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1、萃取分离技术利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。一 有机溶剂萃取注意防止变性：温度，接触时间1有机溶剂选择2操作：萃取，分离第二章第二章生物制药工艺技术基础生物制药工艺技术基础双水相萃取双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。双水相体系是指某些有机物之间或有机物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成互不相溶的2 相或多相水相体系。双水相体系萃取分离原理是基于生物质在双水相体系中的选择性分配。当生物物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。双水相萃取体系的特点:(1 ) 易于放
2、大，各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低。(2 ) 双水相系统之间的传质和平衡过程速度快，收效率高，相对于某些分离过程来说，能耗较小，速度快。如选择适当体系，回收率可达80%以上，提纯倍数可达2 20 倍；(3 ) 易于进行连续化操作，设备简单，且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；双水相萃取的应用:生物工程技术中物质的提取与纯化;中草药有效成分的提取分配系数的大小决定了萃取分离的效果。可采取修饰高分子聚合物的方式提高分配系数。超临界萃取超临界流体：在温度和压力超过某物质的超临界点时，该物质称为超临界流体。超临界萃取所用的萃取剂为超临界流体，超临界流体是介于气液之间的一种既非气态
3、又非液态的物态，这种物质只能在其温度和压力超过临界点时才能存在。超临界流体的密度较大，与液体相仿，而它的粘度又较接近于气体。因此超临界流体是一种十分理想的萃取剂。超临界流体的溶剂强度取决于萃取的温度和压力。利用这种特性，只需改变萃取剂流体的压力和温度，就可以把样品中的不同组分按在流体中溶解度的大小，先后萃取出来，在低压下弱极性的物质先萃取，随着压力的增加，极性较大和大分子量的物质与基本性质，所以在程序升压下进行超临界萃取不同萃取组分，同时还可以起到分离的作用。特点：介于液体与气体之间，溶解能力与液体接近，扩散系数接近于气体。应用2.干燥：干燥：低温真空干燥；低温真空干燥；喷雾干燥；喷雾干燥；冷
4、冻干燥冷冻干燥色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦第一节、 生物材料的预处理 生物材料的特点1、含量低 如胰岛素在胰脏中的含量为0.02%，胆汁中胆红素含量为0.050.08%2、杂质多 3、易变性失活第二章第二章生物材料的预处理生物材料的预处理和液固分离和液固分离一、选择预处理方法的依据 1、生物活性物质来源、存在状态 “胞内” 、“胞外”、前体2、后续工艺要求3、稳定性 可被材料中酶、微生物破坏，还可能受酸、碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温度、甚至空气和光线作用改变活性。影响凝聚作用的主要因素有无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序
5、为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+ 常用的凝聚剂有：Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。 在发酵液中加入具有相反电性的电解质：、中和胶粒电性，降低双电层排斥力。 、离子的水化作用，破坏胶粒的水化层。 2、加入絮凝剂 絮凝剂是天然的或人工合成的有机高分子化合物，如壳聚糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类等。 絮凝剂具有长链线状的结构，易溶于水，其分子量可高达数万至一千万以上，在长的链上含有相当多的活性功能团。影响絮凝效果的因素主要有： （1）絮凝剂的分子量： （2）絮凝剂的用量： （3）溶液pH值
6、： （4）搅拌速度和时间： 3、变性沉淀 4、等电点沉淀 5、加各种沉淀剂沉淀 6、吸附 四、多糖的去除 可用酶转化为单糖 黏多糖可与一些阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵（CTAB）生成沉淀去除。 五、高价金属离子的去除 1、离子交换法 2、沉淀法 Ca2+ 草酸 Mg2+ 磷酸盐,三聚磷酸钠 Fe3+ 黄血盐 第二节、第二节、细胞破碎细胞破碎一、机械法 1、匀浆法 2、珠磨法 3、超声波三、化学法 1、化学试剂处理 2、酶解法 3、制成丙酮粉二、物理法 1、干燥 2、冻融 3、渗透压冲击一、机械法（一）高速珠磨机（二）超声波振荡器 二、物理法（一）干燥法 空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干
