蛋白质组学蛋白质组学主讲教师：张玲 回顾Functional analysisState 1State 22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabase searchDifferential analysis? 第四章第四章 电泳图谱的图像分析及电泳图谱的图像分析及细胞蛋白谱的建立细胞蛋白谱的建立 课程内容课程内容掌握：掌握：蛋白电泳图像分析系统熟悉：熟悉：使用PDQuest软件进行蛋白质点的自动检测，匹配和分析了解：了解：二维电泳蛋白谱数据库 电泳图谱的图像分析简介what can we get from image analysis?双向凝胶双向凝胶电泳技泳技术是目前蛋白是目前蛋白质组研究的主要技研究的主要技术之一之一, , 双向双向电泳根据等泳根据等电点和分子量可一次性分离点和分子量可一次性分离数千种蛋白数千种蛋白质，，经染色后蛋白染色后蛋白质再再PAGEPAGE上可形成密上可形成密度不同、分布不均的复度不同、分布不均的复杂点点图谱如何有效的如何有效的对双向凝胶双向凝胶电泳泳图像分析，如何像分析，如何对图谱上的蛋白上的蛋白质点点进行行检测、定量、比、定量、比较、分析和、分析和归类，，挖掘有价挖掘有价值的蛋白的蛋白质点的信息是双向点的信息是双向电泳分析泳分析软件件所要解决的所要解决的问题。
PDQuest 软件简介软件简介PDQuestPDQuest软件是显示（软件是显示（imagingimaging）、分析）、分析（（analyzinganalyzing）双向电泳图谱＆数据库查询的一个）双向电泳图谱＆数据库查询的一个软件包软件包硬件：硬件：一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色，SCI接口，windows操作系统软件：软件： PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-Rad Laboratory,Hercules,CA PDQuest 软件的使用软件的使用以以PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析软件为例将双向电泳分分析软件为例将双向电泳分析的基本实验过程做一简单介绍析的基本实验过程做一简单介绍 凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立 典型流程典型流程l凝胶图像的扫描：凝胶图像的扫描：l图像加工：图像加工：l斑点检测和定量：斑点检测和定量：l凝胶配比：凝胶配比：l数据分析：数据分析：l数据呈递（数据呈递（report））l2-DE数据库的建立数据库的建立： PDQuest 软件软件PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析软件系统和其他分析软件系统和其他2-D2-D分析软分析软件系统一样，包括：件系统一样，包括：一一 图象采集与加工：象采集与加工：二二 斑点斑点检测三三 斑点匹配斑点匹配四四 数据分析及数据分析及输出出 PDQuest 软件的使用 一、 图象采集与加工(editing images) 1、扫描：凝胶染色后用清华紫光扫描仪扫描，透射模式，凝胶染色后用清华紫光扫描仪扫描，透射模式，全彩全彩RGB,RGB,分辨率为分辨率为400dpi-800dpi400dpi-800dpi，尽量排除气泡，文件以，尽量排除气泡，文件以tifftiff格式格式保存。
保存2、图片加工：l在在PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析软件中打开以分析软件中打开以tifftiff格式保存的文件可以格式保存的文件可以单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“OpenOpen”命令，选择保存2-D图象文件的磁盘、路径和文件名，双击文件名或单击“Open”以打开2-D图象文件，此时tiff格式保存的文件会自动另外创建一个为PDQUEST 2-D分析软件自定义的文件格式2D 2D ScanScanl单击工具栏上的单击工具栏上的control thecontrol the image displayimage display 图标，会出现图标，会出现一个对话框，通过改变此对话框的一个对话框，通过改变此对话框的High High 和和LowLow的值以改变明亮的值以改变明亮度 l用工具栏的用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白质点的部分，以减可以切割掉凝胶边缘没有蛋白质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对你要分析的多块凝胶图像最好是切割少分析的复杂性，但要注意对你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小成同样大小在操作（在操作时先先选择其中的一个凝胶其中的一个凝胶图象并象并选定要切割的区域，然后定要切割的区域，然后在在image>advance crop>save crop settingsimage>advance crop>save crop settings下保存下保存cropcrop的的设定条定条件并件并输入保存的名称，其他的入保存的名称，其他的图象切割象切割时在在image>advance image>advance crop>load crop settingscrop>load crop settings中中选定先前保存的名称即可定先前保存的名称即可 ）） 二 、斑点检测(spots detection) 图象采集与加工后就要进行斑点检测，图象采集与加工后就要进行斑点检测，PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析软件通过一个称之为分析软件通过一个称之为““蛋白质斑点检测向导蛋白质斑点检测向导（（spot identification wizardspot identification wizard））””的程序来实现的。
