酶工程第二章微生物发酵产酶课件

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1、第二章 微生物发酵产酶1酶工程第二章微生物发酵产酶酶的发酵生产n n定义：定义：定义：定义：n经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程，称为酶的发酵生产。n n酶的发酵是当今生产大多数酶的主要方法。酶的发酵是当今生产大多数酶的主要方法。n n原因：原因：n微生物的研究历史长n种类多n繁殖快n易培养n代谢能力强2酶工程第二章微生物发酵产酶优良的产酶微生物应当具备的条件n n优良的产酶微生物应当具备下列条件：n酶的产量高n产酶稳定性好n容易培养和分离n利于酶的分离纯化n安全可靠、无毒性等3酶工程第二章微生物发酵产酶酶的发酵生产的分类n n根据微生物培养方式的不同，酶的

2、发酵生产的可以分为：n固体培养发酵n液体深层发酵n固定化微生物细胞发酵n固定化微生物原生质体发酵等4酶工程第二章微生物发酵产酶固体培养发酵n n培养基：固体或半固体，主要材料为麸皮、米糠等。n n举例：酒曲、酱油曲的生产n n目的：获得淀粉酶类和蛋白酶类，以催化淀粉和蛋白质的水解n n优点：设备简单，操作方便n n缺点：劳动强度较大，原料利用率较低，生产周期较长。5酶工程第二章微生物发酵产酶n n举例：大曲酒的酿制举例：大曲酒的酿制举例：大曲酒的酿制举例：大曲酒的酿制n n全国十大名酒全国十大名酒: :贵州茅台；山西汾酒；四川泸州老窖特曲酒；陕西西凤酒；四川五粮液；四川全兴大曲酒；安徽古井贡酒

3、；贵州遵义董酒；郎酒；剑南春。6酶工程第二章微生物发酵产酶7酶工程第二章微生物发酵产酶 1.霉菌 白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青霉、链孢霉等。2.酵母菌 常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母和白地霉等。3.细菌：常见的细菌菌种：乳酸菌、醋酸菌、丁酸菌、己酸菌。参与白酒生产中的微生物8酶工程第二章微生物发酵产酶大曲酒生产工艺大曲酒生产工艺n 大曲酒是采用大曲作为糖化、发酵剂，以含淀粉物质为原料，经固态发酵和蒸馏而成的一种饮料酒。它的最显著特点是采用酒醅固态发酵和固态蒸馏，从而形成了中国蒸馏酒的典型风格。n国外著名的白兰地、威士忌等蒸馏酒的生产，一般采用液态发酵和液态蒸馏

4、的生产工艺。9酶工程第二章微生物发酵产酶1 1 大曲大曲n大曲是以小麦、大麦和豌豆等为原料，经破碎、加水拌料、压成砖块状的曲坯后，在人工控制的温、湿度下培养而成。n大曲含有霉菌、酵母、细菌等多种微生物及它们产生的各种酶，是一种多菌种的混合粗酶制剂。n在酿酒过程中可形成多种多样的代谢产物，组成了各种风味成分。n n我国绝大部分名、优白酒都使用传统的大曲法酿制。我国绝大部分名、优白酒都使用传统的大曲法酿制。10酶工程第二章微生物发酵产酶 大曲分类大曲分类（按微生物来源）（按微生物来源）n传统大曲传统大曲，菌种来源于大自然。n强化大曲强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在糖化力、发酵力或产香方面更

5、加突出。n纯种大曲纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出酒率高，是今后发展方向。11酶工程第二章微生物发酵产酶大曲分类大曲分类（按制曲温度分）（按制曲温度分）n高温大曲高温大曲，培养制曲的最高温度在60以上，酱香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。n偏高温大曲偏高温大曲，培养温度在5060之间，主要生产浓香型大曲酒。n中温大曲中温大曲，培养最高温度不超过50，主要生产清香型大曲酒。12酶工程第二章微生物发酵产酶大麦、豌豆（6：4）粉碎 高温润糁粗麦粉 踩曲 曲坯 堆积培养 风干贮存成品 2 中温大曲生产工艺中温大曲生产工艺 13酶工程第二章微生物发酵产酶大曲的生产工艺大曲的生产工艺( (Pro

6、duction of Daqu)Production of Daqu)Production of Daqu)Production of Daqu)水水粉碎粉碎成型成型人工踩制人工踩制 (By feet)(By feet)机制成型机制成型 (By machine)(By machine)14酶工程第二章微生物发酵产酶踩曲（曲坯成型）用压曲机压成砖状形（踩曲（曲坯成型）用压曲机压成砖状形（2-3kg2-3kg松而不散）松而不散）。15酶工程第二章微生物发酵产酶培曲阶段培曲阶段 Incubation of Incubation of DaquDaqu卧曲卧曲Woqu 1. 上霉上霉Shangmei

