分光光度课件

第第7章章 吸光光度法吸光光度法7.1 概述概述7.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理7.3 分析方法和仪器分析方法和仪器7.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素7.5 光度分析法的设计光度分析法的设计7.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差7.7 吸光光度法的应用吸光光度法的应用分光光度课件吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法度法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁基于外层电子跃迁7.1 概述概述•吸收光谱吸收光谱•发射光谱发射光谱•散射光谱散射光谱n分子光谱分子光谱n原子光谱原子光谱分光光度课件7.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理一、一、 吸收光谱产生的原因吸收光谱产生的原因光谱名称波长范围X射线0.1~10nm远紫外光10~200nm近紫外光近紫外光200~400nm可见光可见光400~750nm近红外光0.75~2.5um中红外光2.5~5.0um远红外光5.0~1000um微波0.1~100cm无线电波1～1000m当光子的能量与分子的当光子的能量与分子的 E匹配时，匹配时，就会吸收光子就会吸收光子  E=hu u=hc/ 光光: :一种电磁波一种电磁波, ,波粒二象性波粒二象性 单色光：具有相同能量(相同波长)的光.混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起。

 /nm颜色颜色互补光互补光400 ～～ 450紫紫黄绿黄绿450 ～～ 480蓝蓝黄黄480 ～～ 490绿蓝绿蓝橙橙490 ～～ 500蓝绿蓝绿红红500 ～～ 560绿绿红紫红紫560 ～～ 580黄绿黄绿紫紫580 ～～ 610黄黄蓝蓝610 ～～ 650橙橙绿蓝绿蓝650 ～～ 760红红蓝绿蓝绿二、物质颜色和其吸收光关系二、物质颜色和其吸收光关系分光光度课件例如：例如：CuSO4溶液溶液吸收黄光吸收黄光透过蓝光透过蓝光透过蓝光透过蓝光白光白光→人眼人眼CuSO4实验证明：实验证明： CuSO4溶液浓度越高，对黄色光的吸收溶液浓度越高，对黄色光的吸收越多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深越多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深5分光光度课件吸收光谱曲线：吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小物质在不同波长下吸收光的强度大小 A～～ 关系关系最大吸收波长最大吸收波长  max：：光吸收最大处的波长光吸收最大处的波长三、一些基本名词和概念三、一些基本名词和概念 max对比度对比度(Δ ):络合物最大吸络合物最大吸收波长收波长( MRmax)与试剂最大与试剂最大吸收波吸收波( Rmax)之差之差Δ Cr2O72-、、MnO4-的吸收光谱的吸收光谱300400500600700 /nm350525 545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350原子光谱为线光谱原子光谱为线光谱分子光谱为带光谱分子光谱为带光谱电子跃迁能级电子跃迁能级分子振动能级分子振动能级分子转动能级分子转动能级 分光光度课件Ø不同物质吸收光谱的形状以及不同物质吸收光谱的形状以及 max 不同不同——定性分析的基础定性分析的基础Ø同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax 不同不同——定量分析的基础定量分析的基础9分光光度课件四、朗伯四、朗伯- -比尔定律比尔定律I0 = Ir + It + IaI0 = It + IaI0IrItIaT = It / I0 , T: 透射比或透光度透射比或透光度 A=lg (I0 / It )＝＝lg(1/T), A:吸光度吸光度分光光度课件朗伯定律朗伯定律: :(1760) (1760) A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的当入射光的  , ,吸光物质的吸光物质的c 一定时一定时, ,溶液的吸光溶液的吸光度度A与液层厚度与液层厚度b成正比成正比. .比尔定律比尔定律( (1852) 1852) A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的当入射光的  , ,液层厚度液层厚度b 一定时一定时, ,溶液的吸光度溶液的吸光度A与吸光物质的与吸光物质的c成正比成正比. .分光光度课件 当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的的吸光度吸光度与溶液中吸光质点的与溶液中吸光质点的浓度及光程浓度及光程（溶液的（溶液的厚度）成正比关系－－－朗伯比尔定律厚度）成正比关系－－－朗伯比尔定律 －－－－－－光吸收定律光吸收定律 数学表达：数学表达：A＝＝lg(1/T)=Kbc其中，其中，A:吸光度，吸光度，T:透射比，透射比， K:比例常数，比例常数，b:溶液厚度，溶液厚度，c:溶液浓度溶液浓度注意：注意： 平行单色光平行单色光 均相介质均相介质 无发射、散射或光化学反应无发射、散射或光化学反应 稀溶液稀溶液分光光度课件吸光度吸光度A、透射比、透射比T与浓度与浓度c 的关系的关系AT (%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100 80 60 40 2013分光光度课件灵敏度表示方法灵敏度表示方法摩尔吸光系数摩尔吸光系数  A =   bcA = K Kbcc: mol/Lε 表示物质的浓度为表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为液层厚度为1cm时溶液时溶液的吸光度。

