高效液相色谱法A课件

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1、第三章第三章 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法A课件第一节第一节 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法技术基础上建立的一种液相色谱法 引入气相色谱法的理论，在技术上采用新型引入气相色谱法的理论，在技术上采用新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、及各种高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化分离效率高和操作自动化 高效液相色谱法A课件一、经典液相柱色谱法与高效液相色谱法的

2、比较一、经典液相柱色谱法与高效液相色谱法的比较经典液相色谱经典液相色谱高效液相色谱高效液相色谱常压或减压常压或减压高压，高压，4040 50MPa50MPa填料颗粒大，填料颗粒大，7575600m600m填料颗粒小，填料颗粒小，2 2 50m50m柱效低，柱效低，2 2 50 50 块块/m/m柱效高柱效高,40000 ,40000 60000 60000 块块/m/m分析速度慢，分析速度慢，1 12020小时小时分析速度快，分析速度快，0.050.051.0 h1.0 h色谱柱只用一次色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用色谱柱可重复多次使用不能在线检测不能在线检测能在线检测能在线检测高效液相色

3、谱法A课件二、气相色谱法与高效液相色谱法的比较二、气相色谱法与高效液相色谱法的比较 相同：相同：兼具分离和分析功能，兼具分离和分析功能， 均可以在线检测均可以在线检测 主要差别：主要差别：分析对象的差别、分析对象的差别、 流动相的差别、流动相的差别、 操作条件差别操作条件差别高效液相色谱法A课件分析对象的差异分析对象的差异GC GC 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品不可检测及高聚物的样品不可检测 占有机物的占有机物的20%20%HPLC HPLC 溶解后能制成溶液的

4、样品溶解后能制成溶液的样品 不受样品挥发性和热稳定性的限制不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及分子量大、难气化、热稳定性差及 高分子高分子 和离子型样品均可检测和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的80%80%高效液相色谱法A课件流动相差别流动相差别GCGC： 流动相为惰性气体流动相为惰性气体 组组 分分 与与 流流 动动 相相 无无 亲亲 合合 作作 用用 力力 只与固定相作用只与固定相作用 高效液相色谱法A课件流动相差别（续）流动相差别（续）HPLCHPLC：流动相为液体：流动相为液体 流流动动相相与与组组分分间间有有亲亲合合作作用用力力，

5、为为提提高高柱柱的的选选择择性性、改改善善分分离离度度增增加加了了因因素素，对对分分离离起很大作用起很大作用 流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广 流流动动相相极极性性和和pHpH值值的的选选择择也也对对分分离离起起到到重重要作用要作用 选选用用不不同同比比例例的的两两种种或或两两种种以以上上液液体体作作为为流动相可以增大分离选择性流动相可以增大分离选择性高效液相色谱法A课件操作条件差别操作条件差别 GCGC：加温操作：加温操作 HPLCHPLC：室室温温；高高压压（液液体体粘粘度度大大，峰展宽小）峰展宽小）高效液相色谱法A课件三、高效液相色谱法的特点三、高效液相色谱法的特点（

6、1 1）高压：供液压力和进样压力可达）高压：供液压力和进样压力可达5105104 4kPakPa（2 2）高速）高速: : 流动相流速加快流动相流速加快 （3 3）高效）高效: : 柱效可达柱效可达3 3万塔板万塔板/ /米以上。米以上。（4 4）高灵敏度）高灵敏度:10:10-16-161010-9-9克克 （5 5）选选择择性性高高：可可以以通通过过流流动动相相的的控控制制来来改改善善分分离离过过程的选择性程的选择性 （6 6）应用范围广）应用范围广 高效液相色谱法A课件四、四、 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论热力学理论

7、：塔板理论热力学理论：塔板理论平衡理论平衡理论平衡理论平衡理论 基础基础基础基础动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论VanderVander方程方程方程方程 高效液相色谱法A课件（一）塔板理论（一）塔板理论 高效液相色谱法A课件（二）速率理论（二）速率理论 高效液相色谱法A课件HPLC H = He + Hd + HsH = He + Hd + Hs + Hmm + Hsm+ Hmm + Hsm 固定相传质阻力固定相传质阻力流动流动相传质阻力流动流动相传质阻力滞留流动相传质阻力滞留流动相传质阻力涡流扩散涡流扩散分子扩散分子扩散高效液相色谱法A课件1