的程序来实现的 l单击“spot”菜单，选择“spot identification wizard”程序l该程序首先需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、最大斑点、最小斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行程序允许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和其他一些选项等l这些参数设好后单击Find spot centers,其结果在凝胶图象会显示检测到的斑点会用“ 字（Spot Crosshairs）”表示，检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符l在Parameter Set 项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质斑点，单击Process all gels，会出现一个Auto-detect spots窗口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝胶图像需事先打开）l蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式分别为gel image 和和gel spot l由于在进行斑点检测时会错误的识别一些蛋白质斑点，比如将一些污染的非蛋白质点识别为蛋白质点、将本来是一个蛋白质点识别为两个蛋白质点或者反之。
所以在匹配之前最好进行处理，同时将gel scan 、gel image 和gel spot图打开，然后单击edit spot tool，出现一个对话框，此对话框中有增加斑点（make a spot at cursor）, 删除斑点（remove spot at cursor）,合并斑点（combine spot in box）等图标，可根据你的目的而选择其中一个图标进行相应的斑点处理这些处理只能在gel image图象中处理，但相应的在gel spot图象中会同时得到显示 三 、斑点匹配(Matching spots) u蛋白质斑点检测完了之后，为了比较和分析不同凝胶中蛋白质斑点的改变，PDQUEST 可以建立一个建立一个Matchset单击match>creat matchset, 出现一个Matchset的对话框，输入文件名称，保存路径，选择（select）或上载（load）gel spot 图像的文件名，然后单击creat, 出现一对话框，选择其中的一个图象做为参考图象（standard member）, 整个Matchset用单个窗口（signal window）来表示，其中的亚窗口（subwindow）分别用来表示参考图像（用REF来表示）和成员胶（member gel）图像。
ØMatchset 建成后，接着便是建成后，接着便是设立标志点（landmark）,它的作用是对整它的作用是对整个凝胶上蛋白质斑点进行排列（个凝胶上蛋白质斑点进行排列（align）与定位（）与定位（position）以便进行匹配）以便进行匹配（（match）单击工具工具栏中的中的match toolsmatch tools图标会出会出现一个窗口，其中有一个窗口，其中有 landmark, landmark, unlandmarkunlandmark, match gel, match all gels, match gel, match all gels等斑点匹配的工具等斑点匹配的工具, , 在在matchmatch菜菜单中中也有也有这些工具标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点，并尽量避开蛋标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点，并尽量避开蛋白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下确定该蛋白质斑点为所有成员白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下确定该蛋白质斑点为所有成员胶上同一个蛋白质斑点至少要设立两个标志点后便可利用胶上同一个蛋白质斑点。
至少要设立两个标志点后便可利用PDQUESTPDQUEST的自动匹的自动匹配功能来完成不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了配功能来完成不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了一般设立的landmark斑点个数为总斑点的10%左右，要用肉眼检查每一个应该能匹配上的斑点是否匹配上了 u对错误匹配的蛋白质斑点或没有识别到的匹配可进行手工方式编辑在这里也可以进行编辑斑点功能，单击view>interchange all images, 这样所有的成员胶和参考胶有Gel spot 状态下变成了Gel image, 而在Gel image 状态下可进行Edit Spot Tools 以编辑蛋白以编辑蛋白质斑点质斑点 ü标志点以绿色三角标记，每块胶上匹配上的蛋白质标志点以绿色三角标记，每块胶上匹配上的蛋白质斑点以斑点以绿色字母绿色字母标记，没有匹配上的蛋白质斑点用标记，没有匹配上的蛋白质斑点用红红色圈色圈来标记，即是有无差异表达的蛋白质点来标记，即是有无差异表达的蛋白质点 四 、数据分析及输出（analysis and report） 为了分析蛋白质斑点之间差异表达，PDQUEST提供了多个分析程序，包括蛋白质斑点量量(Quantity)分析分析，散点图工具（Satter Plot Tool） ,量的柱状图分析（Graph）等在内的多种分析程序。