的吸光度单位：单位： (L•mol-1 •cm-1) c: g/LA = abc a: 吸光系数吸光系数分光光度课件溶液浓度的测定溶液浓度的测定A＝＝  b c工作曲线法工作曲线法( (校准曲线校准曲线) )朗伯朗伯- -比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)A 0.800.600.400.200.00Axcx分光光度课件标准比较法：标准比较法：As =   b cs （（标准样品标准样品) Ax =   b cx （（待测样品待测样品) 注意注意: 用用比较法测定时，所用标准溶液浓度应与待测比较法测定时，所用标准溶液浓度应与待测 溶液的浓度相接近，且溶液的浓度相接近，且实验条件应相同实验条件应相同五、吸光度的加和性与吸光度的测量五、吸光度的加和性与吸光度的测量 A = A1 + A2 + … +An 用参比溶液调用参比溶液调T=100%（（A=0），再测样品溶），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等溶剂、试剂对光的吸收等。

17分光光度课件方便、灵敏，但准确度差，常用于限界分析方便、灵敏，但准确度差，常用于限界分析7.3 分析方法和仪器分析方法和仪器一、目视比色法一、目视比色法观察方向观察方向空白空白c1c2c3c418分光光度课件二、光电比色法二、光电比色法光电比色计结构示意图光电比色计结构示意图通过滤光片得一窄范围的光通过滤光片得一窄范围的光( (几十几十nm)nm)分光光度课件 滤光片滤光片吸收滤光片吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光通过，其：只允许指定的窄范围波长光通过，其他波长的光均被吸收他波长的光均被吸收选择滤光片的原则：选择滤光片的原则： 滤光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光滤光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光, , 即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补分光光度课件三、三、 分光光度法和分光光度计分光光度法和分光光度计通过通过棱镜或光栅棱镜或光栅得到一束近似的单色光，得到一束近似的单色光，波长可调波长可调, , 故选择性好故选择性好, , 准确度高准确度高光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器读出系统读出系统1.1.分光光度计的基本原件分光光度计的基本原件21分光光度课件常用光源常用光源光源波长范围(nm)适用于氢灯185~375紫外氘灯185~400紫外钨灯320~2500可见，近红外卤钨灯250~2000紫外，可见，近红外氙灯180~1000紫外、可见（荧光）能斯特灯1000~3500红外空心阴极灯特有原子光谱激光光源特有各种谱学手段分光光度课件氙灯氙灯氢灯氢灯钨灯钨灯分光光度课件单色器单色器 作用作用:产生单色光产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅常用的单色器：棱镜和光栅样品池（比色皿）样品池（比色皿） 厚度厚度(光程光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、石英比色皿－－可见、紫外光区紫外光区分光光度课件检测器检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器：常用检测器： 光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 光二极管阵列光二极管阵列光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用化铯为红敏，适用625－－1000nm波长；阴极波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用表面涂锑和铯为紫敏，适用200－－625nm波长波长分光光度课件1)单光束分光光度计单光束分光光度计2.分光光度计的基本类型分光光度计的基本类型0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示分光光度课件2) 双光束分光光度计双光束分光光度计双光束型可以消除光源强度变化的影响。

