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1、蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定1 蛋白质性质鉴定蛋白质性质鉴定 蛋蛋白白质质分分析析鉴鉴定定是是蛋蛋白白质质研研究究中中的的一一个个最最基基本本技技术术, ,是是确确定定蛋蛋白白质质产产品品的的是是与与非非的的问问题题, ,尤尤其其是是在在研研究究新新的的蛋蛋白白质质组组分分时时显显得得更更重重要要。研研究究一一个个新新的的蛋蛋白白质质首首先先要要从从它它的的基基本本性性质质作作为为突突破破口口,然然后后根根据据它它的的基基本本性性质质进进行行分分离离纯纯化化,最最终终用用纯纯品品对对其其进进行行分分析析鉴鉴定定。如如果果对对蛋蛋白白质质的的基基本本性性质质尚尚未未搞搞清清楚楚,工工作作起起
2、来来将将会会困困难难重重重重。因因此此,蛋蛋白白质质研研究究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。2蛋白质鉴定的主要参数蛋白质鉴定的主要参数 蛋蛋白白质质分分子子是是非非常常复复杂杂的的生生物物大大分分子子, ,能能代代表表其其特特征征参参数数很很多多. .但但在在普普通通实实验验室室能能够够进进行行测测定定的的、最最常常用用的的参参数数,归纳起来主要有以下几种。归纳起来主要有以下几种。(1)(1)蛋白质的质量鉴定蛋白质的质量鉴定( (分子量分子量) )(2)(2)蛋白质带电性鉴定(等电点)蛋白质带电性鉴定(等电点)(3)(3)蛋蛋白白质质结结
3、构构鉴鉴定定( (一一、二二级级结结构构、晶晶体体、肽肽谱谱、NC-NC-末末端端) )(4)(4)蛋白质生物学功能鉴定蛋白质生物学功能鉴定( (生物活性、比活、酶促动力学生物活性、比活、酶促动力学) )(5)(5)免疫学鉴定(抗原免疫学鉴定(抗原- -抗体反应、酶联免疫反应)抗体反应、酶联免疫反应) 3意义意义n n 确定分子大小n n 从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基酸组成n n 验证已测定的一级结构是否正确4常用测定分子量的方法常用测定分子量的方法n n SDS-PAGEn n 凝胶过滤层析n n 质谱n n 核磁共振5一、一、SDSPAGE测定蛋白质的相对分子量测定蛋白质的相对分子
4、量6【基本原理基本原理】 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率,聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率,用它分离、检测蛋白质混合样品,主要是根用它分离、检测蛋白质混合样品,主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。 这种迁移率的不同,就蛋白质分子本身这种迁移率的不同,就蛋白质分子本身而言,主要与其所带净电荷以及分子量和形而言,主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。状有关。7n n当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠(酸钠(SDS)时,则得电泳迁移率的大小只)时,则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量,从而可推测蛋白取决于
5、蛋白质的分子量,从而可推测蛋白质的分子量。质的分子量。8SDS的作用原理的作用原理 SDS是一种阴离子去污剂,能够与蛋白是一种阴离子去污剂,能够与蛋白质结合,破坏蛋白质分子之间以及与其它物质结合,破坏蛋白质分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。变原有的空间构象。9 蛋白质分子一经结合了一定量的蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子,阴离子,所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量,从而所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量,从而消除了不同种类蛋白质间消除了不同种类蛋白质间电荷的差异电荷的差异。 并且由于分子量越大的蛋白质结
