化学方法将载体活化，再与酶分子上的某些基团反应，形成共价键，将酶结合在载体上。载体活化是重要问题，活化过程首先要考虑使载体获得能与酶分子特定基因产生特异反应的活泼基因，而且要求与酶偶联时反应条件要尽可能温和。目前用于载体活化的方法有：酰基化、

5、芳基化、烷基化及氨甲酰基化等反应。2）、吸附法：利用载体表面性质或电荷作用将酶固定到载体表面的方法。物理吸附法：将酶的水溶液与具有高吸附能力的载体混合，然后洗去不吸附的杂质和酶，可得到固定化酶。 主要靠范德华力、氢键、疏水作用及静电作用。这些作用是非特异性的，一般不单独使用，而常与交联法同时使用。离子吸附法：是将解离状态的酶溶液与离子交换树脂混合后，酶蛋白通过离子键与树脂结合在一起。然后洗去末结合的杂质和酶，即可得到固定化酶。 这种方法 结合能力较强，如多糖离子交换剂每克载体吸附酶蛋白量为50150mg。影响载体吸附的因素较多。如溶液PH值、离子浓度、温度、酶蛋白浓度及载体比表面积等（具体的影

6、响同学自学）。优缺点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，固定化过程可能同时实现了纯化，固定化酶的活力较高。 最适固定酶量无法估计，结合力不强，容易脱落，污染产物等。2、包埋法 将酶或细胞定位于凝胶网格或微囊内的技术。主要用于水溶液性小分子底物的转化反应。1）、凝胶包埋法：将酶 或细胞定在具有网格结构的高分子凝胶中。 常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等合成高分子材料以及卡拉胶、海藻胶、琼脂、明胶及胶原等天然材料大分子。基本操作过程：优缺点（P111）：2）、微囊包埋法：包有酶的微囊也称为人工细胞。制备微囊固定化酶的方法主要有界面聚合法、界面沉淀法和液中干燥法等。 常用界面聚合法即利用

7、不溶于水的高聚物单体在油-水界面上聚合成膜的过程将酶包裹起来。3、交联法 应用多功能或双功能试剂在酶与酶或酶与载体之间进行交联固定化的技术。（三）、细胞的固定化技术1、定义：将细胞限制或定位于特定的空间位置的方法 。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。2、固定化细胞分为三种类型：一是固定化死细胞。细胞经过处理后只保留所需酶的活性，而其它的酶系和整个细胞都已失活；二是固定化休眼细胞。细胞仍处于生存状态，但不再生长繁殖；三是固定化增殖细胞。固定化的细胞继续生长繁殖。 由于固定化细胞是利用细胞内酶，因此要求：1）、底物和产物易于透过细胞膜；2）、细胞内不存在产物分解系统及其它副反应。若存

8、在副反应应具有消除措施。3、方法：除了某些细胞有自身凝聚作用外，通常用于细胞固定化的方法是物理吸附法和天然凝胶包埋法。1）、无载体法：靠细胞自身絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性方法实现固定化。本法优缺点：可获得高浓度细胞，固定化条件温和。但机械强度差。2）、载体结合法：本法是直接将细胞悬浮液直接与水不相溶性载体相结合的固定方法。本法优缺点：操作简单，符合细胞的生长条件，不影响细胞生长及酶活性。但吸附容量小，结合强度低。3）、包埋法：将细胞定位于凝胶网格内的技术。优缺点：细胞容量大，操作简便，酶活力回收率高。但扩散阻力大，易改变酶的动力学行为，不适于催化大分子底物与产物的转

9、化反应。（四）、固定化方法和载体的选择1、固定化方法 的选择：一般而言，对酶的固定化多采用共价结合、离子结合和物理吸附法等，有时还可跟交联法配合使用；而固定化细胞则以包埋法为主。考虑因素：1）、安全性；2）、固定化酶操作的稳定性；3）、成本。2、载体的选择：酶及细胞固定化过程中所用的水不溶性固体支持物称为载体 或基质。它的来源、结构及性质各不相同。因此在固定化过程 中，需根据酶促反应性质、底物类型及固定化方法，选用相应的载体。方法 不同使用的载体也不同（P114表4-1）。载体 选择的条件：1）、固定化过程不引起酶的变性；2）、对酸碱度有一定的耐受力；3）、有一定的机械强度；4）、有一定亲水性

10、及良好的稳定性；5）、有一定疏松网状结构，颗粒均匀；6）、共价结合时具有可活化基团；7）、有耐受酶及微生物的能力；8）、廉价易得。（五）、固定化生物催化剂的性质和特点1、固定化酶的性质和特点：1）、酶活力的变化：酶固定化后活力大都有所下降。其原因可能是：一是活性部位的重要氨基酸侧链基团与载体相结合；二是酶的空间结构发生变化；三是酶志底物结合时产生空间位阻效应；四是包埋法固定化酶还有底物和产物扩散阻力的增大。2）、酶稳定性变化：在酶转化反应中，天然酶对温度、有机溶剂、极端PH值及金属离子等十分敏感，稳定性差；天然酶使用后通常不回收，不能连续使用，使用效率低，产品成本高，产品质量受影响。固定化酶的