8、1、涡流扩散项、涡流扩散项HeHe HeHe A = 2dpA = 2dp高效液相色谱法A课件2 2、分子扩散项、分子扩散项HdHd 样品在色谱柱中滞留的时间愈长，色谱谱带样品在色谱柱中滞留的时间愈长，色谱谱带的分子扩散也愈严重。的分子扩散也愈严重。 Dm10Dm10-5 -5 cmcm2 2/s/s（比在气体中要小（比在气体中要小4545个数量个数量级），所以在液相色谱中，纵向分子扩散项实级），所以在液相色谱中，纵向分子扩散项实际上可以忽略际上可以忽略 高效液相色谱法A课件3 3、传质阻力项、传质阻力项(1)(1)固定相传质阻力项固定相传质阻力项HsHs：高效液相色谱法A课件(2)(2)流动

9、相传质阻力项：流动相传质阻力项：流动的流动相的传质阻力流动的流动相的传质阻力Hmm Hmm 高效液相色谱法A课件滞留的流动相的传质阻力滞留的流动相的传质阻力HsmHsm 高效液相色谱法A课件Van DeemterVan Deemter方程方程 高效液相色谱法A课件分子扩散和传质阻力对板高的贡献分子扩散和传质阻力对板高的贡献高效液相色谱法A课件固定相粒度大小对板高的影响固定相粒度大小对板高的影响 高效液相色谱法A课件高效液相色谱法A课件（三）影响谱带展宽的其他因素（三）影响谱带展宽的其他因素柱外效应柱外效应高效液相色谱法A课件第二节 高效液相色谱仪 高效液相色谱法A课件高效液相色谱法A课件液相液

10、相色谱的基本流程图色谱的基本流程图流动相流动相泵泵色色谱谱柱柱检测检测器器 泵泵输输液液分离分离 检测检测 记录记录AEGBCDF进样阀进样阀进样进样高效液相色谱法A课件一、贮液和脱气装置 1 1 储液罐储液罐 材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚酮（聚醚酮（PEEKPEEK） 容积：容积：0.52.0L0.52.0L 放置位置：高于泵体，保持一定的输静压差放置位置：高于泵体，保持一定的输静压差 注意：密封、过滤注意：密封、过滤 高效液相色谱法A课件 2、流动相-过滤、脱气流动相过滤的目的流动相过滤的目的 过滤去除可能存在的微小过滤去除可能存在的微小固体

11、颗粒，保护色谱高压泵和色固体颗粒，保护色谱高压泵和色谱柱谱柱流动相过滤方法流动相过滤方法 在线过滤在线过滤 抽真空抽真空过滤过滤过滤用膜：过滤用膜：水系和有机水系和有机 孔径：孔径：0.22m和和0.45m高效液相色谱法A课件流动相脱气的目的流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能提高检测的性能防止气泡引起的尖峰防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱保护色谱柱减少死体积减少死体积防

12、止填料的氧化防止填料的氧化高效液相色谱法A课件常用的脱气方法有：常用的脱气方法有：吹氦脱气法吹氦脱气法： 原理：利用氦气在液体中的溶解度比空气低。原理：利用氦气在液体中的溶解度比空气低。 特点：效果好，适合所有溶剂，但成本高，使用较少特点：效果好，适合所有溶剂，但成本高，使用较少加热回流法：加热回流法：脱气效果也比较好脱气效果也比较好抽真空脱气法：抽真空脱气法： 特点：可以一次完成过滤和脱气任务特点：可以一次完成过滤和脱气任务 注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系体系超声波脱气法超声波脱气法 简单，但效果不理想简单，但效果不理

13、想高效液相色谱法A课件常用的脱气方法（续）在线真空脱气法在线真空脱气法 把真空脱气装置串接到储液系统，结合膜过把真空脱气装置串接到储液系统，结合膜过滤器可以实现流动相的连续在线真空脱气滤器可以实现流动相的连续在线真空脱气。高效液相色谱法A课件二、高压输液系统 高压输液泵性能：高压输液泵性能： 泵体材料耐化学腐蚀泵体材料耐化学腐蚀 能在高压下连续工作能在高压下连续工作 输液流量范围宽输液流量范围宽 输出流量稳定、重复性高：流量控输出流量稳定、重复性高：流量控 制的精密度应小于制的精密度应小于1%1%（最好为（最好为0.5% 0.5% ），重复性），重复性 最好为最好为0.5% 0.5% 高压输液