6、合的并且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越越多,所带负电荷也越多,这就使各蛋白质多,所带负电荷也越多,这就使各蛋白质-SDS复复合物的电荷密度趋于一致。合物的电荷密度趋于一致。10 同时,不同蛋白质的同时,不同蛋白质的SDS复合物复合物形状形状也相也相似,均是似,均是长椭圆状长椭圆状。 因此,在电泳过程中,迁移率仅取决于蛋因此,在电泳过程中,迁移率仅取决于蛋白质白质-SDS复合物的大小,也可以说是取决于蛋复合物的大小,也可以说是取决于蛋白质白质分子量的大小分子量的大小,而与蛋白质原来所带电荷,而与蛋白质原来所带电荷量无关。量无关。11 当当SDS的总量为蛋白量的的总量为蛋白量的310倍且倍且
7、SDS单位浓度大于单位浓度大于1 mol/L时,这两者的结合是定时,这两者的结合是定量的,大约每克蛋白质可结合量的,大约每克蛋白质可结合1.4克克SDS。12 组成组成 该电泳系统由该电泳系统由两层不连续聚丙烯酰胺凝胶两层不连续聚丙烯酰胺凝胶组成组成上层胶上层胶: :浓缩胶浓缩胶(stacking or concentration gel)(stacking or concentration gel) 浓浓 度度 2-5%2-5%,缓冲液,缓冲液pHpH值为值为6.86.8 下层胶:分离胶下层胶:分离胶(seperation or resolving gel)(seperation or re
8、solving gel) 浓浓 度度 5-20%5-20%,缓冲液,缓冲液pHpH值为值为8.38.31314 特点特点 具有很高的分辨力,这是因为它具有以下三种效应:具有很高的分辨力,这是因为它具有以下三种效应: 样品浓缩效应样品浓缩效应 A. A. 分离胶的阻力(孔径小),分离胶的阻力(孔径小),浓缩作用浓缩作用 B. B. 缓冲液离子成分的不同缓冲液离子成分的不同 (甘氨酸离子(甘氨酸离子 (慢)氯离子(快)(慢)氯离子(快) ,压缩作用压缩作用 C .C .浓缩胶与分离胶之间浓缩胶与分离胶之间pHpH值差值差(分离胶(分离胶pHpH高,高, 调节慢离子的迁移率)调节慢离子的迁移率) 1
9、5 分子筛效应分子筛效应 大分子运动慢,小分子运动快大分子运动慢,小分子运动快 电荷效应电荷效应 带电荷多的运动快,带电荷少的运动慢带电荷多的运动快,带电荷少的运动慢16【器材器材】 电泳仪、电泳仪、 垂直板电泳槽、垂直板电泳槽、 进样器、进样器、 乳头吸管、乳头吸管、 50 ml小烧杯小烧杯17【试剂试剂】1标准蛋白质:标准蛋白质: 182.30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺丙烯酰胺29.2 g, 甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺0.8 g, 加水至加水至100 ml,棕色瓶,棕色瓶4保存。保存。3.1.5 mol /L Tris-Hcl分离胶缓冲液分离胶缓冲液pH8.8(4x) 取取18
10、.15 g Tris, 用用1M HCl调调pH至至 8.8,加水,加水 至至100 ml,4保存保存4.0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液pH6.8 (4x) 取取5.98 g Tris,用,用1N HCl调至调至pH6.8,加水至,加水至 100 ml,4保存。保存。19 5. 5. 电极缓冲液(电极缓冲液(电极缓冲液(电极缓冲液(pH 8.3pH 8.3) 取取取取 14.49 g14.49 g甘氨酸,甘氨酸,甘氨酸,甘氨酸,3.02 g Tris3.02 g Tris,加,加,加,加100 ml 100 ml 10%SDS 10%SDS,加水至,加水至,加水
11、至,加水至1 1 升,升,升,升,4 4保存。保存。保存。保存。6. 10% SDS6. 10% SDS 取取取取10g SDS10g SDS,加水至,加水至,加水至,加水至100 ml100 ml,完全溶解后室温保存。,完全溶解后室温保存。,完全溶解后室温保存。,完全溶解后室温保存。7. 10%7. 10%过硫酸铵溶液(过硫酸铵溶液(过硫酸铵溶液(过硫酸铵溶液(APAP) 临用前现配。临用前现配。临用前现配。临用前现配。208 8染色液(染色液(染色液(染色液(0.25% R-2500.25% R-250、50%50%甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、7%7%乙酸)乙酸)乙酸)乙酸) 考马斯亮蓝考马斯