7、燥（二）冻融法（三）渗透压冲击法 先把细胞放在高渗溶液中，细胞发生收缩，然后将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，细胞快速膨胀，使产物释放至溶液中三、化学法（一）、加入化学试剂 1、用碱处理 2、用脂溶性有机溶剂 3、表面活性剂（二）酶解法（三）制成丙酮粉四、选择破碎方法的依据（一）、规模及成本 工业规模：高压匀浆和珠磨（二）、目的物的稳定性（三）、破碎效果和产物释放率第三节、第三节、液液-固分离固分离一、过滤（一）过滤方式 1、常规过滤 2、错流过滤（二）、过滤设备1、漏斗式2、板框过滤机二、离心分离1、过滤式离心机2、螺旋式离心机3、管式离心机三、影响液三、影响液-固分离的因素固分离的因
8、素（一）、悬浮物种类（二）、悬浮液黏度（三）、其他因素凝胶层析凝胶层析(Gelchromatography)分分子子筛筛层层析析、凝凝胶胶扩扩散散层层析析、排排阻阻层层析析、限限制扩散层析等。制扩散层析等。是是将将样样品品混混合合物物通通过过一一定定孔孔径径的的凝凝胶胶固固定定相相，由由于于各各组组分分流流经经体体积积的的差差异异，使使不不同同分分子子量量的组分得以分离的层析方法。的组分得以分离的层析方法。第四节第四节凝胶层析凝胶层析(Gelchromatography)18一、一、凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝凝胶胶层层析析的的分分离离过过程程是是在在装装有有多孔物质填料的柱中进行的
9、。多孔物质填料的柱中进行的。柱柱的的总总体体积积为为VA，它它包包括括填填料料的的骨骨架架体体积积VGM，填填料料的的孔孔体体积积Vi(内内水水体体积积)以以及及填填料料颗颗粒之间的体积粒之间的体积V0（外水体积）。（外水体积）。VA=V1+V0+VGM流动分离理论流动分离理论较大的分子较先通过或绕过较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。其大小进行分离。20分离过程分离过程三种不同分子量物三种不同分子量物质的混合样品用某质的混合样品用某种规格的凝胶柱进种规格的凝胶柱进行分离。行分离。样品加入，以水或样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，其他溶液进行
10、洗脱，即得洗脱曲线即得洗脱曲线。21分离过程分离过程最最先先流流出出物物质质A，A分分子子量量最最大大，完完全全不不能能进进入入颗颗粒粒内内部部，只只能能从从颗颗粒粒间间隙隙流流过过，“全全排阻排阻”。其流经体积最小，等于外水体积。其流经体积最小，等于外水体积V0。最最后后流流出出物物质质C，它它分分子子量量最最小小，其其分分子子可可以以自自由由进进出出凝凝胶胶颗颗粒粒，“全全渗渗入入”。流流经经体体积是外水体积与内水体积之和积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。物物质质B分分子子量量介介于于渗渗入入限限与与排排阻阻限限之之间间，其其分分子子能能够够部部分分地地进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒中中。“
11、部部分分排排阻阻”或或“部部分分渗渗入入”。流流径径体体积积Ve是是全全部部外外水水体积加上内水体积的一部分，即体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi22凝胶层析的特点凝胶层析的特点（1）凝凝胶胶层层析析操操作作简简便便，所所需需设设备备简简单。单。（2）分离效果较好，重复性高。）分离效果较好，重复性高。（3）分离条件缓和。）分离条件缓和。（4）应用广泛。）应用广泛。（5）分辨率不高，分离操作较慢。）分辨率不高，分离操作较慢。23第二节第二节凝胶的结构和性质凝胶的结构和性质一、一、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex)二、修饰葡聚糖凝胶二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSepha
12、dex)三、三、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）四、四、琼脂糖类凝胶琼脂糖类凝胶（Sepharose）五、多孔玻璃微球五、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝胶六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）24一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶(Sephadex)商品名为商品名为SephadexG类类.交联葡聚糖的基本骨架是葡交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。聚糖。再经再经3-氯氯-1，2-环氧丙烷为环氧丙烷为交联剂交联剂，形成三维网状结构，形成三维网状结构的高分子化合物。的高分子化合物。其其交联度是通过交联剂的加交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的量及反应条件来控制的。
13、25保存保存保存的方法有保存的方法有干法、湿法和半缩法干法、湿法和半缩法三种。三种。湿湿法法：加加入入一一定定量量的的防防腐腐剂剂置置于于冰冰箱箱中中作作短短期期保保存（存（6个月以内）。个月以内）。常常用用0.02%叠叠氮氮化化钠钠、0.02%三三氯氯叔叔丁丁醇醇、20%乙醇等。乙醇等。干干法法：用用浓浓度度逐逐渐渐升升高高的的乙乙醇醇分分步步处处理理洗洗净净的的凝凝胶，脱水收缩，抽滤，用胶，脱水收缩，抽滤，用6080吹干。吹干。26二、修饰葡聚糖凝胶二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)（一一）亲亲脂脂性性葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶（LipophilicSephadex）骨骨架架