14、泵分类：高压输液泵分类：恒压泵恒压泵和恒流泵恒流泵 高效液相色谱法A课件1 1、恒流泵、恒流泵 输出恒定体积流量的流动相输出恒定体积流量的流动相 注射型注射型 恒流泵恒流泵 往复型往复型 双柱塞往复式并联泵双柱塞往复式并联泵 双柱塞往复式串联泵双柱塞往复式串联泵 高效液相色谱法A课件往复型泵往复型泵 目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱塞往复式串联泵塞往复式串联泵高效液相色谱法A课件高效液相色谱法A课件往复型泵往复型泵优点：优点： 可以在高压下连续以恒定的流量输液可以在高压下连续以恒定的流量输液 液缸容积很小，柱塞容易密封，造价低液缸容积很小，柱塞容易密封，

15、造价低 更换溶剂方便，特别适用于梯度洗脱更换溶剂方便，特别适用于梯度洗脱高效液相色谱法A课件往复型泵往复型泵缺点：缺点： 流动相存在脉动，难以用折光示差检测器进行定量分析流动相存在脉动，难以用折光示差检测器进行定量分析 柱塞式往复泵、柱塞和流动相直接接触，易造成污染柱塞式往复泵、柱塞和流动相直接接触，易造成污染 长期运转后，流动相中的某些机械杂质会造成单向阀阻塞或长期运转后，流动相中的某些机械杂质会造成单向阀阻塞或阀球磨损不能关闭单向阀，使泵不能正常运转阀球磨损不能关闭单向阀，使泵不能正常运转 柱塞式往复泵是柱塞式往复泵是HPLCHPLC中应用广泛，也是最重要的高压中应用广泛，也是最重要的高压

16、输液泵输液泵高效液相色谱法A课件双柱塞往复式串联泵示意图高效液相色谱法A课件2 2、恒压泵（气动放大泵）、恒压泵（气动放大泵）输出恒定压输出恒定压力的泵力的泵优点：优点：能以比较简单的方式建立高压并输出无脉动能以比较简单的方式建立高压并输出无脉动的恒压流动相液流的恒压流动相液流适合和折光示差检测器配合使用适合和折光示差检测器配合使用可以利用改变气源压力的方法来调节载液流可以利用改变气源压力的方法来调节载液流速速高效液相色谱法A课件缺点： 不能输出恒定流量的流动相不能输出恒定流量的流动相 色谱峰的重复保留时间差色谱峰的重复保留时间差 不能获得可靠的定性结果不能获得可靠的定性结果 液缸体积大（约液

17、缸体积大（约70ml)70ml)，更换载液时操作不便，更换载液时操作不便 目前恒压泵主要用于目前恒压泵主要用于色谱柱的制备色谱柱的制备，配合装柱用的，配合装柱用的匀浆装柱机，可以快速建立所需的高压输出匀浆装柱机，可以快速建立所需的高压输出高效液相色谱法A课件单液缸气动放大泵示意图气动放大泵是利用气体为动力源，通过帕气动放大泵是利用气体为动力源，通过帕斯卡原理把气体的压力放大成流动相的压斯卡原理把气体的压力放大成流动相的压力力 高效液相色谱法A课件3 3、输液系统的辅助设备、输液系统的辅助设备 主要有管道过滤器、脉动阻尼器、由压力传感器组主要有管道过滤器、脉动阻尼器、由压力传感器组成的压力测量、

18、显示装置，以及流动相流量的测量装置成的压力测量、显示装置，以及流动相流量的测量装置4 4、梯度洗脱装置、梯度洗脱装置 梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于检测器的灵敏度，它类似于GCGC种使用的程序升温技术种使用的程序升温技术 影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的互溶性、检测器的种类互溶性、检测器的种类高效液相色谱法A课件高效液相色谱法A课件四元低压梯度系统高效液相色谱法A课件三、进样装置1 1、进样器进样、进样器进样 进样前打开流动相泄流阀进样前打开流动相泄流阀 用