12、亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝R-250 2.5 gR-250 2.5 g、 甲醇(可用无水乙醇代替)甲醇(可用无水乙醇代替)甲醇(可用无水乙醇代替)甲醇(可用无水乙醇代替) 500 ml500 ml、70 ml70 ml冰乙酸,冰乙酸,冰乙酸,冰乙酸, 溶解后补足水至总体积溶解后补足水至总体积溶解后补足水至总体积溶解后补足水至总体积1000 ml1000 ml。9 9脱色液(脱色液(脱色液(脱色液(30%30%甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、7%7%乙酸)乙酸)乙酸)乙酸) 甲醇(可用无水乙醇代替)甲醇(可用无水乙醇代替)甲醇(可用无水乙醇代替)甲醇(可用无水乙醇代替) 300 ml300 ml,冰乙酸,
13、冰乙酸,冰乙酸,冰乙酸70 ml70 ml, 补足水至补足水至补足水至补足水至1000 ml1000 ml。2110样品缓冲液(样品缓冲液(2x) HH2 2O 2.4 mlO 2.4 ml,浓缩胶缓冲液,浓缩胶缓冲液,浓缩胶缓冲液,浓缩胶缓冲液1.0 ml1.0 ml、甘油、甘油、甘油、甘油0.8 ml0.8 ml、10% 10% SDS 3.2 ml SDS 3.2 ml,b b b b- -硫基乙醇硫基乙醇硫基乙醇硫基乙醇0.4 ml0.4 ml,0.025%0.025%(W/VW/V)溴)溴)溴)溴 酚兰酚兰酚兰酚兰0.2 ml0.2 ml。11TEMED(四甲基乙二胺)(四甲基乙二胺
14、) TetramethylethylenediamineTetramethylethylenediamine 22分离胶和浓缩胶的配制分离胶和浓缩胶的配制23n n将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中,上层小心覆盖一层正丁醇。将胶中,上层小心覆盖一层正丁醇。将胶板垂直放于室温下,待分离胶聚合完板垂直放于室温下,待分离胶聚合完全后,倾去正丁醇并用滤纸吸干。全后,倾去正丁醇并用滤纸吸干。24灌胶时要注意灌胶时要注意n n催化剂不能加多了,加完催化剂要充分混匀,催化剂不能加多了,加完催化剂要充分混匀,且立即灌胶,且立即灌胶,n n灌胶时要保持小烧杯摇动,防止烧杯内的胶灌
15、胶时要保持小烧杯摇动,防止烧杯内的胶聚合。聚合。n n灌胶动作要快,吸一满管的凝胶后,立即沿灌胶动作要快,吸一满管的凝胶后,立即沿胶板的一角灌入,而且要防止气泡的产生。胶板的一角灌入,而且要防止气泡的产生。25样品预处理样品预处理 取样品液与等体积样品缓冲液混合,取样品液与等体积样品缓冲液混合,取样品液与等体积样品缓冲液混合,取样品液与等体积样品缓冲液混合,100100加热加热加热加热1 12 2分钟。分钟。分钟。分钟。 待浓缩胶聚合完全后,小心移出梳子,然后将胶待浓缩胶聚合完全后,小心移出梳子,然后将胶待浓缩胶聚合完全后,小心移出梳子,然后将胶待浓缩胶聚合完全后,小心移出梳子,然后将胶板固定
16、于电泳装置上,上下槽各加入电极缓冲液。板固定于电泳装置上,上下槽各加入电极缓冲液。板固定于电泳装置上,上下槽各加入电极缓冲液。板固定于电泳装置上,上下槽各加入电极缓冲液。加样加样 用微量进样器加样。每个样品孔加入用微量进样器加样。每个样品孔加入用微量进样器加样。每个样品孔加入用微量进样器加样。每个样品孔加入20ul20ul样品。样品。样品。样品。同时加一个标准品。同时加一个标准品。同时加一个标准品。同时加一个标准品。26【电泳电泳】 在在100 V的电压下电泳,当样品全部的电压下电泳,当样品全部进入分离胶时,加大电压至进入分离胶时,加大电压至100 V,当溴,当溴酚蓝达到胶底部,关闭电源。酚蓝
17、达到胶底部,关闭电源。27【染色染色】 从电泳装置上卸下玻板,小心橇开玻从电泳装置上卸下玻板,小心橇开玻板取出凝胶,放入染色液中染色板取出凝胶,放入染色液中染色30 min。28【脱色脱色】 移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。色为止。29【观察电泳结果观察电泳结果】 根据标准样品,大致推测蛋白质的分子根据标准样品,大致推测蛋白质的分子量。量。 用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端的距离,按下式计算相对迁移率溴酚蓝前沿距分离胶顶端的距离,按下式计算相对迁移率(R R):): 相