14、结结构构上上引引入入一一些些有有机机基基团团，如如甲甲基基、羟羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。（二二）交交联联葡葡聚聚糖糖离离子子交交换换剂剂（Sephadexion-exchanger）将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。各种交换剂。27 （三）（三）Supperdex系凝胶系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。成。（四）（四）Sephacryl系凝胶系凝胶是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。交联制成的。
15、理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。28三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶商商品品名名为为生生物物凝凝胶胶-P（Bio-GelP）。）。该该凝凝胶胶由由丙丙烯烯酰酰胺胺组组成成；以以亚亚甲甲基基双双丙丙烯烯酰酰胺胺为为交交联联剂剂，聚聚合而成。合而成。聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶的性质 生物凝胶的编号反映出它的分离界限。生物凝胶的编号反映出它的分离界限。如如Bio-GelP-100。29四、琼脂糖类凝胶四、琼脂糖类凝胶（Sepharose）（一）琼脂糖凝胶（一）琼脂糖凝胶结结构构是是由由-D-半半乳乳糖糖与与3，6-脱脱水水-L-半半乳乳糖糖
16、以以-1，3-和和-1，4-糖糖苷苷键键相相间间连连接接而而成成的的链状分子。链状分子。30琼脂糖凝胶特点琼脂糖凝胶特点1、没有共价键的交联。、没有共价键的交联。2、孔径孔径琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度。3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。4、非特异性吸附力低。、非特异性吸附力低。5、分离范围大分离范围大。6、颗粒强度差。颗粒强度差。31琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶有琼脂糖凝胶有3个规格：个规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为分别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。32（二）架桥琼脂糖凝胶（二）架桥琼脂糖凝胶（SepharoseCL
17、）架架桥桥琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶为为琼琼脂脂线线性性分分子子经经1，3-二二溴丙醇溴丙醇交联的凝胶。交联的凝胶。它它的的凝凝胶胶孔孔径径均均匀匀，机械强度机械强度明显加大。明显加大。对对热热和和化化学学物物质质的的稳稳定定 性性 大大 大大 增增 加加 , ,在在pH314范围内稳定范围内稳定。33（三）超胶（三）超胶（Utro-gelACA）所谓超胶是所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。的混合凝胶。商商品品名名称称后后面面的的编编号号为为两两位位数数，各各表表示示混混合合胶胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。34（四）（四）Superose系
18、凝胶系凝胶 是是由由珠珠状状琼琼脂脂糖糖经经两两次次交交联联制制得得的的可可用用于于HPLC的的高速高速凝胶过滤介质。凝胶过滤介质。有有6%和和12%两个规格。两个规格。35五、多孔玻璃微球五、多孔玻璃微球(Bio-glas)特点：特点：1、化学稳定性高、化学稳定性高、强度大强度大。2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。3、编号表示其、编号表示其孔径孔径,越大，分离分子量也越大。越大，分离分子量也越大。36六、疏水性凝胶（六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。Styragel商品商品, ,
19、 分离范围为分离范围为160040000000。生物珠生物珠（Bio-BeadS），适于分离分子量较小的），适于分离分子量较小的物质。物质。分离不溶水的有机物质分离不溶水的有机物质。37第三节第三节凝胶层析的实验条件和操作凝胶层析的实验条件和操作一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理二、凝胶层析柱的设计和制备二、凝胶层析柱的设计和制备三、凝胶层析操作三、凝胶层析操作四、主要参数测算四、主要参数测算第三节第三节凝胶层析的实验凝胶层析的实验条件和操作条件和操作38一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理（一）凝胶的选择（一）凝胶的选择(1).将将分分子子量量极极为为悬悬殊殊的的两两类类物物质质分