19、注射器进样用注射器进样 关闭泄流阀，完成一次关闭泄流阀，完成一次高效液相色谱法A课件 2、六通阀进样装置高效液相色谱法A课件高效液相色谱法A课件高效液相色谱法A课件一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈进样针进样针高效液相色谱法A课件3 3、自动进样器、自动进样器 工作站按预定程序自动完成取样、工作站按预定程序自动完成取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘进样、复位、样品管路清洗和样品盘的移动等所有步骤的移动等所有步骤 高效液相色谱法A课件高压进样环进样原理样品瓶置于进样针下方样品瓶置于进样针下方高效液相色谱法A课件高压进样环进样原理进样针穿过垫圈进入瓶中

20、进样针穿过垫圈进入瓶中高效液相色谱法A课件高压进样环进样原理注射器抽取所设定的样品体积高效液相色谱法A课件高压进样环进样原理进样针收回高效液相色谱法A课件高压进样环进样原理转入针端口使之并成为流路的一部分转入针端口使之并成为流路的一部分高效液相色谱法A课件功能的拓展： 进样针的位置可以上下调节；进样针的位置可以上下调节； 利用进样程序进行某些柱前衍生化反应利用进样程序进行某些柱前衍生化反应例：氨基酸的衍生化反应例：氨基酸的衍生化反应 “三明治三明治”式进样可以自动混合式进样可以自动混合 茚三酮衍生，用紫外检测器茚三酮衍生，用紫外检测器 邻苯二甲醛衍生，用荧光检测器邻苯二甲醛衍生，用荧光检测器高

21、效液相色谱法A课件四、分离系统1 1、柱材料和规格、柱材料和规格 不锈钢管不锈钢管 柱管的内径：柱管的内径：0.5 0.5 4.6mm4.6mm 填料粒度：填料粒度：3 3 10 10 m m 柱长度：柱长度：10 10 50 50 cmcm高效液相色谱法A课件2 2、色谱柱色谱性能的评价、色谱柱色谱性能的评价评价内容：评价内容：分离效能、对指定溶质的选择型、在不同分离效能、对指定溶质的选择型、在不同PHPH介质中的稳定性、不同批次但同型号填料间性能的重介质中的稳定性、不同批次但同型号填料间性能的重现性、适宜的操作压力等。现性、适宜的操作压力等。性能评价方法：性能评价方法：以指定的一组标准溶质

22、为样品，测定它以指定的一组标准溶质为样品，测定它们在柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。们在柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。例：对于反相色谱填料，可以选择一组具有不同极性的例：对于反相色谱填料，可以选择一组具有不同极性的芳香族化合物，如：苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯芳香族化合物，如：苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等作为基本组分，再加以苯酚或苯胺等酸、碱性溶质。等作为基本组分，再加以苯酚或苯胺等酸、碱性溶质。高效液相色谱法A课件五、检测系统主要作用：主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析

23、。定量分析。高效液相色谱法A课件（一）概述 1 1、理想的检测器应具备的特性、理想的检测器应具备的特性 第一第一：具有高灵敏度和可预测的响应具有高灵敏度和可预测的响应 第第二二：对对样样品品所所有有组组分分都都有有响响应应，或或具具有有可可预预测测的的特特异异性，适用范围广性，适用范围广 第三第三：温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响 第四第四：响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱 第五第五：死体积小，不造成柱外谱带扩展死体积小，不造成柱外谱带扩展 第六第六：使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修使用方便、可靠、耐用，易清

24、洗和检修 高效液相色谱法A课件第第七七：响响应应值值随随样样品品组组分分量量的的增增加加而而线线性性增增加加，线性范围宽线性范围宽 第八第八：不破坏样品组分不破坏样品组分 第九第九：能对被检测的峰提供定性和定量信息能对被检测的峰提供定性和定量信息 第十第十：响应时间快响应时间快 高效液相色谱法A课件检测器的种类可变波长紫外可见光检测器可变波长紫外可见光检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器示差折光检测器示差折光检测器荧光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器电导电化学和脉冲安培检测器电导电化学和脉冲安培检测器质谱检测器质谱检测器高效液相色谱法A课件2、衡量检测器的指标灵敏度灵