18、对迁移率相对迁移率 = 样品迁移距离(样品迁移距离(cm)/ 指示剂迁移距离指示剂迁移距离(cm) 以标准蛋白质以标准蛋白质MMr r的常用对数(的常用对数(lg lgMMr r)对)对相对迁移率相对迁移率作图,作图,得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率,从标准得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率,从标准曲线上查出其相对分子量的常用对数,再换算出其相对分子曲线上查出其相对分子量的常用对数,再换算出其相对分子量。量。3031二、根据化学组成测定分子量二、根据化学组成测定分子量32二、凝胶过滤法二、凝胶过滤法 凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量凝胶过滤法分离蛋白质的原理是
19、根据蛋白质分子量的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶具有特定的蛋的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶具有特定的蛋白质分子量范围,在此范围内,分子量的对数和洗脱体白质分子量范围,在此范围内,分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此,用几种已知分子量的蛋白质积之间成线性关系。因此,用几种已知分子量的蛋白质为标准,进行凝胶层析,以每种蛋白质的洗脱体积对它为标准,进行凝胶层析,以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图,绘制出标准洗脱曲线。未知蛋们的分子量的对数作图,绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析,根据其所用的洗脱白质在同样的条件下进行凝胶层析,根据其所用的洗脱体积,从
20、标准曲线上可以求出此未知蛋白质对应的分子体积,从标准曲线上可以求出此未知蛋白质对应的分子量。量。33层析法装置层析法装置343536 优点优点 分离条件温和分离条件温和 回收率高回收率高 重复性好重复性好 设备简单设备简单 缺点缺点 对样品的稀释大对样品的稀释大 流速慢流速慢 操作费时操作费时3738三、质谱法三、质谱法【原理原理】 质质谱谱仪仪是是利利用用电电磁磁学学的的原原理理,使使带带电电的的样样品品离离子子按按质质荷荷比比进进行行分分离离的的装装置置。离离子子电电离离后后经经过过加加速速进进入入磁磁场场中中。其动能与加速电压及电荷其动能与加速电压及电荷Z Z有关。有关。Z Z:电荷数:
21、电荷数 ZeU=mvZeU=mv2 2/2 e/2 e:电荷:电荷(e = 1.60x10(e = 1.60x10-19-19C)C)U U:加速电压:加速电压m m:离子的质量:离子的质量v v:离子被加速后的运动速度:离子被加速后的运动速度39 具具有有速速度度v v的的带带电电离离子子进进入入质质谱谱仪仪的的电电磁磁场场中中,根根据据所所选选择的分离方式,最终实现各种离子按择的分离方式,最终实现各种离子按m/zm/z进行分离。进行分离。 根根据据质质量量分分析析器器的的工工作作原原理理,可可将将质质谱谱仪仪分分为为动动态态和和静静态态仪仪器器两两大大类类,静静态态仪仪器器采采用用稳稳定定
22、的的电电磁磁场场,按按空空间间位位置置来来区区别别m/zm/z不不同同的的离离子子。动动态态仪仪器器采采用用变变化化的的电电磁磁场场,按按时时间间不同来区分不同来区分m/zm/z不同的离子。不同的离子。 分分离离生生物物大大分分子子多多采采用用电电喷喷质质谱谱法法,属属于于动动态态质质谱谱仪仪。基基本本原原理理是是生生物物大大分分子子在在很很高高的的电电场场下下电电离离。样样品品溶溶液液以以很很低的流速,在高的电场下使生物分子从毛细管中流出來。低的流速,在高的电场下使生物分子从毛细管中流出來。40【方法方法】 样样品品溶溶液液以以很很低低的的流流速速(1-20l/(1-20l/分分钟钟) )从
23、从毛毛细细管管中中流流出出来来。在在毛毛细细管管的的柱柱头头上上施施加加一一个个高高电电压压(1-5kv)(1-5kv),使使柱柱头头液液体体雾雾化化成成很很细细的的带带电电液液滴滴,这这种种带带电电液液滴滴在在逆逆向向干干燥燥气气流流中中挥挥发发,使使液液滴滴表表面面电电荷荷密密度度增增大大。直直到到产产生生的的库库仑仑斥斥力力与与液液滴滴表表面面张张力力的的雷雷利利极极限限值值相相等等时时,液液滴滴就就会会发发生生爆爆裂裂,形形成成更更小小的的子子液液滴滴,这这些些子子液液滴滴又又被被蒸蒸发发,又又会会形形成成爆爆裂裂。如如此此循循环环下下去去,直直到到液液滴滴变变得得非非常常小小,它它的