20、分开开，如如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。(2).将将分分子子量量相相差差不不大大的的大大分分子子物物质质加加以以分分离离，如如分分离离血血清清球球蛋蛋白白与与白白蛋蛋白白，这这叫叫做做分级分离。分级分离。39（二）凝胶粒度的选择（二）凝胶粒度的选择细细粒粒凝凝胶胶柱柱流流速速低低，洗洗脱脱峰峰窄窄，分分辨辨率率高高，用用于精制分离或分析。于精制分离或分析。粗粗粒粒凝凝胶胶柱柱流流速速高高，洗洗脱脱峰峰平平坦坦，分分辨辨率率低低，用于粗制分离，脱盐。用于粗制分离，脱盐。40（三）凝胶的预处理（三）凝胶的预处理使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，使用前须溶
21、涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。并达到平衡。干胶以干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。倍以上吸液量的溶剂浸泡。热法溶涨热法溶涨( (水浴水浴) )。41二、凝胶层析柱的设计和制备二、凝胶层析柱的设计和制备（一）层析柱的选择（一）层析柱的选择层析柱长度与直径的比值称作层析柱长度与直径的比值称作“柱比柱比”。对对于于类类分分离离，柱柱床床体体积积一一般般为为样样品品溶溶液液体体积积的的5倍，柱比倍，柱比5:1到到10:1即可。即可。对对于于分分级级分分离离，则则要要求求柱柱床床体体积积大大于于样样品品体体积积25倍倍以以上上，甚甚至至多多达达100倍倍。柱柱比比在在25至至100之间。之间。
22、42（二）凝胶柱的装填（二）凝胶柱的装填常常用用的的支支持持物物有有棉棉花花、玻玻璃璃纤纤维维、玻玻璃珠、垂熔玻璃等。璃珠、垂熔玻璃等。空柱中应留约空柱中应留约1/5的水或溶剂的水或溶剂. .不不断断搅搅拌拌下下使使胶胶粒粒均均匀匀沉沉降降，使使不不发发生凝胶分层和胶面倾斜。生凝胶分层和胶面倾斜。43（三）凝胶床的检查和维护（三）凝胶床的检查和维护观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。有有色色物物质质溶溶液液过过柱柱，观观察察柱柱床床有有无无沟沟流流，色带是否平整。色带是否平整。检查物质为检查物质为蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖。44操作压 层析柱由于进出口之层析柱由于
23、进出口之间液位压力差形成的间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称对凝胶颗粒的压力称作作“操作压操作压”。 45三、凝胶层析操作三、凝胶层析操作（一）样品和加样（一）样品和加样蛋蛋白白质质类类样样品品浓浓度度:不不大于大于4%。加加样样时时应应尽尽量量减减少少样样品品的的稀稀释释，及及凝凝胶胶床床面面的的搅动。搅动。 样品粘度对洗脱曲线的影响柱：交联葡聚糖G-25，485cm；流速180ml/h；样品：0.1%血红蛋白+1.0%氯化钠；（1）相对粘度为0.118；（2）相对粘度为0.042；（3）相对粘度为0.01046（二）洗脱与收集（二）洗脱与收集1、洗脱剂。、洗脱剂。2、流流速速（操操作作压
24、压、型型号号、粒度）。粒度）。3、分部收集器。分部收集器。47（三）凝胶柱的再生（三）凝胶柱的再生反冲。反冲。重新装柱。重新装柱。48第四节第四节凝胶层析的应用凝胶层析的应用一、脱盐和浓缩一、脱盐和浓缩二、分子量测定二、分子量测定三、分离纯化三、分离纯化49一、脱盐和浓缩一、脱盐和浓缩脱脱盐盐用用的的凝凝胶胶多多为为大大粒粒度度的的，高高交交联联度度的的凝胶。凝胶。交交联联度度大大，凝凝胶胶颗颗粒粒强强度度好好；凝凝胶胶粒粒度度大大，流速高。流速高。样品体积最好小于内水体积的三分之一。样品体积最好小于内水体积的三分之一。50二、凝胶层析在生化制药中的应用二、凝胶层析在生化制药中的应用（一）去热
25、原（一）去热原吸附的专一性不强。吸附的专一性不强。对对SephadexG-25来来说说，氨氨基基酸酸Kd值值等等于于1，热热原原性性物物质质Kd值都等于值都等于0。51（二）分离纯化（二）分离纯化SephadexG-50纯纯化化胰胰岛岛素素，除除去去胰胰岛岛素素中中前前胰胰岛岛素素和和其其它它大大分分子子抗抗原原物物质质。DEAE-SephadexA-50精制透明质酸酶。精制透明质酸酶。52一、一、基本原理基本原理离子交换法：利用溶液中带电粒子与离离子交换法：利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间子交换剂之间结合力结合力的差异进行物质分的差异进行物质分离的操作方法。离的操作方法。带电粒子与离子交换
26、剂间的作用力是带电粒子与离子交换剂间的作用力是静静电力电力。电荷密度、电荷种类电荷密度、电荷种类第五节离子交换法第五节离子交换法(ion-exchange53离子交换剂离子交换剂离离子子交交换换剂剂：由由惰惰性性的的不不溶溶性性载载体体、功功能能基基团团和平衡离子组成。和平衡离子组成。阳离子交换剂：平衡离子带正电荷。阳离子交换剂：平衡离子带正电荷。阴离子交换剂：平衡离子带负电荷。阴离子交换剂：平衡离子带负电荷。R-X+Y+R-Y+X+R-表示阳离子交换剂的功能基团和载体；表示阳离子交换剂的功能基团和载体；X+为为平衡离子；平衡离子；Y+为交换离子。为交换离子。54吸附吸附选择性吸附：调节溶液的
