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1、全国高职高专药品类专业第二轮规划教材全国高职高专药品类专业第二轮规划教材 药物分析药物分析第第八章八章 药品生物检定技术简介药品生物检定技术简介Page 2药品生物检定技术是指利用生物体（微生物、药品生物检定技术是指利用生物体（微生物、细胞、离体组织或动物）对药物的特定药理、细胞、离体组织或动物）对药物的特定药理、毒理作用，来测定生物药品的效价、检查药品毒理作用，来测定生物药品的效价、检查药品中的有害物质以及对制剂进行微生物限度或无中的有害物质以及对制剂进行微生物限度或无菌检查的技术方法菌检查的技术方法Page 3无菌检查无菌检查微生物限度检查微生物限度检查抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的
2、微生物检定法生化药物效价的生物测定法生化药物效价的生物测定法药品的安全性检查药品的安全性检查Page 4第第一一节节 无菌检查无菌检查Page 5概述概述无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否及其他品种是否无菌无菌的一种方法。的一种方法。将药品或材料，在严格的无菌操作条件下，接种于适合各将药品或材料，在严格的无菌操作条件下，接种于适合各种微生物生长的不同培养基中，置于不同的适宜温度下培养种微生物生长的不同培养基中，置于不同的适宜温度下培养一定的时间，逐日观察微生物的生长情况，并结合阳性和阴一定的时间
3、，逐日观察微生物的生长情况，并结合阳性和阴性对照试验的结果，判断供试品是否无菌。性对照试验的结果，判断供试品是否无菌。包括包括薄膜过滤法薄膜过滤法和和直接接种法直接接种法两种方法两种方法 Page 6一、常规技术要求一、常规技术要求1.1.应应在环境洁净度在环境洁净度1000010000级以下的级以下的局部洁净度局部洁净度100100级的单向流级的单向流空空气区域内或隔离系统中进行检查。气区域内或隔离系统中进行检查。2.2.全全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。3.3.单向单向流空气区、工作台面及环境应定期按流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业
4、洁净室医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标的现行国家标准进行洁净度验证。准进行洁净度验证。Page 7二、培养基二、培养基（一）培养基的种类：（一）培养基的种类：7种种硫乙醇酸盐流体培养基（需氧菌、厌氧菌培养基）硫乙醇酸盐流体培养基（需氧菌、厌氧菌培养基）改良马丁培养基（真菌培养基）改良马丁培养基（真菌培养基）选择性培养基选择性培养基0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）检查）营养肉汤培养基营养肉汤培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基改良马丁
5、琼脂培养基 Page 8二、培养基二、培养基（二）培养基的适用性二）培养基的适用性检查检查证明证明：培养基无菌，且能保证细菌生长良好：培养基无菌，且能保证细菌生长良好 1.无菌性检查无菌性检查 无菌性检查无菌性检查每批培养基随机取不少于每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养支（瓶），培养14天，应无菌生长天，应无菌生长Page 9二、培养基二、培养基（二）培养基的适用性检查（二）培养基的适用性检查2.灵敏度检查灵敏度检查灵敏度检查灵敏度检查方法：取每管装量为方法：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种支，分别接种小于小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿
6、假单胞菌、枯草芽孢杆菌、的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各生孢梭菌各2支，另支，另1支不接种作为空白对照，培养支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装天；取每管装量为量为9ml的改良马丁培养基的改良马丁培养基5支，分别接种小于支，分别接种小于100cfu的白色念珠的白色念珠菌、黑曲霉各菌、黑曲霉各2支，另支，另1支不接种作为空白对照，培养支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观天。逐日观察结果。察结果。结果判断：空白对照管无菌生长，加菌培养基管均生长良好，判结果判断：空白对照管无菌生长，加菌培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定该培养基的灵敏度检查符合规定Pag