双光束型可以消除光源强度变化的影响比值比值光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示光束分裂器光束分裂器27分光光度课件多通道仪器多通道仪器（（Multichannel Instruments））光电二极管阵列光电二极管阵列(通常具有通常具有316个硅二极管个硅二极管) photodiode arrays (PDAs) 同时测量同时测量200～～820nm范围内的整个光谱范围内的整个光谱, 比单个比单个检测器快检测器快316倍倍,信噪比增加信噪比增加3161/2 倍倍. 3) 其他类型分光光度计其他类型分光光度计纤维光度计纤维光度计将光度计放入样品中将光度计放入样品中, 原位测量原位测量. 对环境和过程对环境和过程监测非常重要监测非常重要.28分光光度课件7.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素要求：要求：a. 选择性好选择性好b. 灵敏度高灵敏度高 (ε>104)c. 产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d. 化学性质稳定化学性质稳定e. 反应和产物有明显的颜色差别反应和产物有明显的颜色差别 (  >60nm) 没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定－－量生成有色化合物再测定－－ 显色反应显色反应一、一、 显色反应显色反应分光光度课件二、二、 显色反应的影响因素（显色反应条件）显色反应的影响因素（显色反应条件）a 溶液酸度（溶液酸度（pH值及缓冲溶液）值及缓冲溶液）u 影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δlu 影响待测离子的存在状态，防止沉淀u 影响络合物组成形式形式 pH λmax(nm) 形式形式 pH λmax(nm)H4L+ 1.2 462-465 Sn4+ 1.0 530H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+ 5.0 550H2L- 8.4-9.0 512HL2- 11.4-12.0 532-538pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响对苯芴酮及其络合物的颜色影响 分光光度课件b 显色剂的用量显色剂的用量稍过量，处于平台区稍过量，处于平台区 c 显色反应时间显色反应时间针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定d 显色反应温度显色反应温度加热可加热可加快反应速度，但易导致许多显色剂或产物分解分光光度课件e 溶剂溶剂f 干扰离子干扰离子 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率 消除共存离子干扰的方法：消除共存离子干扰的方法： 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比选择合适参比 褪色空白褪色空白(铬天菁铬天菁S测测Al，氟化铵褪色，消除锆、，氟化铵褪色，消除锆、 镍、钴干扰镍、钴干扰) 选择适当波长选择适当波长 分光光度课件（一）、无机显色剂（一）、无机显色剂（一）、无机显色剂（一）、无机显色剂 钼酸铵法钼酸铵法(测测 P、、 Si、、W)，， 过氧化氢法过氧化氢法(测测V5＋＋、、Ti4＋＋)（二）有机显色剂（二）有机显色剂（二）有机显色剂（二）有机显色剂（主要使用）（主要使用） 1 1、、、、OO，，，，OO给电子螯合剂：给电子螯合剂：给电子螯合剂：给电子螯合剂： 铬天菁铬天菁S（（CAS）、苯基荧光酮（）、苯基荧光酮（ PF ）） 2 2、、、、OO，，，，N N给电子螯合剂：给电子螯合剂：给电子螯合剂：给电子螯合剂：偶氮胂偶氮胂III等等三、分光光度法常用的显色剂三、分光光度法常用的显色剂分光光度课件3 3、、、、N N，，，，N N给电子基团给电子基团给电子基团给电子基团：邻二氮杂菲（测：邻二氮杂菲（测Fe）等）等4、带含硫基团的螯合剂：双硫腙（测、带含硫基团的螯合剂：双硫腙（测Cu、、Pb、、Zn、、Cd、、Hg等）等）分光光度课件7.5 光度分析法的设计光度分析法的设计a 选择合适的入射光波长，无干扰时选择最大吸选择合适的入射光波长，无干扰时选择最大吸 收峰波长收峰波长 max。