11、最大特点是既有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂的特性。与天然酶相比，固定化酶的优点是：一是稳定性比天然酶高，使用半衰期比较长；二是反应后酶与底物容易分开，并可长期反复使用；三是反应液中没有残留酶，因此易于纯化，产品质量高；四是具有一定的机械强度，成型后装入酶反应器，可实现连续倾向自动化控制，并使设备小型化，节省能量；五是酶的利用率高，产品成本低；六是转化过程基本无三废排出。因此称为（无公害酶）。2、固定化细胞的性质和特点细胞固定化后，其中酶的性质，稳定性与固定化酶一样，但因其颗粒微小，难以截留或定位。固定化细胞既有细胞特征又有生物催化剂功能，也具有固相催化剂的特点。其优点主要表现在：1）、无

12、须进行酶的分离纯化，节省起始投资；2）、细胞保持原始的生命活动状态，酶在细胞内环境中稳定性较高，进行完整的细胞固定化时，酶活力损失少；3）、可利用细胞内辅助因子再生系统和酶系统，催化一系列反应；4）、细胞生长停滞期短，细胞密度大、反应快、抗污染能力强；5）、可以连续使用，大大节约生长细胞耗用的养料；6）、应用固定化细胞生物反应器进行连续反应，可避免反馈抑制和产物的分解；7）、固定化细胞的稳定性大都比游离细胞高。在使用固定化细胞时，要注意以下问题：一是必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则会影响产物纯度；二是必须抑制细胞内蛋白酶对所需酶的分解作用；三是细胞内有多种酶存在，会产生副作用产物，必须设

13、法抑制非目的酶的活性，如加入去污剂，热处理等；四是固定化细胞利用的主要是胞内酶，而细胞膜会对底物和产物的进出造成障碍，因此主要用于小分子底物的反应，而不适用于大分子 底物。无论采用哪种方法，都必须采取适当的措施来提高细胞膜的通透性，以提高酶的活力及转化效率。意义：固定化细胞具有极其良好的工业应用前景，它对传统发酵工艺的技术革新改造具有极其重要的影响，有可能逐渐取代发酵工艺。固定化酶（细胞）的指标：相对酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值。酶的活力回收率固定化酶的总活力与用于固定化的酶总活力之百分比。固定化酶的半衰期固定化酶的活力下降到初始活力一半所经历的时间。用t1/2表示。四、

14、酶分子的改造与修饰技术问题：1、为什么要对酶分子进行改造与修饰？什么是改造？什么是修饰？ 2、酶分子改造与修饰的目的与任务是什么？ 3、理论依据是什么？ 4、手段和方法如何？改造原因：目的和任务：酶分子改造和修饰的内容：酶是具有催化活性的生物物质。绝大多数是蛋白质。因此酶分子改造和修饰的内容是通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的化学修饰，对酶蛋白进行分子改造，以改变酶分子物理化学性质及生物活性或赋给酶新的功能，并最终达到人工设计合成高效的具有生物活性的非天然酶分子。这种技术也称为生物分子工程。改造改变蛋白质的一级结构的过程。修饰把侧链基团的共价变化。手段和方法 ：1）、酶蛋白主链经过水解酶

15、的有限水解作用，去掉部分主链或置换一级结构上某些aa残基，使活性部位的构象发生某些变化，而从达到改性与改构的目的；2）、用双功能基团试剂将酶蛋白分子间、亚基间或分子内不同肽链部分间进行交联，使分子加固，提高其稳定性；3）、改变基团的电化学性质，分子内基团的相互作用力与其它物质之间的反应性，从而使酶蛋白分子侧链基团发生化学改变；4）、利用小分子或大分子 物质对活性部位或活性部位之外的侧链基团进行共价化学修饰（如果所用的化学修饰剂是水不溶性的，就成为固定化酶），以改变酶的稳定性。（一）、酶的化学修饰是指用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子某些部分去掉或改变为其它基团，从而改变酶

16、的化学性质，最后达到改变酶的催化性质目的。（二）、蛋白质工程技术对酶的定向改造 蛋白质工程技术对酶的定向改造，是在基因工程的基础上，通过对结构基因的改造来达到改造酶分子的结构，从而改变酶的性能甚至创造自然界中尚末发现的新酶的目的。（三）、酶分子改造后的性质及其应用前景1、性质：1）、改变酶分子物理化学性质；2）、改变酶学的主要参数；3）、增加酶对高温、低温、极端PH值的稳定性；4）、防止稀释溶液和变性剂作用下变性；5）、增强对蛋白酶水解作用的抵抗力；6）、降低生物识别能力（膜结合、免疫原性）和提高对生物膜的渗入或通透性；7）、延长体内停滞时间；8）、改变酶分子对体内不同组织的亲和性，使酶在有机溶剂中保持活力；9）、与抑制剂作用降弱或提高，提高酶学活性；10）、产生新的生物活性与功能；11）、对多功能酶可调整其酶谱等。2、发展前景；第一是开发新一代生化药物；第二是为工业开发新型酶制剂；第三是为生物工程的其它技术指供有效的工具；第四是在理论研究中具有重要意义。