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1、11、基因克隆（感受态细胞制备、转化、质粒提取、酶切鉴定）、基因克隆（感受态细胞制备、转化、质粒提取、酶切鉴定）2、Western blot（蛋白质提取、（蛋白质提取、SDS-PAGE、转膜、免疫检测）、转膜、免疫检测）3、RT-PCR（RNA 提取、逆转录、提取、逆转录、PCR）分子生物学实验安排分子生物学实验安排实验考试实验考试上课时间上课时间：9:00-实验内容：实验内容：2分子生物学技术分子生物学技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）3KaryB.MullisUSA,forhisinventionofthepolymerase
2、chainreaction(PCR)methodTheNobelPrizeinChemistry199345PCRPCRPCRPCR的产物数目的产物数目的产物数目的产物数目以指数级方式增长以指数级方式增长以指数级方式增长以指数级方式增长DNADNA片段片段片段片段Cycle 1Cycle 1Cycle 2Cycle 2Cycle 3Cycle 3Cycle NCycle N理论上可达理论上可达理论上可达理论上可达2 2n n个拷贝个拷贝个拷贝个拷贝原料（原料（原料（原料（pgpg） 产物产物产物产物(ug)(ug)体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增目的基因或地扩增目的基因或DNA片
3、段片段6PCR基本原理基本原理PCR反应体系反应体系PCR结果分析结果分析PCR方法拓展方法拓展PCR的应用的应用7PCR 的基本原理其原理类似于其原理类似于DNA的体内复制，的体内复制，在试管中的在试管中的DNA的体外合成。的体外合成。85353Direction ofunwindingContinuous replicationPrimer53Primer53Discontinuous replication53Primer岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)replication fork9DNA的体内复制：的体内复制：原料：原料： template DNA（genomi
4、c DNA ），），RNA primer，dNTPs酶：酶： 解旋酶，引物酶，解旋酶，引物酶， DNA聚合酶，聚合酶，连接酶连接酶反应条件：反应条件：胞液环境，胞液环境，37 反应过程：反应过程： 起始（模板起始（模板DNA解链、形成引发体）、解链、形成引发体）、延长、终止（三阶段）延长、终止（三阶段）产物：产物：模板模板DNA （基因组（基因组DNA）拷贝数增加一倍拷贝数增加一倍PCR：template DNA（genomic DNA ，cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPsDNA polymerasebuffer，三种变
5、化的温度（，三种变化的温度（94，50-70，72 ），），cycles（25-35）denaturation、 annealing 、extension （三阶段，多循环）（三阶段，多循环）目的目的DNA（特异性）（特异性）拷贝数增加拷贝数增加 2 2n n倍倍10Denaturation（变性）（变性） template DNA (dsDNA) 95denaturation ssDNA 11Annealing（退火）（退火）Primer（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待扩增的目标片段两端的序列互补。（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待扩增的目标片段两端的序列互补。 primers12Exte
6、nsion（延伸）（延伸）Taq酶酶dNTPSn 新合成的链又可作为下轮循环反应的模板新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。 lDNA聚合酶聚合酶：催化反应体系中游离的单核苷酸（：催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物）由引物53方向，按碱基配方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。互补的复制链。13变性变性-退火退火-延伸延伸一个一个PCR循环循环14n尽管尽管PCR扩增扩增DNA非常有效，但目的非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。n在正常的反应条件下，在正常的反应条件下
7、，30次循环，酶的催化反应趋于饱和次循环，酶的催化反应趋于饱和-平台效应平台效应 (Plateau)n“平台效应平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。浓度等多种因素。 15理论上，理论上，n个循环后，产量为个循环后，产量为2n拷贝。拷贝。实际上，实际上，PCR的扩增倍数为（的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为为扩增效率，平均为75%16PCR反应体系与反应条件反应体系与反应条件成分加量（ul）灭菌双蒸水灭菌双蒸水X10PCR缓冲液缓冲液5.0MgCl22-8.0dNTPs1-2.0引物引物A1-2.