25、敏度 S = R / QS = R / QRR是检测器响应值的增量是检测器响应值的增量Q Q是样品量的增量是样品量的增量噪音噪音 没有样品时检测器的最大输出信号没有样品时检测器的最大输出信号漂移漂移 检测器在一段时间内响应值的变化检测器在一段时间内响应值的变化线性动态范围线性动态范围最大线性相应与最小检出限之比最大线性相应与最小检出限之比最小检测限最小检测限样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度信噪比信噪比S/NS/N注意注意最小检测限不是一个单纯的检测器指标。它实最小检测限不是一个单纯的检测器指标。它实际上是评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、际上是评价整个

26、色谱系统的指标，包括了色谱系统、分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此高效液相色谱法A课件（二）紫外检测器（二）紫外检测器原理：原理：基于被分析组分对特定波长紫外光或可见基于被分析组分对特定波长紫外光或可见光的选择性吸收光的选择性吸收定量基础：定量基础：比耳定律，比耳定律，高效液相色谱法A课件比耳定律光能量光能量 I I0 0 = = 入射光强度入射光强度 I = I = 透过光强度透过光强度光通量光通量( (透过率透过率%)%) T= I/I T= I/I0 0吸光度吸光度 A = -log(T)= A = -log(T)= log(Il

27、og(I0 0/I)/I)吸光度吸光度 A = abcA = abc高效液相色谱法A课件流动池示意图高效液相色谱法A课件 定波长检测器定波长检测器紫外检测器种类紫外检测器种类 可变波长检测器可变波长检测器 二极管阵列检测器二极管阵列检测器DADDAD高效液相色谱法A课件第一种类型：固定波长紫外检测器光源光源 低压汞灯，发出低压汞灯，发出90%90%的的254nm254nm波长的光波长的光 锌灯，发出锌灯，发出214nm214nm波长的光波长的光 镉灯则为镉灯则为229nm229nm和和326nm 326nm 特点：特点： 结构紧凑、造价低、操作维修方便、灵敏度高，结构紧凑、造价低、操作维修方便

28、、灵敏度高，适于梯度洗脱适于梯度洗脱 只能对具特征波长有吸收的物质进行检测只能对具特征波长有吸收的物质进行检测 高效液相色谱法A课件第二种类型：可变波长紫外检测器 氘灯氘灯190190600 nm 600 nm 高效液相色谱法A课件t新发展新发展 可以可以 高灵敏度高灵敏度4 4 波长同时检测波长同时检测 根据根据4 4波长测定得到的吸收值之比波长测定得到的吸收值之比判断峰的纯度判断峰的纯度 具有具有DADDAD检测器的相似功能检测器的相似功能高效液相色谱法A课件第三种类型：光电二极管阵列检测器（DAD） 高效液相色谱法A课件光电二极管阵列检测器高效液相色谱法A课件DAD检测器的主要特点：可以

29、同时得到多个波长的色谱图，可以计算可以同时得到多个波长的色谱图，可以计算不同波长处的相对吸收比不同波长处的相对吸收比可以在色谱分离同时，对色谱峰的指定位置可以在色谱分离同时，对色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图，并得到最大吸收波长实时记录吸收光谱图，并得到最大吸收波长在色谱运行期间，可以逐点进行光谱扫描，在色谱运行期间，可以逐点进行光谱扫描，得到时间得到时间波长波长吸收值为坐标的三维图形吸收值为坐标的三维图形高效液相色谱法A课件DAD检测器的主要特点（续 ）可以选择宽波带进行检测，一次就能把所有组分检测可以选择宽波带进行检测，一次就能把所有组分检测出来出来 DADDAD检测器的一些特殊功能：检

30、测器的一些特殊功能：.色谱峰的准确定性色谱峰的准确定性.进行峰纯度的检验进行峰纯度的检验.选择最佳波长选择最佳波长. .建立光谱库，检索被测样品的光谱建立光谱库，检索被测样品的光谱高效液相色谱法A课件例：山梨酸和苯甲酸部分例：山梨酸和苯甲酸部分 分离的色谱峰分离的色谱峰a.a.山梨酸山梨酸b.b.苯甲酸苯甲酸c.c.混合物混合物高效液相色谱法A课件紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较普通检测器普通检测器普通检测器普通检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器高效液相色谱法A课件（三）荧光检测器（FLD）