量的分析量的分析打开Matchset，单击Database>Analysis>Create Analysis Set, 然后再单击参考图，就会出现一个对话框, 输入名字（Name）, Type有多种选项,要做量的比较就选Quantitative Ø比较（比较（Compare）形式有两种，一种是）形式有两种，一种是Gel, 可以单个的胶两两互相比可以单个的胶两两互相比较较(只能是成员胶和参考胶进行比较只能是成员胶和参考胶进行比较)，另一种是，另一种是Group，可以将同一样，可以将同一样品的多块胶做为一组（这在品的多块胶做为一组（这在Database >Replicate Group>Create Group下可以创建组），然后再组之间两两比较然后再选择下可以创建组），然后再组之间两两比较然后再选择A 和和B，，分别表示两块胶或者是两组胶分别表示两块胶或者是两组胶Replicate Group Ø在在Select Spots Which are 中可以选择中可以选择Increased, Increased or Decreased 或者是或者是Decreased 等，激活选项后可以输入倍数关等，激活选项后可以输入倍数关系系, 默认的是默认的是2 times, 可以输入其他数值，可以输入其他数值， 如如3 times。
参数设好参数设好后就单击后就单击go, 在参考胶上就会出现黄色圈标记的蛋白质斑点，如果在参考胶上就会出现黄色圈标记的蛋白质斑点，如果你选择是你选择是Increased B>A 2 times, 那么这些那么这些黄色圈标记的蛋白质蛋白质斑点即为在量上斑点即为在量上B大于大于A 两倍的蛋白质点两倍的蛋白质点. Ø为了矫正银染对蛋白质点定量分析的影响，所有点的含量通过单个点为了矫正银染对蛋白质点定量分析的影响，所有点的含量通过单个点的光密度值比上胶上所有点光密度质而正常化的光密度值比上胶上所有点光密度质而正常化（Normalize）, 单击单击Edit>Normalize, 出现一对话框，选择左上角出现一对话框，选择左上角Enable Normalize，下面，下面的窗口被激活，在的窗口被激活，在Basis下选择下选择Total of all Valid Spots, 在在Scaling下选下选择择PPM(×1000000), 然后单击然后单击 go这样所有的点都正常化这样所有的点都正常化（（Normalize）了归一化归一化 Normalization 散点图工具散点图工具 Scatter plot Ø单击单击Reports 下的下的Scatter plot，会出现散点图分析的对话框，可以选，会出现散点图分析的对话框，可以选择择x, y轴，分别代表一块胶，轴，分别代表一块胶，Markers 下可以选择倍数，下面的散点图下可以选择倍数，下面的散点图即显示了两个即显示了两个2-D胶图像中蛋白质点之间的相关性，上面会显示二者的相胶图像中蛋白质点之间的相关性，上面会显示二者的相关系数，如果相关系数大于关系数，如果相关系数大于，说明二者有较大的相关性，如果小于，说明二者有较大的相关性，如果小于大于大于0.2, 说明相关性较小，小于说明相关性较小，小于0.2, 说明没有相关性。
在说明没有相关性在Reports >Scatter plots 下可以将所有的凝胶图之间的相关图都打印出来下可以将所有的凝胶图之间的相关图都打印出来 量化柱状图量化柱状图 Graphs Ø单击单击Reports>More Graphs>Page Graphs, 在有边会出现一对化在有边会出现一对化框，显示所有蛋白质点在不同胶上的框，显示所有蛋白质点在不同胶上的量化柱状图，如果要显示所要，如果要显示所要分析的蛋白质点的量化柱状图，则在对话框的分析的蛋白质点的量化柱状图，则在对话框的Input下选择下选择Analysis set, 出现一对话框，然后选择分析的名称即可在出现一对话框，然后选择分析的名称即可在Reports>Quantity Graphs下可输出所有的蛋白质点（下可输出所有的蛋白质点（All Match Spots）或者是特定分析的蛋白质点（）或者是特定分析的蛋白质点（Specificd Analysis Set）在）在不同胶上的量化柱状图不同胶上的量化柱状图 Proteomics Ananlysis in the Control and ExperimentalProteomics Ananlysis in the Control and Experimental 应用材料： 无腔眼金鱼胚胎正常眼金鱼胚胎 差异点：差异点： 量化柱状图：量化柱状图： 2D Gel DatabaseslBiobase Biobase 角质形成细胞角质形成细胞, ,膀胱癌等膀胱癌等 ( (丹麦丹麦Center for Genome Research) Center for Genome Research) lECO2DBASE ECO2DBASE 大肠杆菌大肠杆菌 ( (在在NCBINCBI库中库中) ) lHeart-2DPAGE Heart-2DPAGE 人心肌人心肌 ( (德国柏林德国柏林) ) lHSC-2DPAGE HSC-2DPAGE 人类心脏人类心脏 ( (英国英国Harefield, Heart Science Center) Harefield, Heart Science Center) http://http://lLSB LSB 人类人类, ,小鼠和大鼠肝脏等小鼠和大鼠肝脏等 ( (美国美国Large Scale Biology) Large Scale Biology) lQUESTRef52 QUESTRef52 细胞细胞, ,大鼠胚胎大鼠胚胎, ,酵母酵母 ( (美国美国Cold Spring Harbor Lab) Cold Spring Harbor Lab) http:///http:///lSWISS-2DPAGE SWISS-2DPAGE 十个人类图谱十个人类图谱, ,包括包括: : 肝肝, , 浆细胞浆细胞, , 红细胞红细胞, , 血小板血小板, , 以及酵以及酵母母, , 大肠杆菌大肠杆菌 ( (瑞士日内瓦瑞士日内瓦, University Hospital)2-DE, University Hospital)2-DE数据库数据库hthtlYeast Yeast S. cerevisiae, S. pombeS. cerevisiae, S. pombe等等 ( (瑞典瑞典Goteborg University) Goteborg University) lYeast Yeast S. cerevisiae (S. cerevisiae (美国美国Proteome Inc.) Proteome Inc.) http://http:// u其他物种以及细胞株的其他物种以及细胞株的2-DE2-DE数据库及链接可查询参考：数据库及链接可查询参考：《蛋白质组学：理论与方法》P98-99《蛋白质化学与蛋白质组学》P305-308 谢谢 谢谢 。