b 确定线性区间确定线性区间c 控制吸光度读数范围在控制吸光度读数范围在0.2~ 0.8 之间d 选择适当的参比溶液进行测量选择适当的参比溶液进行测量分光光度课件7.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差吸光度测量的误差 对朗伯对朗伯-比尔定律的偏移比尔定律的偏移分光光度课件一、一、非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移 复复合合光光由由 1和和 2组组成成，，对对于于浓浓度度不不同同的的溶溶液液a和和b,引引起起的的吸吸光光度度的的偏偏差差不不一一样样，，浓浓度度大大，，复复合合光光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲 分光光度课件非均匀介质非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯吸光度增加，导致线性关系上弯二、物理化学因素二、物理化学因素离解、缔合、异构等离解、缔合、异构等如：如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42- PAR的偶氮－醌腙式的偶氮－醌腙式 化学反应化学反应分光光度课件吸光度标尺刻度不均匀吸光度标尺刻度不均匀三、吸光度测量的误差三、吸光度测量的误差A＝＝0.434 ，，T＝＝36. 8% 时，测量的相对误差最小时，测量的相对误差最小A=0.2~0.8, T=15~65%，相对误差，相对误差<4% dc/c= dA/A=dT/TlnT Er=dc/c×100％％= dA/A×100％％=dT/TlnT×100％％分光光度课件测量误差公式推导测量误差公式推导: :dA = d(－－lgT) = d(－－0.434lnT) = －－ 0.434dT/TA= －－ lgT T lgT 最大时，即最大时，即(TlgT) ′= 0 时误差最小时误差最小, 算得算得 lgT = －－ 0.434 , T = 36.8% , A = 0.43440分光光度课件1086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434浓度测量浓度测量的相对误的相对误差与差与T(或或A)的关系的关系实际工作中，应控制实际工作中，应控制T 在在15～～65％％, A 在在0.2～～0.8之间之间41分光光度课件 实际工作中为使测量的浓度相对误差较小，实际工作中为使测量的浓度相对误差较小，吸光度吸光度A控制在控制在0.2~0.8之间。

之间措施：措施： 通过通过富集、稀释和增减比色皿长度富集、稀释和增减比色皿长度，，使测量的使测量的吸光度范围在吸光度范围在0.2~0.8之间分光光度课件7.7 吸光光度法的应用吸光光度法的应用一、一、 单一组分测定单一组分测定1) 金属离子金属离子: Fe-Ssal, Ni-丁二酮肟丁二酮肟2) 蛋白质测定蛋白质测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等溴甲酚绿、考马司亮蓝等3) 氨基酸测定氨基酸测定—茚三酮茚三酮(紫色化合物紫色化合物)4) 水质检测水质检测: NH4+、、NO2-、、Mn2+、、Fe2+、、 Hg2+5) 药物含量测定药物含量测定—比吸光系数定量；荷移光谱法测比吸光系数定量；荷移光谱法测定分光光度课件二、多组分的测定二、多组分的测定 xl1, eyl1, exl2, eyl2由由x,y标液标液 在在 1,  2处分别测得处分别测得.a)在在 1处测组分处测组分x, 在 2处测组分处测组分y.b) 在在 1处测组分处测组分x; 在在 2处测总吸处测总吸收收,扣除扣除x吸收吸收,可求可求y.c) x,y组分不能直接测定组分不能直接测定A1=exl1bcx+ eyl1bcy(在 1处测得处测得A1) A2 =exl2bcx+ eyl2bcy(在 2处测得处测得A2)分光光度课件三、高浓度溶液的示差光度法测定三、高浓度溶液的示差光度法测定标准溶液：标准溶液：cs待测溶液：待测溶液： cx cx > cs Ax = abcx As = abcs ΔA = ab(cx – cs) = abΔc分光光度课件操操 作作Ø 以以cs（浓度低于未知溶液）为参比溶液，调节（浓度低于未知溶液）为参比溶液，调节T = 100%(A = 0);Ø 测定一系列浓度高于测定一系列浓度高于cs的标准溶液的吸光度的标准溶液的吸光度A(即即ΔA）；）；Ø 以以ΔA ～～Δc 作工作曲线；作工作曲线；Ø 测定未知溶液的吸光度测定未知溶液的吸光度Ax（即（即ΔAx ）；）； cx = cs +Δc 原理原理:参比溶液与未知溶液透光度的比值恒定参比溶液与未知溶液透光度的比值恒定分光光度课件示差法提高准确度的实质示差法提高准确度的实质常规法常规法TxT0 5 1050100 落在测量误差较大的范围落在测量误差较大的范围T0 5 1050100TrTsTs 落在测量误差较小的范围落在测量误差较小的范围结论：结论：示差法通过提高测量的准确度提高了示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度方法的准确度示差法示差法分光光度课件四、四、 光度滴定光度滴定NaOH滴定滴定 对硝基酚对硝基酚 pKa=7.15 间硝基酚间硝基酚 pKa=8.39  pKa=1.24V1V2V(NaOH)/mL对硝基酚对硝基酚间硝基酚间硝基酚酸形均酸形均无色无色. .碱形均碱形均黄色黄色48分光光度课件典型的光度滴定曲线典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。