27、选择性吸附：调节溶液的pH值，值，使目的使目的物带有相当数量的静电荷，而主要杂质物带有相当数量的静电荷，而主要杂质离子带相反电荷或较弱的电荷。离子带相反电荷或较弱的电荷。选择合适的树脂（如阳离子交换树脂），选择合适的树脂（如阳离子交换树脂），便可使目的物被离子交换树脂吸附，而便可使目的物被离子交换树脂吸附，而杂质较少被吸附。杂质较少被吸附。55洗脱洗脱（1）调节洗脱液的调节洗脱液的pH值。值。（2）用高浓度的同性离子将目的物离子取用高浓度的同性离子将目的物离子取代下来。代下来。对阳离子交换树脂而言，目的物的对阳离子交换树脂而言，目的物的pI值愈大值愈大（愈碱），将其洗脱下来所需溶液的（愈碱），
28、将其洗脱下来所需溶液的pH值也值也愈高。愈高。56树脂的选择树脂的选择pH大大于于等等电电点点时时，物物质质带带负负电电荷荷，与阴离子交换剂进行交换；与阴离子交换剂进行交换；pH小小于于等等电电点点时时，物物质质带带正正电电荷荷，可以与阳离子交换剂进行交换。可以与阳离子交换剂进行交换。57二、二、离子交换树脂的结构和种类离子交换树脂的结构和种类离子交换树脂构成：离子交换树脂构成：（1）惰性的不溶性高分子固定骨架，称）惰性的不溶性高分子固定骨架，称载体载体。（2）与载体）与载体共价键共价键连接的不能移动的活性基团，连接的不能移动的活性基团，又称又称功能基团功能基团。（3）与功能基团以）与功能基团
29、以离子键离子键连接的可移动的活性离连接的可移动的活性离子，亦称子，亦称平衡离子平衡离子。如聚苯乙烯磺酸型钠树脂。如聚苯乙烯磺酸型钠树脂。58阳离子交换树脂分类阳离子交换树脂分类强酸型树脂：磺酸型树脂，功强酸型树脂：磺酸型树脂，功能基团为磺酸根能基团为磺酸根(SO3H)及甲及甲基磺酸根基磺酸根(CH2SO3H)，有好有好的解离能力。的解离能力。中酸性树脂：磷酸型树脂（中酸性树脂：磷酸型树脂（PO3H2）弱弱酸酸性性树树脂脂：羧羧酸酸型型树树脂脂和和酚酚型型树树脂脂（COOH,），在在酸性环境中解离度受到抑制酸性环境中解离度受到抑制。59阴离子交换树脂阴离子交换树脂强碱型阴离子交换树脂：强碱型阴离
30、子交换树脂：弱弱碱碱型型阴阴离离子子交交换换树树脂脂：活活性性基基团团为为伯伯、仲仲、叔叔胺胺基。基。在碱性环境中解离度受到抑制在碱性环境中解离度受到抑制。中强碱性阴离子交换树脂：兼有以上两类活性基团。中强碱性阴离子交换树脂：兼有以上两类活性基团。60离子交换树脂的性能离子交换树脂的性能61离子交换树脂的命名：离子交换树脂的命名：强酸类强酸类1100号；号；弱酸类弱酸类101200；强碱类强碱类201300；弱碱类弱碱类301400；中强酸类中强酸类401500交交联联度度：是是合合成成载载体体骨骨架架时时交交联联剂剂重重量量的的百百分分数数，用用“”将树脂编号与交联度分开。将树脂编号与交联度
31、分开。弱酸弱酸1014其交联度为其交联度为4。国内常用树脂命名：国内常用树脂命名：724；732；71762离子交换树脂的骨架离子交换树脂的骨架（一）苯乙烯型离子交换树脂（一）苯乙烯型离子交换树脂由由苯苯乙乙烯烯与与二二乙乙烯烯苯苯经经过过氧氧苯苯甲甲酰酰催催化化聚聚合而成。合而成。63（二）丙烯酸型离子交换树脂丙烯酸型离子交换树脂丙烯酸型阳离子交换树脂：是由丙烯酸型阳离子交换树脂：是由丙烯酸甲酯丙烯酸甲酯与与二乙烯苯二乙烯苯经过氧苯甲酰催化聚合而成。经过氧苯甲酰催化聚合而成。64丙烯酸型阳离子交换树脂丙烯酸型阳离子交换树脂110树脂：丙烯酸甲酯与二乙烯苯聚合而成。树脂：丙烯酸甲酯与二乙烯苯聚
32、合而成。724树脂：树脂：它是由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲它是由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯和二乙烯苯三元共聚而得酯和二乙烯苯三元共聚而得。65（三）其它离子交换树脂（三）其它离子交换树脂 蛇笼树脂蛇笼树脂：脱盐脱盐螯形树脂螯形树脂：金属离子：金属离子 吸附树脂吸附树脂：“脱色树脂脱色树脂”热再生离子交换树脂：热再生离子交换树脂： 66三、三、离子交换速度离子交换速度RB+A+RA+B+离子交换过程离子交换过程：1、A+从溶液扩散到树脂表面。从溶液扩散到树脂表面。2、A+从从树树脂脂颗颗粒粒表表面面扩扩散散到到颗颗粒粒中中心。心。3、平衡离子、平衡离子A+与离子与离子B+交换。交换。4、B+从交换
33、中心扩散到离子表面。从交换中心扩散到离子表面。5、B+再扩散到溶液中。再扩散到溶液中。67离子交换速度的影响因素：离子交换速度的影响因素：1、树脂粒度树脂粒度：树脂粒度大，交换速度慢。：树脂粒度大，交换速度慢。2、搅拌速度、搅拌速度3、树脂交联度树脂交联度：交联度大，交换速度低。：交联度大，交换速度低。4、离离子子半半径径和和离离子子价价：离离子子每每增增加加一一个个电电荷荷，交交换换速度下降一个数量级。速度下降一个数量级。5、温度。、温度。6、离子浓度离子浓度：交换速度随离子浓度的上升而加快。：交换速度随离子浓度的上升而加快。68四、四、离子交换树脂的性能离子交换树脂的性能一）、离子交换对树
34、脂的基本要求一）、离子交换对树脂的基本要求二）、影响树脂性能的几个因素二）、影响树脂性能的几个因素69一）、离子交换对树脂的基本要求：一）、离子交换对树脂的基本要求：1、有尽可能大的、有尽可能大的交换容量交换容量。2、有良好的、有良好的交换选择性交换选择性。3、化学性质稳定。、化学性质稳定。4、化学动力学性能好。、化学动力学性能好。5、物理性能好。物理性能好。70二）、影响树脂性能的几个因素二）、影响树脂性能的几个因素1、离离子子交交换换树树脂脂具具有有的的功功能能基基团团性性质质和和数数目，数目目，数目是其交换容量的基础。是其交换容量的基础。2、树树脂脂的的交交联联度度树树脂脂强强度度、交交