7、e 10二、培养基二、培养基（二）培养基的适用性检查（二）培养基的适用性检查适用性检查的菌种：适用性检查的菌种：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉 图片取自青岛海博生物技术有限公司图片取自青岛海博生物技术有限公司Page 11三、方法验证试验三、方法验证试验建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查排除供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用排除供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用避免假阴性结果避免假阴性
8、结果 方法方法：薄膜：薄膜过滤过滤法、直接法、直接接种法接种法 Page 12四、无菌检查法四、无菌检查法（一）检验数量及检验量（一）检验数量及检验量中国药典中国药典现行版附录现行版附录批批出厂产品最小检验数量出厂产品最小检验数量表表液体液体制剂最小检验量及上市抽验样品的最少检验数制剂最小检验量及上市抽验样品的最少检验数量量表表固体固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量量表表Page 13四、无菌检查法四、无菌检查法（二）对照试验（二）对照试验1.1.阳性对照阳性对照必须长菌，用以证明微生物确实可在应用的试验条件下生长必须长菌，用以证明微生物确实
9、可在应用的试验条件下生长 根据供试品特性选择阳性对照菌根据供试品特性选择阳性对照菌无抑菌作用和抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄无抑菌作用和抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌球菌为对照菌抗革兰阴性菌为主的供试品，以大肠埃希菌为对照菌抗革兰阴性菌为主的供试品，以大肠埃希菌为对照菌抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌阳性对照管培养阳性对照管培养48487272小时应生长良好小时应生长良好Page 14四、无菌检查法四、无菌检查法（二）对照试验（二）对照试验2.2.阴性对照
10、阴性对照不得长菌，用以检查试验过程中使用的溶剂、稀释液、不得长菌，用以检查试验过程中使用的溶剂、稀释液、冲洗液等对微生物生长及存活无影响冲洗液等对微生物生长及存活无影响 Page 15四、无菌检查法四、无菌检查法（三）检查方法（三）检查方法 1.1.薄膜过滤法薄膜过滤法通过滤膜过滤，将供试品中可能存在的微生物富集于通过滤膜过滤，将供试品中可能存在的微生物富集于滤膜上，再冲洗掉滤膜上的抑菌成分后，在薄膜过滤滤膜上，再冲洗掉滤膜上的抑菌成分后，在薄膜过滤器滤筒内加入培养基，在所需温度下培养，观察是否器滤筒内加入培养基，在所需温度下培养，观察是否有菌生长有菌生长Page 16四、无菌检查法四、无菌检
11、查法（三）检查方法（三）检查方法2.2.直接接种法直接接种法3.3.培养及观察培养及观察将含培养基的容器在规定的温度培养将含培养基的容器在规定的温度培养1414天，逐日观察天，逐日观察并记录是否有菌生长。必要时可转种及涂片并记录是否有菌生长。必要时可转种及涂片Page 17五、无菌检查结果判断五、无菌检查结果判断（三）检查方法（三）检查方法1.1.阳性对照管应生长良好，阴性对照管阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。不得有菌生长。否则，试验无效。2.2.若供试品管显澄清，或虽显浑浊但经若供试品管显澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。确证无菌生长，判供试品
12、符合规定。3.3.若供试品管中任何一管显浑浊并确证若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。生物非供试品所含。4.4.试验若经确认无效，需依法重试。试验若经确认无效，需依法重试。Page 18第第二二节节 微生物限度检查微生物限度检查Page 19微生物限度检查法微生物限度检查法系检查系检查非规定灭菌制剂非规定灭菌制剂及其原料、辅料受到及其原料、辅料受到微生物污染程度的方法，检查项目包括微生物污染程度的方法，检查项目包括细细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制
13、菌检查菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查成为微生物限度检查成为非规定灭菌制剂非规定灭菌制剂保证药保证药品质量的重要检查内容，也是综合评价药品质量的重要检查内容，也是综合评价药品生产各环节卫生状况的一个依据。品生产各环节卫生状况的一个依据。Page 20一、常规技术要求及检验量一、常规技术要求及检验量（一）技术要求（一）技术要求1.检查应在环境洁净度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。2.单向流空气区域、工作台面