8、0引物引物B1-2.0Taq酶酶0.25模板模板5017templatetemplate血液血液陈旧血痕陈旧血痕组织块或石蜡包埋组织组织块或石蜡包埋组织绒毛绒毛毛发毛发羊水脱落细胞羊水脱落细胞尿尿咽拭子咽拭子DNARNAmRNAcDNA18primer1.1.引引物物长长度度：15-30bp，常常用用为为20bp20bp左左右右。2. 2. 保证引物中保证引物中G-CG-C比例为比例为50%15%，ATGC最好随机分布。最好随机分布。3.3.避免两条引物间或引物内部互补，特别是避免两条引物间或引物内部互补，特别是3 3端的互补。端的互补。4. 4. length20bp Ta=62.3 C+0
9、.41 C *(%GC) - 5 C 保证每个引物的保证每个引物的TmTm值相匹配。值相匹配。 5. 5. 检检测测目目的的DNADNA序序列列看看是是否否有有错错配配区区域域，计计算算机机程程序序分分析析可可以以帮帮助助避避免免使使用用设设计计不不合合理理的的引引物物对。对。 19引物的引物的3端端:必须严格互补必须严格互补引物的引物的5端端:可以不严格互补可以不严格互补,可以加酶切位点，可以加酶切位点，加标记物加标记物,引入突变位点等引入突变位点等205-ggttacttccctcgatttgggcggggattcccttccatttttttcttcccttttctcccaagatccag
10、cttcttgggggcactcacgggtgcccgttgcgttctgctccgtcggcccc/ggagctgcatggccaactcccaccaggggccgctcctcccctaccccccacccccgggctccctctttaagtctctagctcaaggtacccgcctctccaaagggctcgtccc-3(229bp)ggttacttccctcgatttgggaggtttcccgagcaggg-521;.DNApolymerase催化一典型的催化一典型的PCR反应约需酶量反应约需酶量2.5U(指总反应体积为指总反应体积为100ul时时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度
11、过低，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。则合成产物量减少。22(dNTPs) ndNTP是是dATP、dCTP、dGTP和和dTTP的总称，是靶的总称，是靶DNA 序列扩增的原料。序列扩增的原料。ndNTP浓度根据靶序列的长度和组成而定，浓度根据靶序列的长度和组成而定， 一般使用浓度在一般使用浓度在50-200umol/L之间之间 23buffer/Mg2+ n常用的缓冲液体系为常用的缓冲液体系为10-50mmol/LTris-HCl10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20pH8.3-8.8,20） nTaqDNATaqDNA聚合酶需要游离聚合酶需要
12、游离MgMg2+2+。24PCR反应条件反应条件变性变性955min变性变性951min退火退火551min延伸延伸721min延伸延伸721min35cycles变性变性95 延伸延伸72 退火退火Tm-525AnalysisofPCRproductsGelanalysis(琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳/聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳):PCR产产物物电电泳泳，EB（溴溴乙乙锭锭）染染色色，紫紫外外仪下观察，初步判断产物的特异性。仪下观察，初步判断产物的特异性。2627Restriction-endonucleasedigestionanalysis：酶切、电泳分离。酶切、电泳分离。产
13、物的鉴定，基因分型，研究变异性。产物的鉴定，基因分型，研究变异性。28Hybridization：(Southernblot/dotblot)electrophoresis/hybridizationelectrophoresis/hybridization29Sequenceanalysis：是检测：是检测PCR产物特异性的产物特异性的最可靠方法。最可靠方法。30DNA测序测序1.Sanger法（双脱氧末端终止法）法（双脱氧末端终止法） 用用4种种2,3双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底）作为底物进行物进行DNA合成反应，从而获
14、得在不同部位终止反应的大小不同的合成反应，从而获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，经高链，经高分辨率变性聚丙烯凝胶电泳分离，就可以对分辨率变性聚丙烯凝胶电泳分离，就可以对DNA序列进行分析序列进行分析3132Sanger法测定法测定DNA序列序列33342.DNA自动化测序自动化测序方法要点方法要点 基于基于基于基于SangerSanger法的基本原理法的基本原理法的基本原理法的基本原理 用标记荧光染料的用标记荧光染料的用标记荧光染料的用标记荧光染料的ddNTPddNTP 经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 用荧光检
15、测仪检测信号经计算机分析用荧光检测仪检测信号经计算机分析用荧光检测仪检测信号经计算机分析用荧光检测仪检测信号经计算机分析 得到得到得到得到DNADNA分子序列分子序列分子序列分子序列 35DNA自动测序结果举例自动测序结果举例36PCRMETHODSSTANDARDPCRHOTSTARTPCRRTPCRINSITUPCRPCR-ELISAREALTIMEQUANTITATIVEPCR37HOTSTARTPCRInhot-startPCR，atleastonereactioncomponent,whichcanincludethepolymerase,salt(KClorMgCl2)ordNTP
16、(s),iswithheldfromthereactionuntilthesystemreachesaparticulartemperature.38RT-PCR(Reversetranscription-PCR)n1.RNApreparationn2.Reversetranscriptionn3.PCRn4.ResultAnalysis:QuantificationorcDNAclone3940Semi-QuantifyRT-PCRn1.RNApreparetionn2.Reversetranscriptionn3.PCR:a.TargetGeneSpecifiedprimerb.GAPDH