7、2. 晾霉晾霉Liangmei3. 潮火潮火Chaohuo 4.大火大火 Dahuo5. 后火后火Houhuo6. 养曲养曲Yangqu 16酶工程第二章微生物发酵产酶贮贮 曲曲 Storage of Storage of Daqu Daqu 17酶工程第二章微生物发酵产酶 堆堆 曲曲18酶工程第二章微生物发酵产酶 培培 养养19酶工程第二章微生物发酵产酶 翻翻 曲曲 后后 排排 成成 “人人 ”字字 型型20酶工程第二章微生物发酵产酶 成曲贮存成曲贮存3个月后才能使用个月后才能使用21酶工程第二章微生物发酵产酶3 3 大曲酒发酵特点大曲酒发酵特点n采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常控

8、制在55%65%；n在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活性，有利于香味物质的形成和累积；n多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长繁殖和发酵代谢；n固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣法和续渣法两种。 22酶工程第二章微生物发酵产酶23酶工程第二章微生物发酵产酶24酶工程第二章微生物发酵产酶液体深层发酵n培养基：液体，在生物反应器中n n优点：n适用范围广n机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率较高，质量较稳定，产品回收率较高。n是目前发酵生产的主要方式。25酶工程第二章微生物发酵产酶固定化微生物细胞发酵固定化原生质体发酵n（后面详细介绍）26酶工程第二章微生物发酵产酶n一、酶

9、生物合成的基本过程n（已学多次，自学）第一节 微生物细胞中酶生物合成的调节27酶工程第二章微生物发酵产酶第一节 微生物细胞中酶生物合成的调节n二、酶生物合成的调节n n组成酶(constitutive enzyme)：n在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大。如：DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。n n适应型酶(adaptive enzyme)（调节型酶 regulated enzyme）：n在细胞中的含量变化很大，合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌分解乳糖的酶。n n调节对象：适应型酶（调节型酶）28酶工程第二章微生物发酵产酶二、酶生物合成的调节n

10、n调节环节：n转录水平的调节n转录产物的加工调节n翻译水平的调节n翻译产物的加工调节n酶降解的调节n n其中，转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节。29酶工程第二章微生物发酵产酶转录水平的调节操纵子学说n转录水平的调节机制转录水平的调节机制n n1、分解代谢物阻遏作用n是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。n例如：葡萄糖阻遏 半乳糖苷酶的生物合成。30酶工程第二章微生物发酵产酶转录水平的调节操纵子学说n转录水平的调节机制n n2、酶生物合成的诱导作用n加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象，成为酶生物合

11、成的诱导作用，简称为诱导作用。n如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。31酶工程第二章微生物发酵产酶n转录水平的调节机制转录水平的调节机制n n3、酶生物合成的反馈阻遏作用n又称为产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。n如：色氨酸对色氨酸合成途径的反馈阻遏现象。转录水平的调节操纵子学说32酶工程第二章微生物发酵产酶三、酶生物合成的模式n微生物细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历以下四个阶段：n n调整期调整期n n生长期生长期n n平衡期平衡期n n衰退期衰退期n根据细胞生长与酶产生的关系，可以把酶生物合成的模式分为4种类型，即：n n同步合

12、成型同步合成型n n延续合成型延续合成型n n中期合成型中期合成型n n滞后合成型滞后合成型33酶工程第二章微生物发酵产酶酶生物合成的模式酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整期、生长期、其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等平衡期和衰退期等4 4个阶段个阶段 通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型同步合成型，延续合成型延续合成型，中期合成型中期合成型和滞后合成型。滞后合成型。 34酶工程第二章微生物发酵产酶1 1、同步合成型、同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物

13、合成模式。酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系， 又称为生长偶联型生长偶联型。 属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。 大部分大部分组成酶组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。式进行生物合成。 例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanase EC3.1.1.20）。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓

14、度 活细胞浓度胞外酶浓度 胞内酶浓度35酶工程第二章微生物发酵产酶1、同步合成型、同步合成型n特点：n该类型酶的生物合成可以由其诱导物诱导生成，但是不受分解代谢物的阻遏作用，也不受产物的反馈阻遏作用。n该类型酶所对应的mRNA很不稳定，其寿命一般只有几十分钟。在细胞进入生长平衡期后，新的mRNA不再生成，原有的mRNA被降解后，酶的生物合成随即停止。36酶工程第二章微生物发酵产酶2 2、延续合成型、延续合成型 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。 属于该类