依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法Vsp滴定剂吸收滴定剂吸收Vsp被滴物吸收被滴物吸收Vsp滴定剂与待滴定剂与待测物均吸收测物均吸收Vsp产物吸收产物吸收49分光光度课件五、络合物组成的测定五、络合物组成的测定1. 摩尔比法摩尔比法: 固定固定cM ,改变改变cR 1:13:1c(R)/c(M)A1.0 2.0 3,0 分光光度课件2. 等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:20 0.2 0.4 0.6 0.8 10 0.2 0.4 0.6 0.8 1分光光度课件六、一元弱酸离解常数的测定六、一元弱酸离解常数的测定HL H＋＋＋＋LKa＝＝[H+][L]/[HL]高酸度下，几乎全部以高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得存在，可测得AHL＝＝εHL·c(HL)；；低酸度下，几乎全部以低酸度下，几乎全部以L存在，可测得存在，可测得AL ＝＝εL·c(HL).代入整理：代入整理：或或配制一系列配制一系列c相同相同,pH不同的溶液不同的溶液,测测A.HL、、L 颜色不同颜色不同[HL][L]分光光度课件MO吸收曲线吸收曲线Aa(HL)Ab(L)123456Ab654321Aa350400450500550600 /nmA曲线曲线pH11.10, 1.3822.6533.0643.4853.9865.53,6.80由每份溶液的一由每份溶液的一对对pH、、A，可求，可求得一个得一个Ka, 取平取平均值即可。

均值即可分光光度课件1 了了解解分分子子对对光光的的吸吸收收与与溶溶液液颜颜色色的的关关系系. 吸吸收收曲曲线线—定定性性分分析的基础析的基础 定定量量分分析析的的基基础础—朗朗伯伯-比比尔尔定定律律：：A= bc=-lgT 式式中中各各参数的物理意义，定量计算参数的物理意义，定量计算2 了了解解目目视视比比色色法法、、分分光光光光度度法法的的特特点点，，分分光光光光度度计计的的基基本本部件3 灵敏度的表示灵敏度的表示—摩尔吸光系数的意义和计算；摩尔吸光系数的意义和计算； 准确度准确度—适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因4 显显色色反反应应及及条条件件的的确确定定: 显显色色剂剂用用量量、、酸酸度度、、时时间间、、温温度度、、干扰及消除干扰及消除5 应应用用: 单单一一组组分分测测定定示示例例、、多多组组分分测测定定、、光光度度滴滴定定、、络络合合物组成的测定、酸碱离解常数的测定物组成的测定、酸碱离解常数的测定小结小结分光光度课件。