14、及环境应定期按单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。的现行国家标准进行洁净度验证。3.供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。效性及对微生物无毒性。4.细菌培养温度为细菌培养温度为3035；霉菌、酵母菌培养温度为；霉菌、酵母菌培养温度为2328；控制菌；控制菌培养温度为培养温度为3537。5.检验结果以检验结果以1g、1ml、10g、10ml或或10cm
15、2为单位报告，特殊品种可以最为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。小包装单位报告。 Page 21一、常规技术要求及检验量一、常规技术要求及检验量（二）检验量（二）检验量一次试验所用的供试品量一次试验所用的供试品量(g、ml或或cm2)。除另有规定外，一般。除另有规定外，一般供试品的检验量为供试品的检验量为10g或或10ml；膜剂为；膜剂为100cm2；贵重药品、微；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加检验量应增加 20g或或20ml。检验时，应从检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜
16、剂还不个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于得少于4片。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小片。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的包装单位）的3倍量供试品。倍量供试品。Page 22二、样品供试液的制备二、样品供试液的制备中国药典中国药典现行版附录中提供了液体供试品、固体、现行版附录中提供了液体供试品、固体、半固体或黏稠性供试品以及需用特殊方法制备供试液半固体或黏稠性供试品以及需用特殊方法制备供试液的供试品的供试液制备方法。的供试品的供试液制备方法。需用特殊方法制备供试液的供试品有：非水溶性供试需用特殊方法制备供试液的供试品有：非水溶性供试品、膜剂供试品、肠溶
17、及结肠溶制剂供试品、气雾剂、品、膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂、喷雾剂供试品及具抑菌活性的供试品。喷雾剂供试品及具抑菌活性的供试品。 Page 23三、菌种及培养基三、菌种及培养基（一）菌种（一）菌种 1.1.细菌、霉菌、酵母菌计数检查的对照试验菌种细菌、霉菌、酵母菌计数检查的对照试验菌种 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 白色念珠菌白色念珠菌、黑曲霉黑曲霉2.2.控制菌检查的对照菌种控制菌检查的对照菌种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌菌、铜
18、绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌 Page 24三、菌种及培养基三、菌种及培养基（二）培养基（二）培养基1.细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数检查常用的培养基检查常用的培养基 营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、 改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。2.控制菌检查控制菌检查常用的培养基常用的培养基用于菌液制备的营养琼脂培养基等常规培养基用于菌液制备的营养琼脂培养基等常规培养基胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基等胆盐乳糖
19、培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基等20余种用于培养余种用于培养基适用性检查、方法验证试验及供试品检查的培养基。基适用性检查、方法验证试验及供试品检查的培养基。 Page 25三、菌种及培养基三、菌种及培养基白色念珠菌白色念珠菌玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基大肠埃希菌大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基Page 26四、方法的验证试验四、方法的验证试验建立微生物限度检查法时，应先进行方法验证：建立微生物限度检查法时，应先进行方法验证：确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌的菌落计数测定或控制菌的检查。母菌的菌落计数测定或控制菌