15、型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。）的生物合成。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物 以含有葡萄糖的果胶为诱导物 37酶工程第二章微生物发酵产酶2、延续合成型、延续合成型n特点：n延续合成型的酶其生物合成可以受诱导物的诱导，一般不受分解代谢物阻遏。nmRNA相当稳

16、定。38酶工程第二章微生物发酵产酶3 3、滞后合成型、滞后合成型 此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为并大量积累。又称为非生长偶联型非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，

17、阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。合成。 若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的型酶所对应的mRNAmRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。段时间内，继续进行酶的生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成 放线菌素D 对产酶的影响细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml3022不加加入不加加入39酶工程第二章微

18、生物发酵产酶4 4、中期合成型、中期合成型 该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。后，酶的生物合成也随着停止。 例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkaline phophataseAlkaline phophatase，EC 3.1.3.1)EC 3.1.3.1)的生物的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物

19、质，培养基中必须有磷的，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样，存在。这样， 在细胞生长的开始阶段在细胞生长的开始阶段, , 培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间，成，只有当细胞生长一段时间， 培养基中的磷几乎被细胞用完（低于培养基中的磷几乎被细胞用完（低于0.01mmol/L0.01mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNAmRNA不稳定不稳定，其寿命只有，其寿命只有30 min30 min左右，所以当细胞进入平衡期后，左右，所以当细

20、胞进入平衡期后， 酶的生物合酶的生物合成随着停止。成随着停止。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml40酶工程第二章微生物发酵产酶理想的酶合成模式理想的酶合成模式n酶所对应的酶所对应的mRNAmRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。在是影响酶生物合成模式的主要因素。n在酶的发酵生产中， 为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型最理想的合成模式应是延续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。41酶工程第

21、二章微生物发酵产酶理想的酶合成模式理想的酶合成模式n对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程其他合成模式的酶，可以通过基因工程 细胞工程等细胞工程等先进技术先进技术, ,选育得到优良的菌株选育得到优良的菌株, , 并通过工艺条件的优化并通过工艺条件的优化控制控制, , 使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。n对于同步合成型同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；n对于滞后合成型滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；n而对于中期合

22、成型中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量延迟其生物合成停止的时间。42酶工程第二章微生物发酵产酶第二节 产酶微生物的特点基本要求：n酶的产量高n容易培养和管理n产酶稳定性好：不易变异退化n利于酶的分离纯化n安全可靠，无毒性：n凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!n由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。n非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。43酶工程第二章微生物发酵产酶(1) 大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。n形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um

23、，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。nEscherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。n大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。n应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等44酶工程第二章微生物发酵产酶(2) 醋酸杆菌（AcetobacterAcetobacter） n菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含

24、糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。n应用：有机酸(食醋等）、葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶(高果糖浆 )、山梨糖 (维C中间体） 45酶工程第二章微生物发酵产酶(3)枯草枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisBacillus subtilis） n直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。n枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。n（常作为饲料添加剂）46酶工程第二章微生物发酵产酶(4) 根霉(Rhizopus) n分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。 n根霉因有假根（Rhizoid

25、）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。n分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。n代表种：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。n应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。47酶工程第二章微生物发酵产酶(6)曲霉(Aspergillus) n分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。n分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。n代表种：黑曲霉Asp. Niger、黄曲

26、霉Asp.flavusn应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。48酶工程第二章微生物发酵产酶第三节 发酵工艺条件及其控制 保藏细胞 细胞活化 原生质体细胞扩大培养固定化细胞 固定化原生质体 发酵 预培养 培养基 分离纯化 无菌空气 酶49酶工程第二章微生物发酵产酶一、细胞活化与扩大培养 保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力，这就叫细胞活化细胞活化。 为了保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化了的细胞一般要经过一级至数级的扩大培养

27、。用于细胞扩大培养的培养基称为种子培养基种子培养基。50酶工程第二章微生物发酵产酶1、培养基各种生物对营养的需求各种生物对营养的需求51酶工程第二章微生物发酵产酶n1、选择适宜的营养物质n2、营养物的浓度及配比合适n3、物理、化学条件适宜n4、经济节约n5、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原则培养基的设计原则52酶工程第二章微生物发酵产酶五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基几乎是一切对微生物

28、进行研究和利用工作的基础培养基（培养基（mediummedium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素53酶工程第二章微生物发酵产酶构成细胞物质或代谢产物中碳架构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源，为生命活动提供能量碳源可作能源，为生命活动提供能量常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白常用碳源：糖类、醇类、脂类