31、 荧光检测器是利用测量化合物荧光强度，对化荧光检测器是利用测量化合物荧光强度，对化合物进行检测的检测器。合物进行检测的检测器。在实验条件固定，样品浓度较低时，荧光强度在实验条件固定，样品浓度较低时，荧光强度与样品浓度呈线性关系，因此荧光检测器是浓与样品浓度呈线性关系，因此荧光检测器是浓度敏感性检测器，可直接用于定量分析度敏感性检测器，可直接用于定量分析 高效液相色谱法A课件主要主要特点特点：灵敏度高（高于紫外吸收检测器两个数量级灵敏度高（高于紫外吸收检测器两个数量级 ）选择性好选择性好 产生荧光的必要条件：产生荧光的必要条件： 第一：物质分子中具有能吸收激发光能量的吸收带，第一：物质分子中具有

32、能吸收激发光能量的吸收带，即物质分子必须具有一定的吸收结构即物质分子必须具有一定的吸收结构 第二：物质分子吸收了激发光能量之后具有高的荧光第二：物质分子吸收了激发光能量之后具有高的荧光效率效率定量分析时定量分析时线性范围较窄线性范围较窄 高效液相色谱法A课件受外界条件的影响小受外界条件的影响小当所选用的流动相溶剂不发射荧光，当所选用的流动相溶剂不发射荧光，FLDFLD就能适用于就能适用于梯度洗脱梯度洗脱最小检测浓度可达最小检测浓度可达0.1ng0.1ngmlml，适用于痕量分析，适用于痕量分析氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧

33、光法检测都可以用荧光法检测 高效液相色谱法A课件原理：原理：化合物受到紫外光的照射后，吸收辐射能，化合物受到紫外光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波长长的特征辐射，这种特征辐射发出比吸收波长长的特征辐射，这种特征辐射光线就是荧光光线就是荧光, ,测定发出的荧光能量即可定量测定发出的荧光能量即可定量 l主要包括：激发光源、选择激发波长用的单色器、流通主要包括：激发光源、选择激发波长用的单色器、流通池、选择发射波长用的单色器、用于检测发光强度的光池、选择发射波长用的单色器、用于检测发光强度的光电检测器电检测器高效液相色谱法A课件 目前使用比较多的是目前使用比较多的是激光诱导荧光激光诱导荧光检测器。

34、组成与普通的荧光检测器一样。检测器。组成与普通的荧光检测器一样。 两者的主要两者的主要区别区别为光源，前者光氙弧为光源，前者光氙弧灯（连续式、脉冲式），后者的光源是灯（连续式、脉冲式），后者的光源是激光器，使用较多的是小功率的激光器，使用较多的是小功率的ArAr离子离子激光器激光器高效液相色谱法A课件（四）示差折光检测器（DRD）原理原理：示差折光检测器是通过连续监测参比池和测量：示差折光检测器是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折光指数之差来测定样品浓度池中溶液的折光指数之差来测定样品浓度高效液相色谱法A课件是是通用型通用型检测器检测器, ,如果选择合适的溶剂，如果选择合适的溶剂，几乎所有的

35、物质都可以检测几乎所有的物质都可以检测特别适用于检测特别适用于检测没有紫外吸收的没有紫外吸收的化合物化合物, ,例如糖类例如糖类, ,醇类醇类, ,酯类以及脂肪酸等酯类以及脂肪酸等高分子化合物高分子化合物GPC,GFCGPC,GFC分析以及复杂样分析以及复杂样品纯化品纯化对温度变化敏感对温度变化敏感不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱不宜用于痕量分析不宜用于痕量分析高效液相色谱法A课件标准糖类混合物(单糖和糖醇)样品：样品：1. 麦芽三糖麦芽三糖 2. 蔗糖蔗糖 3. 葡萄糖葡萄糖 4. 半乳糖半乳糖 5. 果糖果糖 6. 甘露醇甘露醇 7. 阿拉伯醇阿拉伯醇 8. 山梨醇山梨醇分析条件：分析条件

36、：柱：柱：CHO620(Ca 2)聚合物柱聚合物柱洗脱液：蒸馏水洗脱液：蒸馏水流速流速 ；0.5ml/min温度温度 ：90 dig.C.检测器：检测器：RI进样量：进样量：20微升微升高效液相色谱法A课件（五）电化学检测器（ECD） 电导检测器是一种选择性检测器，用电导检测器是一种选择性检测器，用于检测阳离子和阴离子，在离子色谱中于检测阳离子和阴离子，在离子色谱中应用广泛应用广泛高效液相色谱法A课件特点：特点：灵敏度高，最小检测量一般为灵敏度高，最小检测量一般为ngng级，有的可达级，有的可达pgpg级级 选择性好，可测定具有电解活性物质（亦可测定大量非选择性好，可测定具有电解活性物质（亦可