35、换换选选择择性、动力学性质。性、动力学性质。3 3、树脂树脂骨架骨架和和平衡离子平衡离子。71六、离子交换操作方法六、离子交换操作方法一）、一）、树脂的选择树脂的选择目目的的物物是是弱弱酸酸性性或或弱弱碱碱性性的的小小分分子子物物质质时时，宜选用强酸强碱树脂宜选用强酸强碱树脂（氨基酸的分离）（氨基酸的分离）。蛋白质、酶蛋白质、酶和和其它生物大分子其它生物大分子的分离多采的分离多采用用弱碱或弱酸性树脂弱碱或弱酸性树脂，减少生物大分子的，减少生物大分子的变性，利于洗脱，提高选择性。变性，利于洗脱，提高选择性。72二）、树脂的处理和再生二）、树脂的处理和再生1 1、 外观特征外观特征透透明明或或半半
36、透透明明；颗颗粒粒圆圆整整，粒粒度度均均匀匀，强度。强度。2 2、 树脂的预处理树脂的预处理（1 1）物理处理：去杂，过筛。物理处理：去杂，过筛。（2 2） 化学处理化学处理：用：用8 81010倍的倍的1mol/L 1mol/L 盐酸或氢氧化钠溶液交替浸泡盐酸或氢氧化钠溶液交替浸泡。73氨基酸分离前树脂的处理氨基酸分离前树脂的处理74树脂的再生树脂的再生树树脂脂再再生生：使使用用过过的的树树脂脂重重新新获获得得使使用用性性能能的的处处理理过程。过程。再生过程：再生过程：（1）去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质。去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质。（2）用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质
37、。用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质。 (3) (3) 转型：转型：75三）、基本操作方法三）、基本操作方法交换：交换：静态交换静态交换动态交换动态交换洗脱洗脱：洗洗脱脱方方式式：分分静静态态洗洗脱脱及及动动态态洗洗脱脱两两种种，pH及离子强度改变。及离子强度改变。洗脱液：洗脱液：酸、碱、盐酸、碱、盐。76酸、碱洗脱液：酸、碱洗脱液：旨在改变吸附物的电荷或改旨在改变吸附物的电荷或改变树脂吸附基团的解离状态，以消除静电结变树脂吸附基团的解离状态，以消除静电结合力，迫使目的物被释放出来；合力，迫使目的物被释放出来；盐类洗脱液：盐类洗脱液：是通过高浓度的同种电荷的离是通过高浓度的同种电荷的离子与目
38、的物竞争树脂上的活性基团，使吸附子与目的物竞争树脂上的活性基团，使吸附物解离。物解离。77洗脱方式洗脱方式动态洗脱：动态洗脱：1、溶液溶液pH及离子强度不变。及离子强度不变。2、分阶段改变溶液、分阶段改变溶液pH及离子强度。及离子强度。3、连续改变溶液、连续改变溶液pH及离子强度。及离子强度。梯度洗脱：自动化的梯度仪梯度洗脱：自动化的梯度仪梯度混合器梯度混合器:A瓶为低浓度盐溶液瓶为低浓度盐溶液B瓶为高浓度盐溶液瓶为高浓度盐溶液78七、应用实例七、应用实例分离纯化分离纯化氨基酸制备氨基酸制备无盐水制备无盐水制备79氨基酸制备、分离氨基酸制备、分离猪血粉水解制备猪血粉水解制备6种种氨氨基酸基酸:
39、80阳阳离离子子交交换换树树脂脂用用强强酸酸性性树树脂脂，阴阴离离子子交交换换树树脂脂可以用可以用强碱或弱碱强碱或弱碱树脂。树脂。强酸强酸弱碱弱碱或或强酸强酸强碱；强碱；当当对对水水质质要要求求高高时时，经经过过一一次次组组合合脱脱盐盐，还还达达不不到要求，可采用两次组合到要求，可采用两次组合:强酸强酸弱碱弱碱强酸强酸强碱强碱；强酸强酸强碱强碱混合床混合床。无盐水制备无盐水制备无无盐盐水水制制备备是是利利用用氢氢型型阳阳离离子子交交换换树树脂脂和和羟羟型型阴离子交换树脂的组合以阴离子交换树脂的组合以除去水中所有的离子。除去水中所有的离子。81混合床无盐水混合床无盐水图8.20 混合床的操作(a
40、)为水制备时的情形；(b)为制备结束，用水逆流冲洗。阳、阴树脂根据比重不同分层，一般阳树脂较阳、阴树脂根据比重不同分层，一般阳树脂较重在下面，阴树脂在上面；重在下面，阴树脂在上面；(c)为上部、下部同时通入碱、酸再生，废液自中间排出；(d)为再生结束，通入空气，将阳、阴树脂混合、准备制水 混合床混合床混混合合床床系系将将阳阳、阴阴两两种种树树脂脂混混合合而而成成，脱脱盐盐效果好。效果好。82第六节第六节亲和纯化技术亲和纯化技术利用生物分子间的利用生物分子间的特特异性结合作用异性结合作用的原理的原理进行生物物质分离纯进行生物物质分离纯化的技术称为化的技术称为亲和纯亲和纯化技术化技术（Affini
41、ty Affinity purificationpurification）83技术要点技术要点（1）找与底物）找与底物专一专一可逆结合可逆结合的配基；的配基；（2）将配基通过）将配基通过共共价键价键偶联到基质；偶联到基质；（3）配基）配基与与底物底物吸吸附附；（4）洗脱目标物。）洗脱目标物。 84亲和纯化技术亲和纯化技术亲和层析亲和层析(Affinity chromatography) (Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离）亲和过滤（膜分离）亲和分配（双水相萃取）亲和分配（双水相萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和沉淀（沉淀）亲和沉