20、的检查。选择法定试验菌按照规定的方法及要求进行。选择法定试验菌按照规定的方法及要求进行。 Page 27五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（一）细菌、霉菌及酵母菌计数（一）细菌、霉菌及酵母菌计数检测的是药物在单位质量或体积内所存在的活菌数量检测的是药物在单位质量或体积内所存在的活菌数量评价生产过程中原辅料、设备、器具、工艺、环境及评价生产过程中原辅料、设备、器具、工艺、环境及操作者的卫生状况操作者的卫生状况 Page 28五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（一）细菌、霉菌及酵母菌计数（一）细菌、霉菌及酵母菌计数1.计数方法的验证计数方法的验证 用以保
21、证方法中供试液没有抗菌活性、培养条件适宜用以保证方法中供试液没有抗菌活性、培养条件适宜细菌、霉菌及酵母菌生长、制备过程中稀释剂未受微细菌、霉菌及酵母菌生长、制备过程中稀释剂未受微生物干扰、供试液稀释级选择适宜。生物干扰、供试液稀释级选择适宜。验证试验包括试验组、菌液组、供试品对照组及稀释验证试验包括试验组、菌液组、供试品对照组及稀释剂对照组剂对照组判断指标判断指标: :各试验菌每次试验的菌数回收率各试验菌每次试验的菌数回收率Page 29五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（一）细菌、霉菌及酵母菌计数（一）细菌、霉菌及酵母菌计数2.供试品检查方法供试品检查方法（1）平皿法）
22、平皿法根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液1ml，置直径，置直径90mm的无菌平皿中，的无菌平皿中，注入注入1520ml温度不超过温度不超过45的溶化的的溶化的营养琼脂培养基（细菌）营养琼脂培养基（细菌）或或玫瑰红玫瑰红钠琼脂培养基钠琼脂培养基（霉菌）或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（酵母菌），混（霉菌）或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（酵母菌），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。平皿法以培个平板。平皿法以培养后细菌、霉菌或酵母菌在琼脂平板上形成的独立可见的菌落为计数依据，养后细菌、霉菌或酵母
23、菌在琼脂平板上形成的独立可见的菌落为计数依据，按照菌数报告规则进行报告。按照菌数报告规则进行报告。同时取试验用的稀释液同时取试验用的稀释液1ml，同法操作，作为阴性对照试验。每种计数用，同法操作，作为阴性对照试验。每种计数用的培养基各制备的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。个平板，均不得有菌生长。Page 30营养琼脂培养基营养琼脂培养基取相应稀释级的供试液取相应稀释级的供试液1ml置无菌平皿中置无菌平皿中玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基阴性对照试验阴性对照试验细菌、霉菌计数细菌、霉菌计数试验用的稀释液试验用的稀释液1ml Page 31细菌、霉菌计数细菌、霉菌计数图片截取自原中国药品
24、生物制品检定所图片截取自原中国药品生物制品检定所无菌无菌检查和微生物检查操作规范检查和微生物检查操作规范视频视频Page 32五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（一）细菌、霉菌及酵母菌计数（一）细菌、霉菌及酵母菌计数2.供试品检查方法供试品检查方法（2）薄膜过滤法）薄膜过滤法所用滤膜孔径不大于所用滤膜孔径不大于0.45m，直径一般为，直径一般为50mm。取相当于每张滤膜含取相当于每张滤膜含1g 、1ml或或10 cm2供试品的供试液（或适宜稀释级的供试品的供试液（或适宜稀释级的供试液供试液1ml），加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。用），加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。用p
25、H 7.0无菌冲洗液冲无菌冲洗液冲洗滤膜后，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养洗滤膜后，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养，培养条件和计数方法同基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养，培养条件和计数方法同平皿法。每种培养基至少制备一张滤膜。根据菌数报告规定计数，如超过平皿法。每种培养基至少制备一张滤膜。根据菌数报告规定计数，如超过规定限量即可认定不合格。规定限量即可认定不合格。同时取试验用的稀释液同时取试验用的稀释液1ml同法操作，作为阴性对照，阴性对照不得有菌同法操作，作为阴性对照，阴性对照不得有菌生长。生