29、、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物质及其降解物异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用） 水是微生物最基本的组成分（水是微生物最基本的组成分（）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水水碳源碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制54酶工程第二章微生物发酵产酶构成细胞物质和

30、代谢产物中氮素（不能用作能源构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、磷常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化镁、铁等元素的化合物。合物。 氮源氮源无机盐无机盐需要注意合适的碳氮比需要注意合适的碳氮比55酶工程第二

31、章微生物发酵产酶生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。 分类：分类：化学结构分成化学结构分成维生素维生素、氨基酸氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍嘌呤（或嘧啶）及其衍生物生物和和类脂成分类脂成分 等四类等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因实验

32、室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种子的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子生长因子. .56酶工程第二章微生物发酵产酶实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌： 查氏合成培养基；查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或一般培养：肉汤培养基或LBLB培养基；培养基；

33、自然转化：基础培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基. .57酶工程第二章微生物发酵产酶微生物发酵产酶常用的几种发酵培养基n地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌27092709碱性蛋白酶发酵培养基碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%, 豆饼4%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。n黑曲霉黑曲霉AS 3.350AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉6%, 豆饼粉4%, 玉米浆0.6%, 氯化钙0.5%, 氯化铵1%, 磷酸氢二

34、钠0.2% (pH 5.5)。 n游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。n桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸镁0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。n黑曲霉黑曲霉AS3.396AS3.396果胶酶发酵培养基果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。58酶工程第

35、二章微生物发酵产酶n枯草杆菌枯草杆菌BF7658-BF7658-淀粉酶发酵培养基淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。n枯草杆菌枯草杆菌AS1.398AS1.398中性蛋白酶中性蛋白酶中性蛋白酶中性蛋白酶发酵培养基发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%, 糠1%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。n黑曲霉糖化酶发酵培养基黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.45.0）。n枯草杆菌枯草杆菌AS1.398AS1.398碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶

36、碱性磷酸酶发酵培养基发酵培养基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸铵1%, 氯化钾0.1%, 氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制)微生物发酵产酶常用的几种发酵培养基59酶工程第二章微生物发酵产酶2 2、发酵条件及控制、发酵条件及控制培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培通常在培养基中加入养基中加入pHpH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。通常培养条件：细菌与放线菌：pH

37、77.5酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长pHpH值的控制值的控制细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适pHpHpHpH值与生长最适值与生长最适值与生长最适值与生长最适pHpHpHpH值往往有所不同。细胞生产值往往有所不同。细胞生产值往往有所不同。细胞生产值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适某种酶的最适某种酶的最适某种酶的最适pHpHpHpH值通常接近于该酶催化反应的最适值通常接近于该酶催化反应的最适值通常接近于该酶催化反应的最适值通常接近于该酶催化反应的最适pHpHpHpH值。值。值。值。 有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基有些细胞

38、可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的的pHpH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。 60酶工程第二章微生物发酵产酶通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。温度的控制温度的控制 有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。 枯草杆菌的最适生长温

39、度为3437黑曲霉的最适生长温度为2832 61酶工程第二章微生物发酵产酶溶解氧的控制溶解氧的控制溶解氧的控制溶解氧的控制在酶的发酵生产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。 培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。调节通气量调节通气量调节氧的

40、分压调节氧的分压 调节气液接触时间调节气液接触时间 调节气液接触面积调节气液接触面积 改变培养液的性质改变培养液的性质 控制溶解氧方法62酶工程第二章微生物发酵产酶三、提高酶产量的措施提高酶产量的措施 添加诱导物添加诱导物添加诱导物添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。 诱导物一般可以分为3类: 酶的作用底物酶的作用底物酶的作用底物酶的作用底物 酶的催化反应产物酶的催化反应产物酶的催化反应产物酶的催化反应产物 作用底物的类似物作用底物的类似物

41、作用底物的类似物作用底物的类似物63酶工程第二章微生物发酵产酶控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。1.1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。的阻遏作用。2.2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的

42、有效措施。 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除使阻遏解除。 64酶工程第二章微生物发酵产酶添加表面活性剂添加表面活性剂添加表面活性剂添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。外酶的分泌，从而提高酶的产量。 将适

43、量的非离子型表面活性剂非离子型表面活性剂，如吐温（吐温（TweenTween）、特里顿特里顿(Triton)(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 添加产酶促进剂添加产酶促进剂添加产酶促进剂添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高120倍；添

44、加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度进剂的种类和浓度。 65酶工程第二章微生物发酵产酶第四节 酶发酵动力学n发酵动力学：发酵动力学：是研究发酵过程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的学科。n发酵动力学包括：q细胞生长动力学q产物生成动力学q基质消耗动力学66酶工程第二章微生物发酵产酶1 1、酶生产过程中细胞生长动力学酶生产过程中细胞生长动力学n细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中