42、淀（沉淀）亲和电泳（电泳）亲和电泳（电泳）85一、一、亲和层析亲和层析利利用用生生物物大大分分子子物物质质具具有有与与某某些些相相应应的的分分子子专专一一性性可逆结合可逆结合的特性而建立的层析技术。的特性而建立的层析技术。适适用用于于从从成成份份复复杂杂且且杂杂质质含含量量远远大大于于目目标标物物的的混混合合物中提纯目标物。物中提纯目标物。经过一次处理可得到经过一次处理可得到高纯度活性高纯度活性物质物质；设设备备要要求求不不高高、操操作作简简便便、特特异异性性强强、分分离离速速度度快快、分分离效果好、分离条件温和离效果好、分离条件温和；亲和吸附剂通用性较差，亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂专
43、用的吸附剂。特点特点86亲和吸附剂：载体亲和吸附剂：载体配基配基在亲和层析中起在亲和层析中起可逆结合的特异可逆结合的特异性物质称为性物质称为配基配基（Ligand）。）。与配基结合的层与配基结合的层析介质称为析介质称为载体载体（Matrix）。）。87一）、亲和层析的原理一）、亲和层析的原理（1）配配基基固固定定化化：配配基基与与载载体体偶偶联联，结结合合成成具具有有特特异亲和性的分离介质。异亲和性的分离介质。（2）吸吸附附样样品品：亲亲和和层层析析介介质质选选择择性性吸吸附附生生物物活活性性物质物质.（3）样样品品解解吸吸：选选择择适适宜宜的的条条件件使使被被吸吸附附物物活活性性物物质解吸。
44、质解吸。88二）、亲和层析载体二）、亲和层析载体（一）、亲和层析对载体的要求：（一）、亲和层析对载体的要求：（1）充分）充分功能化功能化，与配基进行共价连接。，与配基进行共价连接。（2）有较好的）有较好的理化稳定性和生物惰性理化稳定性和生物惰性。（3）具有高度的）具有高度的水不溶性和亲水性水不溶性和亲水性。（4）具有）具有多孔的立体网状结构多孔的立体网状结构。（5）应为）应为大小均匀大小均匀的刚性小球。的刚性小球。89（二）、常用载体（二）、常用载体纤维素纤维素(cellulose)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶多孔玻璃珠（多孔玻璃珠（Bio-Glass）
45、其它载体其它载体壳聚糖壳聚糖(Chitosan)901 1、纤维素、纤维素纤维素纤维素结构紧密结构紧密、均一性差，不利于大、均一性差，不利于大分子的渗入。分子的渗入。非特异性吸附力较强。非特异性吸附力较强。主要用于主要用于分离与核酸有关的物质分离与核酸有关的物质。912 2、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖浓度有琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为，商品为Sepharose2B、4B和和6B（Pharmacia）。）。保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松功能基团，结构疏松孔径大，流速快孔径大，流速快。SepharoseCL, ,稳定性明显增加
46、，能在稳定性明显增加，能在pH314中应用。中应用。923 3、葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶孔径太小葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。应用受到限制。4 4、聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：Bio-gelP有有供供化化学学反反应应的的酰酰胺胺基基，能能制制得得配配基基含含量量较较高的亲和柱高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。，适用于亲和势比较低的系统。pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。过高或过低的溶液中酰胺基易水解。935 5、多孔玻璃珠：多孔玻璃珠：化学与物理稳定性化学与物理稳定性较好，机械强度高。较好，机械强度高。缺缺点点：亲亲水水性性不
47、不强强，对对蛋蛋白白质质尤尤其其是是碱碱性性蛋蛋白白质质有有非特异性吸附非特异性吸附，化学活性基团少。，化学活性基团少。6 6、其它载体、其它载体壳聚糖壳聚糖94吸附法吸附法(adsorption method)(adsorption method)指利用吸附指利用吸附作用，将样品中的作用，将样品中的生物活性物质生物活性物质或或杂质杂质吸吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间物质和杂质间吸附能力吸附能力的差异，使目的物的差异，使目的物和其它物质分离，达到浓缩和提纯目的的和其它物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。方法。 第七节第七节吸附分离法吸附分