26、长。Page 33五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查（二）控制菌检查检查非规定灭菌制剂中是否存在有可疑的致病菌检查非规定灭菌制剂中是否存在有可疑的致病菌 控制菌检查项目包括大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、控制菌检查项目包括大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌及白色念珠菌。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌及白色念珠菌。Page 34五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查（二）控制菌检查1.适用性检查适用性检查 适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查适用性检查项目包括促生长能力、抑制
27、能力及指示能力的检查促生长能力检查用以保证在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间促生长能力检查用以保证在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间内，试验菌生长良好（液体培养基）、菌落大小、形态特征与对照菌一致内，试验菌生长良好（液体培养基）、菌落大小、形态特征与对照菌一致（固体培养基）（固体培养基）抑制能力检查用以保证其他试验菌无法生长抑制能力检查用以保证其他试验菌无法生长指示能力检查用以保证培养基上试验菌的生长情况（液体培养基）、菌落大指示能力检查用以保证培养基上试验菌的生长情况（液体培养基）、菌落大小、形态特征（固体培养基）、指示剂反应情况等与对照培养基一致小、形态特征（固体培养基
28、）、指示剂反应情况等与对照培养基一致Page 35五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查（二）控制菌检查2.方法验证试验方法验证试验 控制菌检查方法的验证试验控制菌检查方法的验证试验用以保证方法中供试液没有抗菌活性、所采用方法适用以保证方法中供试液没有抗菌活性、所采用方法适合于该产品的控制菌检查合于该产品的控制菌检查 Page 36五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查（二）控制菌检查3.阳性对照试验和阴性对照试验阳性对照试验和阴性对照试验试验菌的阳性对照试验：应检出相应的控制菌试验菌的阳性对照试验：应检出相应的控制菌稀释液的
29、阴性对照试验：应无菌生长稀释液的阴性对照试验：应无菌生长 Page 37五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查（二）控制菌检查4.控制菌检查法控制菌检查法（1 1）大肠埃希菌）大肠埃希菌 检查法：取供试液在胆盐乳糖培养基的培养物检查法：取供试液在胆盐乳糖培养基的培养物0.2ml，接，接种至含种至含5ml 4-甲基伞形酮葡糖苷酸（甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基的试）培养基的试管内，培养，于管内，培养，于5小时、小时、24小时在小时在366nm紫外线下观察，紫外线下观察，同时用未接种的同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养培养基作本底对照。若管内培养
30、物呈现荧光，为物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。阴性和靛基质阴性。 Page 38五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查（二）控制菌检查4.控制菌检查法控制菌检查法 （2 2）大肠菌群）大肠菌群 在乳糖胆盐发酵培养基管中，分别加入在乳糖胆盐发酵培养基管中，分别加入1 10、1
31、100、1 1000的供试液的供试液1ml，用稀释剂，用稀释剂1ml作为阴性对照，均作为阴性对照，均培养培养1824小时，观察结果小时，观察结果Page 39五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查（二）控制菌检查4.控制菌检查法控制菌检查法（3 3）沙门菌）沙门菌 检查法：取供试液在营养肉汤培养基中的培养物检查法：取供试液在营养肉汤培养基中的培养物1ml，接，接种于种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养1824小时后，小时后，划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦
32、康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基平板上，根基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基平板上，根据培养后平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，据培养后平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，判断是否检出沙门菌。如菌落形态特征相符或疑似，还应判断是否检出沙门菌。如菌落形态特征相符或疑似，还应通过用三糖铁琼脂培养基高层斜面进行斜面和高层穿刺接通过用三糖铁琼脂培养基高层斜面进行斜面和高层穿刺接种试验做进一步判断。种试验做进一步判断。Page 40五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查（二）控制菌检查4.控制菌检查法控制菌检查法（4 4）铜绿假单胞菌）铜绿假单胞菌