24、的表表面面的的电电荷荷密密度度变变得得非非常常大大,形形成成很很强强的的电电场场,并并从从液液滴滴中中解解离离出出带带多多电电荷荷的的分分子子离离子子。这这些些离离子子是是靠靠吸吸附附上上或或丢丢失失若若干干质质子子而而形形成成的的,所所以以正正离离子子或或负负离离子子谱谱上上会会观观察察到到谱谱峰峰。生生物物大大分分子子在在ESIESI谱谱上上往往往往是是一一组组带带不不同同的的电电荷荷的的分子离子峰。分子离子峰。4142 核核磁磁共共振振波波谱谱(nuclear (nuclear magnetic magnetic resonance resonance spectroscopy, spe
25、ctroscopy, NMR).NMR).是是将将具具有有磁磁矩矩的的核核放放入入磁磁场场后后,用用适适宜宜的的频频率率的的电电磁磁波波照照射射,它它们们就就会会吸吸收收能能量量,发发生生原原子子核核能能级级的的跃跃迁迁,同同时时产产生生核核磁磁共共振振信信号号,得得到到核核磁磁共共振振波波谱谱。在在有有机机化化合合物物中中,经经常常用用于于1 1H H和和1313C C核核的的共共振振吸吸收收波波谱谱。在在生生物物学学方方面面主主要要研研究究生生物物大大分分子子的的结结构构和和分分子子量量。到到目目前前为为止止,采采用用1 1H H 2D-NMR2D-NMR(二二维维NMRNMR)能能解解决
26、决的的最最大大蛋蛋白白质质分分子子量量在在10000Da10000Da左左右右。如如果果采采用用杂杂核核多多维维NMRNMR技技术术,能能解解决决的的最最大大蛋蛋白白质分子量大在质分子量大在25000Da25000Da左右。左右。四、核磁共振波谱四、核磁共振波谱43方法方法机理机理分子量计算分子量计算关键技术关键技术特点特点电泳电泳分子表面电荷分子表面电荷电泳条带电泳条带(mR)SDS包裹包裹单链分子单链分子层析层析分子质量分子质量层析峰的位置层析峰的位置介质交联度介质交联度球形分子球形分子质谱质谱质荷比质荷比质谱峰直接标识质谱峰直接标识样品质子化样品质子化整体分子整体分子核磁核磁核磁共振波谱
27、核磁共振波谱核磁谱线计算核磁谱线计算磁场能量磁场能量整体分子整体分子几种测定蛋白质分子量的方法比较几种测定蛋白质分子量的方法比较44蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰45概 念 从广义上说:凡通过化学基团的引入或除去,从广义上说:凡通过化学基团的引入或除去,从广义上说:凡通过化学基团的引入或除去,从广义上说:凡通过化学基团的引入或除去,而使蛋白质共价结构发生改变,都可以称为蛋白而使蛋白质共价结构发生改变,都可以称为蛋白而使蛋白质共价结构发生改变,都可以称为蛋白而使蛋白质共价结构发生改变,都可以称为蛋白质的化学修饰。质的化学修饰。质的化学修饰。质的化学修饰。 包括两个方面包括两个方面包括两个方面包
28、括两个方面:(:(:(:(1 1)侧链基团的改变;)侧链基团的改变;)侧链基团的改变;)侧链基团的改变;(2(2)主链结构的改变,前者属于化学修饰的范畴,而主链结构的改变,前者属于化学修饰的范畴,而主链结构的改变,前者属于化学修饰的范畴,而主链结构的改变,前者属于化学修饰的范畴,而后者则属于基因重组和定点突变的方法。后者则属于基因重组和定点突变的方法。后者则属于基因重组和定点突变的方法。后者则属于基因重组和定点突变的方法。 46蛋白质化学修饰的意义蛋白质化学修饰的意义改变蛋白质的药代动力学改变蛋白质的药代动力学调节蛋白质的稳定性以及活性调节蛋白质的稳定性以及活性改变蛋白质的空间构象改变蛋白质的
29、空间构象47化学修饰的原理影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有:影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有:影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有:影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有:1 1 蛋白质功能基的反应性(亲核性)蛋白质功能基的反应性(亲核性)蛋白质功能基的反应性(亲核性)蛋白质功能基的反应性(亲核性)1.1 1.1 基团之间的氢键及静电作用基团之间的氢键及静电作用基团之间的氢键及静电作用基团之间的氢键及静电作用1.2 1.2 基团之间的空间位阻基团之间的空间位阻基团之间的空间位阻基团之间的空间位阻2 2 修饰剂的反应性修饰剂的反应性修饰剂的反应性修饰剂的反应性2.1 2.1 选择吸附选择吸附选择吸