17、or-actinprimern4.Quantification41TargetGeneGAPDHor-actin在相对定量检测中在相对定量检测中,为了比较不同样本为了比较不同样本mRNA 表达量水平表达量水平,要求不同的样本之间起要求不同的样本之间起始细胞数目相同始细胞数目相同,RNA 提取效率相同提取效率相同,且目的基因的扩增效率且目的基因的扩增效率相同相同,-不可能同时满足。不可能同时满足。为了避免不同标本在为了避免不同标本在RNA 的产量、质量及的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别逆转录效率上可能存在的差别, 获得目标获得目标基因特异性表达的真正差异基因特异性表达的真正差异-选择一定
18、选择一定的内参基因进行校正和标准化的内参基因进行校正和标准化甘油醛甘油醛-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶根据实验，选择内参基因根据实验，选择内参基因4243REALTIMEQUANTITATIVEPCR 原理：原理： 根据荧光染料形成根据荧光染料形成 特异性荧光信号的特异性荧光信号的 强度，计算出模板强度，计算出模板 DNADNA或或mRNAmRNA的含量的含量 用途：用途：定量分析定量分析mRNAmRNA或或DNADNA优点：优点： 可进行自动化定量可进行自动化定量 分析、降低假阳性分析、降低假阳性44实时实时PCR的基本过程的基本过程4546基因克隆基因克隆医学检测医学检测(基因诊断基因诊断)W
19、HATCANPCRDOFORUS?47一、基因克隆一、基因克隆:PCR PCR 应用应用PCR ProductPCR ProductdigestmixDNAligaseplasmidGenecloning:PCRproduct+vector4849PCR法法设计引物设计引物分段分段PCR基因改造基因改造50再次再次PCR获得突变基因获得突变基因51(一一). 基因突变的检测基因突变的检测 1、基因缺失或插入、基因缺失或插入 基因检测基因检测522 2 2 2、点突变点突变 位于酶切位点上的点突变：位于酶切位点上的点突变：限制性酶切片段分析法限制性酶切片段分析法 不在酶切位点上的点突变：不在酶切
20、位点上的点突变：单链构象多态性分析法单链构象多态性分析法(PCR-SSCP) 致病基因上的未知点突变：致病基因上的未知点突变： PCR-SSCP （单核苷酸多态性，（单核苷酸多态性，SNP）53PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)限制性限制性 片段长度多态性片段长度多态性n1. 分析已知突变分析已知突变 。n2. 突变碱基涉及酶切位点的变化。突变碱基涉及酶切位点的变化。nPCR- 酶切酶切- 电泳电泳54PCR-RFLP5CCACGG33GGTGCC5*5CCATGG33GGTACC5*ResistancetoNcoID
21、igestionSusceptibletoNcoIDigestion55Homozygous Homozygous MutantMutantHomozygous Homozygous Wild-typeWild-typeHeterozygoteHeterozygoteDirectionofElectrophoresisPCR-RFLP56单链构象多态性单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)的原理及特点的原理及特点n单链单链DNA片段片段 复杂的空间折叠构象复杂的空间折叠构象(主要是由主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力其
22、内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的来维持的) 一个碱基发生改变一个碱基发生改变 影响影响 其空间构象其空间构象, 在聚丙烯酰在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同胺凝胶中受排阻大小不同.n非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 分离构象上有差异的分子分离构象上有差异的分子.PCR-SSCP57SSCPPCRPCRATCGWildWildAmplifyregionofinterestedDenaturesamplesinFormamideorHeatATCGMutantMutant58DenaturesamplesinFormamideandHeatATCGATCGDNAm
23、oleculesconformationdependsontheirsequenceRunonaNon-denaturinggelandlookformobilitydifferencesWildWildMutanMutantSSCP59（二）基因异常表达的检测（二）基因异常表达的检测 即检测致病基因的即检测致病基因的mRNA，在表达水平提供基因功能是否正常的直接证据。可采用，在表达水平提供基因功能是否正常的直接证据。可采用RT-PCR，灵敏度更高。，灵敏度更高。（三）外源基因的检测（三）外源基因的检测 适用于细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病。适用于细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病。60（四）法医
24、鉴定（四）法医鉴定（DNA指纹法）指纹法）个体识别和亲子鉴定个体识别和亲子鉴定61法医学个体认定nDNA指纹技术建于指纹技术建于1985年年n英国的遗传学家英国的遗传学家Jeffreys采用小卫星采用小卫星(20-70bp的寡核苷酸串联重复序列的寡核苷酸串联重复序列)作探针进行人作探针进行人基因组基因组DNA的的Southern blot分析，在一个家系中获得了一张具有高度多态性的分析，在一个家系中获得了一张具有高度多态性的DNA图图谱，图谱的每一个成员都有各自独特的谱，图谱的每一个成员都有各自独特的DNA电泳谱带。电泳谱带。 父父 长子、长女长子、长女 次子次子 次女次女 三女三女 母母随机引物随机引物PCR62IndividualIdentification? ?Mum child fa1 fa2 63NothingwouldbemorespecificandreliablethanDNAforindividualidentification.IndividualIdentificationMum child fa1 fa2 64