45、,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。 n细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年，法国的莫诺德法国的莫诺德(Monod)(Monod)首首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程。 在培养过程中，在培养过程中， 细胞生长速率与细细胞生长速率与细胞浓度成正比胞浓度成正比 假设培养基中只有一种限制性基质，而不存假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，在其他生长限制因素时，为这种限制性基质为这种限制性基质浓度的函数。浓度的函数。KS 为莫诺德常数，为莫诺德常数， 是指

46、比生长速率达到最是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。大比生长速率一半时的限制性基质浓度。67酶工程第二章微生物发酵产酶限制性基质的物料平衡式限制性基质的物料平衡式莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的各种动力学模型。各种动力学模型。连续培养时的方程变化形式6

47、8酶工程第二章微生物发酵产酶2 2、产酶动力学、产酶动力学 n产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律响规律。n产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为非结构动力学非结构动力学。n也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学微观产酶动力学或称为结构动力学结构动力学。69酶工程第二章微生物发酵产酶在酶的发酵生产中，酶的产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集在酶的发酵生产中，酶的产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集中体现，宏观产酶动力

48、学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、中体现，宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。细胞浓度以及细胞产酶模式有关。 与生长相关与生长部分相关与生长无关70酶工程第二章微生物发酵产酶常用的几种模型常用的几种模型71酶工程第二章微生物发酵产酶如何提高产酶微生物的利用率？如何提高产酶微生物的利用率？思考：72酶工程第二章微生物发酵产酶第五节 固定化微生物细胞发酵产酶n固定化细胞：固定化细胞：又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。n发展情况：n20世纪70年代发展起来，多种酶的固定

49、化生产已取得成功。如：糖化酶、淀粉酶等。73酶工程第二章微生物发酵产酶一、固定化细胞发酵产酶的特点n固定化细胞发酵产酶与游离细胞发酵产酶相比，具有以下显著特点：n1、可以反复使用或连续使用较长时间n2、缩短发酵周期，提高设备利用率n3、产品容易分离纯化n4、提高产酶率n原因：细胞密度增大n5、发酵稳定性好n6、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失n7、适用于胞外酶的生产74酶工程第二章微生物发酵产酶二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制n1、溶解氧的供给n不利条件：氧的溶解及传递受阻。n解决方法：n加大通气量n改变载体、固定化技术、培养基组分等。n2、温度的控制n适应范围更宽n但要适应连续发酵的要

50、求75酶工程第二章微生物发酵产酶二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制n3、固定化细胞的预培养n目的：使细胞在载体上生长繁殖n注意：预培养条件与发酵产酶时的条件可能存在差异n4、培养基组分的控制n注意：要考虑固定化细胞的结构稳定性与供氧量76酶工程第二章微生物发酵产酶三、固定化细胞生长和产酶动力学n细胞生长：q固定化部分：细胞浓度达平衡后不变q泄漏部分：游离，符合常规生长曲线n酶的生产：q固定化部分：非生长偶联型q泄漏部分：由细胞的特性决定77酶工程第二章微生物发酵产酶第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶n固定化原生质体：固定化原生质体：n指固定在载体上，在一定的空间范围内进行新陈代谢的原生

51、质体。n原生质体产酶优点：原生质体产酶优点：n去除细胞壁，有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外，可以用于胞内酶等胞内产物的生产。n不足：不足：n不稳定，易受破坏。78酶工程第二章微生物发酵产酶一、固定化原生质体的特点n1、变胞内产物为胞外产物n2、易于分离纯化n3、提高酶产率n4、稳定性好79酶工程第二章微生物发酵产酶二、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制n与游离细胞发酵产酶的工艺条件基本相同。n特别注意点：n1、渗透压的控制n2、防止细胞壁再生n3、保证原生质体的浓度80酶工程第二章微生物发酵产酶小结：n n本节重点是：n酶生物合成的模式n产酶微生物的特点n发酵工艺条件的控制n固定化细胞及固定化原生质体产酶的特点n掌握程度：以识记、理解为主。n即：能列举相关知识、能进行判断、能用自己的话进行表述等。81酶工程第二章微生物发酵产酶表表2-1 不同发酵方式对不同发酵方式对-淀粉淀粉酶酶产产酶酶率的影响率的影响细胞发酵方式稀释率/h体积产酶率U/(L.h)相对产酶率固定化连续0.434875578连续0.304515535连续0.133240384分批1031122游离分批84410082酶工程第二章微生物发酵产酶