37、测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质）电活性物质中极痕量的电活性物质） 线性范围宽，一般为线性范围宽，一般为4 45 5个数量级个数量级 测量时要恒温，不宜用于梯度洗脱测量时要恒温，不宜用于梯度洗脱设备简单，成本较低；设备简单，成本较低；易于自动操作易于自动操作 高效液相色谱法A课件 安培检测器安培检测器 极谱检测器极谱检测器 电化学检测器电化学检测器 库仑检测器库仑检测器 电位检测器电位检测器 电导检测器电导检测器 高效液相色谱法A课件(六)其它类型检测器 通用型质量检测器通用型质量检测器应具备应具备的性能的性能: :样品结构不需要具备紫外发色团或合适的折射样品结构不需要具备紫外发色团或

38、合适的折射率率对梯度洗脱和流动相系统温度变化不敏感对梯度洗脱和流动相系统温度变化不敏感对各种物质的响应因子很近对各种物质的响应因子很近在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质高效液相色谱法A课件 目前最能接近这些要求的检测器为蒸发光目前最能接近这些要求的检测器为蒸发光散射检测器。它包括蒸发光散射检测器和凝聚散射检测器。它包括蒸发光散射检测器和凝聚成核光散射检测器。成核光散射检测器。优点优点： 与示差折光检测器相比，与示差折光检测器相比，灵敏度高，对流动相灵敏度高，对流动相系统温度变化影响不敏感，可进行梯度洗脱系统温度变化影响不敏感，可进行梯度洗脱A.A.蒸发

39、光散射检测器蒸发光散射检测器(ELSD)(ELSD)高效液相色谱法A课件蒸发光散射检测器（续）蒸发光散射检测器（续）与紫外检测器相比的优点与紫外检测器相比的优点 能解决最困难的能解决最困难的HPLCHPLC的检测问题的检测问题 没有流动相和杂质的紫外吸收干扰，提高没有流动相和杂质的紫外吸收干扰，提高了检测灵敏度和色谱峰的分辨率了检测灵敏度和色谱峰的分辨率 无需测定定量校正因子无需测定定量校正因子缺点：缺点：要受到样品组分和流动相的挥发性影响，要受到样品组分和流动相的挥发性影响，即：样品组分应该是非挥发性或半挥发性的，即：样品组分应该是非挥发性或半挥发性的，而流动相应该是易挥发性的溶剂而流动相应

40、该是易挥发性的溶剂高效液相色谱法A课件蒸发光散射检测器原理示意图蒸发光散射检测器原理示意图高效液相色谱法A课件B.B.手性检测器手性检测器 在现有的检测器基础上，手性化合物的在现有的检测器基础上，手性化合物的HPLCHPLC分析分析方法有：方法有：使用手性柱，方法使用方便、效果好，但手性柱价格使用手性柱，方法使用方便、效果好，但手性柱价格贵、寿命短、且通用性差贵、寿命短、且通用性差在流动相中加入手性试剂，使被分析物和手性对离子在流动相中加入手性试剂，使被分析物和手性对离子形成离子对，用普通条件即可分分离形成离子对，用普通条件即可分分离通过衍生化处理通过衍生化处理 应用最多的手性检测器是：应用最多的手性检测器是：圆二色圆二色液相色谱检测器液相色谱检测器和以二极管激光器做光源的和以二极管激光器做光源的旋光旋光检测器检测器高效液相色谱法A课件C.分子量检测器D.放射性检测器E.热学性质检测器F.化学发光检测器高效液相色谱法A课件六、色谱工作站色谱工作站的主要功能：色谱工作站的主要功能：（1 1）自行诊断功能）自行诊断功能（2 2）全部操作参数控制功能）全部操作参数控制功能（3 3）智能化数据处理和谱图处理功能）智能化数据处理和谱图处理功能（4 4）进行计量认证的功能）进行计量认证的功能（5 5）网络运行功能）网络运行功能高效液相色谱法A课件