33、 检查法：取供试液在胆盐乳糖培养基的培养液，划线检查法：取供试液在胆盐乳糖培养基的培养液，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，根据接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，根据培养后平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，培养后平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，判断是否检出铜绿假单胞菌。如菌落形态特征相符或判断是否检出铜绿假单胞菌。如菌落形态特征相符或疑似，还应通过氧化酶试验及绿脓菌素试验做进一步疑似，还应通过氧化酶试验及绿脓菌素试验做进一步判断判断 Page 41五、药品的微生物限度检验方法五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查（二）控制菌检查4.控制菌检查法控制菌
34、检查法（5）金黄色葡萄球菌）金黄色葡萄球菌检查法：取供试液在亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉检查法：取供试液在亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基的培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培汤）培养基的培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上。根据培养后养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上。根据培养后平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，判断平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，判断是否检出金黄色葡萄球菌。如菌落形态特征相符或疑是否检出金黄色葡萄球菌。如菌落形态特征相符或疑似，还应通过血浆凝固酶试验做进一步判断似，还应通过血浆凝固酶试验做进一步判断 Page 42第第三
35、三节节 抗生素抗生素效价的微生物检定法效价的微生物检定法Page 43抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。生素活性（效价）的方法。中国药典中国药典现行版：管碟法和浊度法现行版：管碟法和浊度法Page 44一、检定原理一、检定原理标准品溶液和供试品溶液标准品溶液和供试品溶液量反应平行线原理：在相同试验条件下，标准品溶液量反应平行线原理：在相同试验条件下，标准品溶液和供试品溶液对试验菌所得的量反应曲线，在一定剂和供试
36、品溶液对试验菌所得的量反应曲线，在一定剂量范围内互相平行量范围内互相平行检定方法检定方法管碟法：二剂量法、三剂量法管碟法：二剂量法、三剂量法浊度法：二剂量法、三剂量法、标准曲线法浊度法：二剂量法、三剂量法、标准曲线法Page 45二、试验菌二、试验菌 管碟法试验菌：管碟法试验菌：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌、啤酒酵母菌、肺炎克雷藤黄微球菌、大肠埃希菌、啤酒酵母菌、肺炎克雷伯菌、支气管炎伯德特菌。伯菌、支气管炎伯德特菌。浊度法试验菌：浊度法试验菌：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白
37、色念珠菌 Page 46三、管碟法三、管碟法利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。测定供试品效价的一种方法。国际上抗生素药品检定的经典方法。国际上抗生素药品检定的经典方法。中国药典中国药典法定方法：二剂量法和三剂量法法定方法：二剂量法和三剂量法Page 47三、管碟法三、管碟法Page 48四、浊度法四、浊度法利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊
38、度值的大小，比较标准品与供通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。一种方法。中国药典中国药典现行版法定方法：标准曲线法、二剂量现行版法定方法：标准曲线法、二剂量法和三剂量法。法和三剂量法。Page 49第第四四节节 生化药物生化药物效价的生物测定法效价的生物测定法Page 50生化药品生化药品采用生物化学方法，从生物材料中分离、纯化、采用生物化学方法，从生物材料中分离、纯化、精制而成的用以治疗、预防和诊断疾病的药品精制而成的用以治疗、预防和诊断疾病的药品如氨基酸、肽、蛋白质、酶类如氨基酸