30、附选择吸附2.2 2.2 静电相互作用静电相互作用静电相互作用静电相互作用2.3 2.3 位阻因素位阻因素位阻因素位阻因素48化学修饰的方法学1 1 试剂的选择试剂的选择试剂的选择试剂的选择 水解稳定性;水解稳定性;水解稳定性;水解稳定性; 蛋白质的修饰位点,反应类型以及专一性;蛋白质的修饰位点,反应类型以及专一性;蛋白质的修饰位点,反应类型以及专一性;蛋白质的修饰位点,反应类型以及专一性; 修饰剂的大小;修饰剂的大小;修饰剂的大小;修饰剂的大小; 连接键的稳定性、毒性和抗原性;连接键的稳定性、毒性和抗原性;连接键的稳定性、毒性和抗原性;连接键的稳定性、毒性和抗原性; 修饰后是否需要进一步的分
31、离;修饰后是否需要进一步的分离;修饰后是否需要进一步的分离;修饰后是否需要进一步的分离; 是否适于建立快速、方便的分析方法;是否适于建立快速、方便的分析方法;是否适于建立快速、方便的分析方法;是否适于建立快速、方便的分析方法; 是否能够简便经济的合成或购买是否能够简便经济的合成或购买是否能够简便经济的合成或购买是否能够简便经济的合成或购买492反应条件的选择反应条件的选择 考虑因素包括考虑因素包括pH、反应温度、反应介质以、反应温度、反应介质以及缓冲液组成及缓冲液组成 允许反应顺利进行允许反应顺利进行 不能造成蛋白质的不可逆变性不能造成蛋白质的不可逆变性 有利于专一性修饰蛋白质有利于专一性修饰
32、蛋白质 50修饰反应的类型酰化及其相关反应酰化及其相关反应烷基化反应烷基化反应氧化还原反应氧化还原反应芳香环取代反应芳香环取代反应51二硝基氟苯法二硝基氟苯法(FDNB,DNFB): 1945年年Sanger提出此方法提出此方法.52二甲基氨基萘磺酰氯法二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有强烈的黄色荧丹磺酰氨基酸具有强烈的黄色荧光光,灵敏性是灵敏性是DNFB法的法的100倍倍.5354巯基的氧化还原反应可以应用于蛋白质结构分析、巯基的氧化还原反应可以应用于蛋白质结构分析、包涵体的复性、增加蛋白质可溶性等。包涵体的复性、增加蛋白质可溶性等。5556SDS PAGE: Refolded vs U
33、nfolded ReducedReducedOxidized Oxidized 5758FigureInclusionbodiesexpressedinE.coli.59606162蛋白质的PEG修饰 聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)(polyethyleneglycol, PEG)修饰又修饰又修饰又修饰又称分子的称分子的称分子的称分子的PEGPEG化化化化(PEGalation),(PEGalation),是目前蛋白质化是目前蛋白质化是目前蛋白质化是目前蛋白质化学修饰最重要的技术之一学修饰最重要的技术之一学修饰最重要的技术之一学修饰最重要的技
34、术之一, ,是用来解决或缓解蛋是用来解决或缓解蛋是用来解决或缓解蛋是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效途径。途径。途径。途径。63PEG是由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料,分子组成为HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH;PEG链还可以与马来酸酐进一步共聚形成梳状的PEG衍生物,简称PM。PEG分子中存在的大量乙氧基能够与水形成氢键,使PEG具有良好的水溶性;分子末端剩余的羟基通过适当方式活化后可与各类蛋白分子相偶联
35、。64由于由于PEG无毒无毒,具有良好生物相容性和血液相容性具有良好生物相容性和血液相容性,使它成为一种被广泛使用的生物修饰材料。对于各种具使它成为一种被广泛使用的生物修饰材料。对于各种具有药用潜能的蛋白来说有药用潜能的蛋白来说,采用采用PEG修饰的目的主要有以修饰的目的主要有以下三个方面下三个方面:(1)增加稳定性增加稳定性,延长血浆半衰期延长血浆半衰期;(2)降低免降低免疫原性和抗原性疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。降低毒副作用。651 增加稳定性和延长血浆半衰期增加稳定性和延长血浆半衰期 一些以注射方式使用的药用蛋白一些以注射方式使用的药用蛋白,由于在血液中存留的由于在血液中存留的时