48、离法9596优点：优点：(1)(1)设备简单、操作简便、价廉、安全。设备简单、操作简便、价廉、安全。(2)(2)少少用用或或不不用用有有机机溶溶剂剂，吸吸附附过过程程中中pHpH变变化化小小，较少引起较少引起生物活性生物活性物质的变性失活。物质的变性失活。缺点：缺点：(1) (1) 选择性差，收率不高。选择性差，收率不高。(2)(2)一些无机吸附剂性能不稳定。一些无机吸附剂性能不稳定。 97一、一、吸附法基本概念吸附法基本概念一）、吸附：一）、吸附： 物质从流体相（气体或液体）浓缩到固体物质从流体相（气体或液体）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为表面从而达到分离的过程称为吸附作用吸附作用(a
49、dsorption)(adsorption)，在表面上能发生吸附作用，在表面上能发生吸附作用的固体微粒称为的固体微粒称为吸附剂吸附剂（adsorbentadsorbent），而），而被吸附的物质称为被吸附的物质称为吸附物吸附物（adsorbateadsorbate）。）。98二）、吸附类型二）、吸附类型99三）、影响吸附的因素三）、影响吸附的因素（一）吸附剂（一）吸附剂吸附容量：吸附容量：比表面积比表面积、种类、种类、活化状况活化状况吸附速度：吸附速度：颗粒度颗粒度、孔径、孔径机械强度机械强度（二）吸附物（二）吸附物能使表面张力降低的物质，易为吸附能使表面张力降低的物质，易为吸附溶解度：较小易
50、吸附溶解度：较小易吸附100吸附剂及被吸附物极性对吸附的影响吸附剂及被吸附物极性对吸附的影响极极性性吸吸附附剂剂易易吸吸附附极极性性物物质质，非非极极性性吸吸附附剂剂易吸附非极性物质；易吸附非极性物质；极极性性吸吸附附剂剂适适宜宜从从非非极极性性溶溶剂剂中中吸吸附附极极性性物物质；质；非非极极性性吸吸附附剂剂适适宜宜从从极极性性溶溶剂剂中中吸吸附附非非极极性性物质。物质。（三）环境的影响（三）环境的影响1、溶剂：单溶剂易吸附，混合溶剂易解吸、溶剂：单溶剂易吸附，混合溶剂易解吸2、pH值：值：PI，对吸附质在水中存在的状态及溶解度等产生影响，从而影响吸附效果。3、温度：影响较小、温度：影响较小4
51、、盐的浓度：可能阻止、可能促进、盐的浓度：可能阻止、可能促进101无机：无机：白陶土、氧化铝、硅胶白陶土、氧化铝、硅胶、硅藻土、硅藻土有机：有机：活性炭活性炭、纤维素、纤维素、大孔吸附树脂大孔吸附树脂等等一）、活性炭一）、活性炭(activatedcarbon)粉末状，颗粒状，锦纶活性炭粉末状，颗粒状，锦纶活性炭是吸附能力很强的非极性吸附剂是吸附能力很强的非极性吸附剂溶剂中吸附力：溶剂中吸附力：水水乙醇乙醇甲醇甲醇酯酯丙酮丙酮氯仿氯仿去去色素色素、热原，用量、热原，用量0.021%加热加热活化活化pH影响影响二、二、几种常用的吸附剂几种常用的吸附剂102辅酶辅酶A制备制备103活性炭提取放线酮
52、活性炭提取放线酮104二）、人造沸石二）、人造沸石(zeolite )(zeolite )无机阳离子交换剂无机阳离子交换剂Na2Al2O4xSiO2yH2ONa2Al2O4=2Na+Al2O42-105 106三）、磷酸钙凝胶三）、磷酸钙凝胶磷酸钙磷酸钙磷酸氢钙磷酸氢钙羟基磷灰石羟基磷灰石主要是其中的钙与蛋白质的负电基团结合主要是其中的钙与蛋白质的负电基团结合107胰岛素纯化胰岛素纯化108四）、白陶土四）、白陶土(Kaolin)可作为可作为助滤剂助滤剂与与去除热原的吸附剂去除热原的吸附剂109五）、氢氧化铝凝胶五）、氢氧化铝凝胶将氨水或碱液将氨水或碱液加入铝盐形加入铝盐形成的成的无定形无定形
53、凝胶凝胶；吸附能力和陈吸附能力和陈化程度有关。化程度有关。110六）、氧化铝六）、氧化铝(Aluminumoxide)适用于亲脂成分的分离适用于亲脂成分的分离1、碱性氧化铝：、碱性氧化铝：2、中性氧化铝：、中性氧化铝：3、酸性氧化铝：、酸性氧化铝：111氧化铝吸附层析纯化维生素氧化铝吸附层析纯化维生素B12影响因素：影响因素：(1)Al2O3的颗粒度要均匀，流速控制要很慢；的颗粒度要均匀，流速控制要很慢；(2)温温度度宜宜在在20以以下下层层析析，洗洗脱脱在在室室温温中中进进行；行；(3)利利用用B12在在丙丙酮酮中中不不溶溶的的特特性性，在在冰冰冻冻条条件件下下结晶结晶3天，结晶析出。天，结
54、晶析出。112七）、硅胶七）、硅胶(Silicagel)SiO2nH2O硅胶表面的硅羟基能吸附多量的水，称自硅胶表面的硅羟基能吸附多量的水，称自由水，由水，活性随自由水含量增加而下降活性随自由水含量增加而下降。能吸附非极性化合物和极性化合物能吸附非极性化合物和极性化合物113CoQ10制备 114洗脱剂的选择洗脱剂的选择极性溶质：极性大的溶剂洗脱能力就大；极性溶质：极性大的溶剂洗脱能力就大；非极性溶质：极性小的溶剂洗脱能力就非极性溶质：极性小的溶剂洗脱能力就大。大。常用洗脱剂排序（极性增大）：常用洗脱剂排序（极性增大）：石油醚石油醚甲苯甲苯乙醚乙醚氯仿氯仿乙酸乙酯乙酸乙酯丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇水水乙酸乙酸115氧化铝或硅胶为吸附剂氧化铝或硅胶为吸附剂洗脱剂从极性低的开始洗脱剂从极性低的开始逐渐增加极性逐渐增加极性。次序：石油醚、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、次序：石油醚、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸。、乙酸。116活性炭为吸附剂活性炭为吸附剂洗脱剂从极性高的开始洗脱剂从极性高的开始逐渐降低极性逐渐降低极性。次序：水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯次序：水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿。仿。117