39、、肽、蛋白质、酶类剂量以效价（单位）表示剂量以效价（单位）表示中国药典中国药典现行版正文下列入现行版正文下列入【效价测定效价测定】多采用生物检定技术测定效价多采用生物检定技术测定效价Page 51名名 称称效价检定指标效价检定指标标准品标准品检定用生物体检定用生物体升压素升压素血压升高的程度血压升高的程度垂体后叶标准品垂体后叶标准品成年雄性大鼠成年雄性大鼠肝素肝素延长新鲜兔血或兔、延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝固时间的猪血浆凝固时间的作用作用肝素标准品肝素标准品新鲜兔血或兔、新鲜兔血或兔、猪血浆猪血浆绒促性素绒促性素对幼小鼠子宫增重对幼小鼠子宫增重作用作用绒促性素标准品绒促性素标准品雌性幼小鼠的子
40、雌性幼小鼠的子宫宫缩宫素缩宫素引起离体大鼠子宫引起离体大鼠子宫收缩的作用收缩的作用垂体后叶或合成缩垂体后叶或合成缩宫素标准品宫素标准品成年雌性大鼠的成年雌性大鼠的子宫子宫胰岛素胰岛素引起小鼠血糖下降引起小鼠血糖下降的作用的作用胰岛素标准品胰岛素标准品成年小鼠成年小鼠 血血精蛋白锌胰岛精蛋白锌胰岛素注射液素注射液降低家兔血糖的作降低家兔血糖的作用用胰岛素标准品胰岛素标准品健康家兔健康家兔 血血Page 52名名 称称效价检定指标效价检定指标标准品标准品检定用生物体检定用生物体硫酸鱼精蛋白硫酸鱼精蛋白延长新鲜兔血或猪、延长新鲜兔血或猪、兔血浆凝结时间的程兔血浆凝结时间的程度度肝素标准品肝素标准品新
41、鲜兔血或兔、新鲜兔血或兔、猪血浆猪血浆卵泡刺激素卵泡刺激素对幼大鼠卵巢增重的对幼大鼠卵巢增重的作用作用尿促性素标准品尿促性素标准品雌性幼大鼠卵巢雌性幼大鼠卵巢黄体生成素黄体生成素对幼大鼠精囊增重的对幼大鼠精囊增重的作用作用尿促性素标准品尿促性素标准品雄性幼大鼠精囊雄性幼大鼠精囊降钙素降钙素对大鼠血钙降低的影对大鼠血钙降低的影响响降钙素标准品降钙素标准品大鼠大鼠 血血生长激素生长激素使幼龄去垂体大鼠体使幼龄去垂体大鼠体重和胫骨骨骺板宽度重和胫骨骨骺板宽度增加的程度增加的程度生长激素标准品生长激素标准品幼龄去垂体大鼠幼龄去垂体大鼠Page 53第第五五节节 药品药品的安全性检查的安全性检查Page
42、 54一、异常毒性检查一、异常毒性检查给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法一种方法中国药典中国药典现行版以小鼠在给药后现行版以小鼠在给药后48小时内不得有小时内不得有死亡为异常毒性检查合格死亡为异常毒性检查合格常规给药途径包括静脉注射、腹腔注射、皮下注射和常规给药途径包括静脉注射、腹腔注射、皮下注射和口服给药。口服给药。Page 55二、热原检查二、热原检查将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，
43、在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定的方法。含热原的限度是否符合规定的方法。热原系指药品中含有的能引起体温升高的杂质，目前热原系指药品中含有的能引起体温升高的杂质，目前多认为是指细菌内毒素的脂多糖。多认为是指细菌内毒素的脂多糖。 Page 56三、细菌内毒素检查三、细菌内毒素检查利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法方法细菌内毒素是革兰阴性菌细
44、胞壁的构成成分，可激活中性细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁的构成成分，可激活中性粒细胞，造成内源性热原质释放，作用于体温调节中枢引粒细胞，造成内源性热原质释放，作用于体温调节中枢引起机体发热。起机体发热。内毒素是药品热原检查不合格的主要原因内毒素是药品热原检查不合格的主要原因中国药典中国药典现行版中细菌内毒素检查方法包括凝胶法和现行版中细菌内毒素检查方法包括凝胶法和光度测定法光度测定法 Page 57四、升压及降压物质检查四、升压及降压物质检查升压物质检查法升压物质检查法比较垂体后叶标准品与供试品升高大鼠血压的程度，比较垂体后叶标准品与供试品升高大鼠血压的程度，以判定供试品中所含升压物质的限度是否
45、符合规定的以判定供试品中所含升压物质的限度是否符合规定的方法。方法。降压物质检查法降压物质检查法比较组胺对照品与供试品引起麻醉猫血压下降的程度，比较组胺对照品与供试品引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定的以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定的方法。方法。 Page 58五、过敏反应检查五、过敏反应检查将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品进行激发，观察动物出现过敏反应后静脉注射供试品进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。