36、间过短时间过短,在很大程度上限制了其正常药效的发挥。通过在很大程度上限制了其正常药效的发挥。通过PEG修饰修饰,一方面增加了分子量一方面增加了分子量,降低了肾脏的排泄速率降低了肾脏的排泄速率;另一另一方面方面,偶联的偶联的PEG链在蛋白分子表面产生空间位阻效应链在蛋白分子表面产生空间位阻效应,减弱减弱了血液中各种水解酶对蛋白的水解作用了血液中各种水解酶对蛋白的水解作用,从而有效地延长了从而有效地延长了蛋白在循环系统内的保留时间。蛋白在循环系统内的保留时间。662降低抗原性和免疫原性降低抗原性和免疫原性 通过通过PEG修饰来消除免疫反应活性修饰来消除免疫反应活性,将异源性蛋白转化将异源性蛋白转化
37、为非免疫原性的药用蛋白为非免疫原性的药用蛋白,主要是利用无免疫原性的主要是利用无免疫原性的PEG分分子链与蛋白表面的基团相偶联子链与蛋白表面的基团相偶联,进而在蛋白表面形成一道屏进而在蛋白表面形成一道屏障障,将暴露的抗原结合位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状将暴露的抗原结合位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状PEG具有更强的屏蔽功能具有更强的屏蔽功能,因而在这方面的应用更为普遍。因而在这方面的应用更为普遍。673降低毒副作用降低毒副作用 通过基因重组技术获得的大规模生产的通过基因重组技术获得的大规模生产的TNF-a a,IL-2 和和IFN-g g等是一类很有前途的抗肿瘤新药。但由于它们的血浆半等是
38、一类很有前途的抗肿瘤新药。但由于它们的血浆半衰期短衰期短,为达到显著的临床治疗效果不得不加大使用剂量为达到显著的临床治疗效果不得不加大使用剂量,这就这就常常引起严重的毒副作用。近年来发现常常引起严重的毒副作用。近年来发现,利用利用PEG修饰技术对修饰技术对这些蛋白进行处理后这些蛋白进行处理后,能够大大增加其血浆稳定性能够大大增加其血浆稳定性,降低使用剂降低使用剂量量;或在大的使用剂量下降低毒副作用。近年来或在大的使用剂量下降低毒副作用。近年来,PEG修饰已成修饰已成为提高其抗肿瘤效能、降低毒副作用的有效手段。为提高其抗肿瘤效能、降低毒副作用的有效手段。68PEGPEG对蛋白药物修饰的研究及应用
39、进展对蛋白药物修饰的研究及应用进展蛋白药物的蛋白药物的PEG修饰已卓有成效,国际知名的制药公修饰已卓有成效,国际知名的制药公司已经或正在积极推进蛋白药物的司已经或正在积极推进蛋白药物的PEG修饰,修饰,1991年第一年第一种用种用PEG修饰的蛋白药物修饰的蛋白药物PEG-ADA被被FDA批准上市,近几批准上市,近几年上市的有年上市的有PEG-IFN、PEG-G-CSF、PEG-生长抑素。目生长抑素。目前处于临床前研究的前处于临床前研究的PEG修饰的蛋白药物有几十种,处于修饰的蛋白药物有几十种,处于临床实验的有:超氧化物歧化酶(即将上市,临床实验的有:超氧化物歧化酶(即将上市,Enzon公司)、
40、公司)、白介素白介素-2(期,期,Chiron公司)、水蛭素(公司)、水蛭素(期,期,BASF AG公司)、抗公司)、抗-TNF-a a抗体片段(抗体片段(期,期,Pharmacia公司)、公司)、牛血红蛋白(牛血红蛋白(期,期,Enzon公司)、抗公司)、抗-PDGF抗体片段(抗体片段(期,期,Celltech公司)。公司)。697071727374757677 TNF-a a是一种颇有价值的肿瘤治疗药物是一种颇有价值的肿瘤治疗药物, 一方面直接表一方面直接表现为对肿瘤细胞的细胞毒作用现为对肿瘤细胞的细胞毒作用;另一方面可激活宿主的抗肿另一方面可激活宿主的抗肿瘤应答并选择性地引起肿瘤组织内部
41、的微循环障碍。但是瘤应答并选择性地引起肿瘤组织内部的微循环障碍。但是, TNF-a a在体内的清除速率很快在体内的清除速率很快,要产生明显的抗肿瘤效果需要产生明显的抗肿瘤效果需要非常大的使用剂量要非常大的使用剂量,由此常引发一系列由此常引发一系列严重的毒副作用严重的毒副作用,包包括发热、组织炎症和组织损伤括发热、组织炎症和组织损伤,甚至是致命的内毒素性休克甚至是致命的内毒素性休克样综合征。要将其转化为一种有效的抗肿瘤药物必须有效样综合征。要将其转化为一种有效的抗肿瘤药物必须有效地降低毒副作用地降低毒副作用,PEG修饰正是为达到这一目的。研究表明修饰正是为达到这一目的。研究表明,利用利用PEG
42、5000对对TNF-a a进行化学修饰进行化学修饰,通过对修饰条件的优通过对修饰条件的优化处理化处理,不仅能够有效减少毒副作用不仅能够有效减少毒副作用,还可提高其抗肿瘤活性。还可提高其抗肿瘤活性。当赖氨酸残基被修饰的程度分别为当赖氨酸残基被修饰的程度分别为29%和和56%时时,其抗肿瘤其抗肿瘤活性分别增加了活性分别增加了4倍和倍和100倍。与天然倍。与天然TNF-a a相比相比,修饰产物修饰产物的分子量明显增大的分子量明显增大,延长了药物的有效作用时间延长了药物的有效作用时间,降低了毒副降低了毒副作用作用,促进了它作为抗肿瘤药物的应用。促进了它作为抗肿瘤药物的应用。7879FigureSche
43、maticprotocolofPEGylationofTFN-ausingDMMAn.ReactionI,protectionofpartialaminogroupsbyDMMAn;reactionII,PEGylationtoremainedlysineaminogroups;reactionIII,regenerationofaminogroupsbyreleasingDMMAn80ResistanceofnativeTNF-aandPEG-TNF-atoproteases.NativeTNF-aorPEG-TNF-awasincubatedwithtrypsin(left)orcathe
44、psinG(right)at37Cforindicatedtimes.Reactionswerestopped,andremainingbioactivitiesweremeasuredbybioassaysusingLMcells.EachvalueisthemeanS.D.8182FigureBodyweightchangesinMeth-A-bearingmicetreatedwithnativeTNF-aorPEG-TNF-a.Meth-A-bearingBALB/cmiceweregivennativeTNF-a,PEG-TNF-a i.v.Thecontrolgroupwasgiv
45、ensaline.Bodyweightwasmeasured24hafteri.v.injection.Datawererepresentedasbodyweightrelativetothatbeforeinjection.EachvalueisthemeanS.E.offouranimals.*P.05,*P.01,statisticalsignificancecomparedwithPEG-TNF-a.83PEG修饰蛋白及其应用修饰蛋白及其应用被修饰蛋白种类被修饰蛋白种类被修饰蛋白种类被修饰蛋白种类修饰目的修饰目的修饰目的修饰目的用途用途用途用途无基质牛血红蛋白无基质牛血红蛋白无基质牛血
46、红蛋白无基质牛血红蛋白延长血浆半衰期延长血浆半衰期延长血浆半衰期延长血浆半衰期, ,降低肾毒性降低肾毒性降低肾毒性降低肾毒性血液代用品血液代用品血液代用品血液代用品SODSOD延长血浆半衰期延长血浆半衰期延长血浆半衰期延长血浆半衰期降低免疫原性降低免疫原性降低免疫原性降低免疫原性清除氧自由基清除氧自由基清除氧自由基清除氧自由基治疗关节炎治疗关节炎治疗关节炎治疗关节炎L-ASNaseL-ASNase降低免疫原性降低免疫原性降低免疫原性降低免疫原性治疗白血病治疗白血病治疗白血病治疗白血病BovineBovine降低免疫原性降低免疫原性降低免疫原性降低免疫原性血浆扩容剂血浆扩容剂血浆扩容剂血浆扩容剂
47、IL-2IL-2增加水力动力学半径增加水力动力学半径增加水力动力学半径增加水力动力学半径治疗肿瘤治疗肿瘤治疗肿瘤治疗肿瘤TNF-aTNF-a增加抗肿瘤效能增加抗肿瘤效能增加抗肿瘤效能增加抗肿瘤效能, ,降低毒副作用降低毒副作用降低毒副作用降低毒副作用治疗肿瘤治疗肿瘤治疗肿瘤治疗肿瘤抗肿瘤抗体抗肿瘤抗体抗肿瘤抗体抗肿瘤抗体肿瘤定位肿瘤定位肿瘤定位肿瘤定位治疗肿瘤治疗肿瘤治疗肿瘤治疗肿瘤-葡糖苷酸酶抗体葡糖苷酸酶抗体葡糖苷酸酶抗体葡糖苷酸酶抗体增加稳定性增加稳定性增加稳定性增加稳定性, ,改善药代动力学特性改善药代动力学特性改善药代动力学特性改善药代动力学特性治疗实体肿瘤治疗实体肿瘤治疗实体肿瘤治
48、疗实体肿瘤84蛋白质化学修饰的现状和明天 虽然目前修饰的蛋白质均一性差、活性低,虽然目前修饰的蛋白质均一性差、活性低,虽然目前修饰的蛋白质均一性差、活性低,虽然目前修饰的蛋白质均一性差、活性低,但是未来蛋白质化学修饰的发展正向着以下方向但是未来蛋白质化学修饰的发展正向着以下方向但是未来蛋白质化学修饰的发展正向着以下方向但是未来蛋白质化学修饰的发展正向着以下方向迈进。迈进。迈进。迈进。 1. 1.研制新型高效的化学修饰剂;研制新型高效的化学修饰剂;研制新型高效的化学修饰剂;研制新型高效的化学修饰剂; 2. 2.建立分析修饰蛋白质的简便、准确、灵敏和建立分析修饰蛋白质的简便、准确、灵敏和建立分析修饰蛋白质的简便、准确、灵敏和建立分析修饰蛋白质的简便、准确、灵敏和快速的方法;快速的方法;快速的方法;快速的方法; 3. 3.对修饰过程的机理获得更清晰的认识。对修饰过程的机理获得更清晰的认识。对修饰过程的机理获得更清晰的认识。对修饰过程的机理获得更清晰的认识。85