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1、免疫分析法免疫分析法Immunoassay 一一概论概论免疫性是动物在长期进化过程中逐渐发展免疫性是动物在长期进化过程中逐渐发展起来的防御感染和维护机体完整性的起来的防御感染和维护机体完整性的十分有效十分有效而灵巧的手段而灵巧的手段。免疫系统的特殊功能是识别免疫系统的特殊功能是识别“自我自我”和和“非自我非自我”的物质，对自身的物质不起反应，而的物质，对自身的物质不起反应，而对外源的及体内改变了的物质则能起专一的免对外源的及体内改变了的物质则能起专一的免疫反应，排除其对机体的危害。另一方面，免疫反应，排除其对机体的危害。另一方面，免疫系统还担负着维持机体免疫状态的自身稳定疫系统还担负着维持机体
2、免疫状态的自身稳定性，以清除体内衰老和突变的细胞。性，以清除体内衰老和突变的细胞。抗体和抗原（抗体和抗原（Antigen,Antibody）免疫学的重要对象是抗原和抗体的反应问题。免疫学的重要对象是抗原和抗体的反应问题。抗抗原原是是一一种种外外来来物物质质，当当其其进进入入动动物物体体内内能能引起引起抗体抗体的产生，并能和抗体反应的物质。的产生，并能和抗体反应的物质。抗抗体体(antibody .Ab)与与抗抗原原(antigen.Ag)的结合具有极高的专一性和亲合性。的结合具有极高的专一性和亲合性。不不能能诱诱导导产产生生抗抗体体，但但能能和和适适当当抗抗体体起起反反应应，即有免疫反应性的简
3、单分子称为即有免疫反应性的简单分子称为半抗原半抗原。（1）抗原）抗原蛋白质，多糖，核酸，合成多肽，低分子物质蛋白质，多糖，核酸，合成多肽，低分子物质（2）抗体）抗体抗体是一种蛋白质（主要是抗体是一种蛋白质（主要是-球蛋白质）球蛋白质）血清蛋白质在自由电泳场中血清蛋白质在自由电泳场中白蛋白白蛋白-球蛋白球蛋白-球蛋白球蛋白-球蛋白球蛋白抗体存在于抗体存在于-球蛋白和球蛋白和-球蛋白内球蛋白内这些蛋白质称为免疫球蛋白这些蛋白质称为免疫球蛋白IgM.IgA.IgG.IgD和和IgEM.A.G.D.E二.放射性免疫分析（放射性免疫分析（RIA）Berson和和Yallow将免疫反应与分析化学相结合创立
4、了放射性免疫分析法。将免疫反应与分析化学相结合创立了放射性免疫分析法。荷尔蒙的测定荷尔蒙的测定先将荷尔蒙注入天竺鼠体内先将荷尔蒙注入天竺鼠体内对抗此抗原的抗体（对抗此抗原的抗体（Ab）Ag*+Ab=Ag*-Ab要测定一病人的血清标本中荷尔蒙的浓度，要测定一病人的血清标本中荷尔蒙的浓度，Ag+Ag*-Ab=Ag-Ab+Ag*(+Ag*-Ab)测定测定Ag*，可计算标本中所含有的荷尔蒙（可计算标本中所含有的荷尔蒙（Ag）浓度浓度分析对象：分析对象：测量含量很低的生物活性化合物：测量含量很低的生物活性化合物：如蛋白质（酶，接受体，抗体）如蛋白质（酶，接受体，抗体）激素（甾族化合物，甲状腺激素，酞激素
5、）激素（甾族化合物，甲状腺激素，酞激素）药物及微生物等。药物及微生物等。优点：专一性强，灵敏度高优点：专一性强，灵敏度高缺点：缺点：放放射射性性同同位位素素可可能能损损害害人人们们的的身身体体健健康康，以以致致于实验室要有特殊防护技术于实验室要有特殊防护技术该法还需要用贵重的闪烁计数器和试剂该法还需要用贵重的闪烁计数器和试剂稳定性稳定性-同位素的寿命相对较短同位素的寿命相对较短三三 酶联免疫分析法酶联免疫分析法用酶用酶标记抗原或抗体标记抗原或抗体 例：酶联免疫法测定氯霉素例：酶联免疫法测定氯霉素 微量反应板微量反应板羊抗兔羊抗兔IgGIgG抗体抗体 兔抗氯霉素抗体兔抗氯霉素抗体+ +氯霉素酶结
6、合物氯霉素酶结合物 + +氯霉素样品氯霉素样品 没有结合的酶结合物被洗去，再向相应孔中加入没有结合的酶结合物被洗去，再向相应孔中加入过氧化氢和邻苯二胺，作用一定时间后，结合后的酶过氧化氢和邻苯二胺，作用一定时间后，结合后的酶结合物将无色的邻苯二胺转化为蓝色的产物，加入终结合物将无色的邻苯二胺转化为蓝色的产物，加入终止液后颜色由蓝变黄，用波长止液后颜色由蓝变黄，用波长450nm450nm（双波长时最适参双波长时最适参考波长考波长600nm600nm）酶标仪进行检测，吸光值与样品中氯酶标仪进行检测，吸光值与样品中氯霉素含量成反比。霉素含量成反比。 酶不稳定、光度分析线性范围窄酶不稳定、光度分析线性
7、范围窄。竞争型酶联免疫法测定氯霉素含量示意图 四.发光免疫分析法发光免疫分析法荧光免疫分析法荧光免疫分析法化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法以荧光物质或化学发光反应物质作为标记物。以荧光物质或化学发光反应物质作为标记物。优点：优点：专一性强专一性强灵敏度高灵敏度高稳定性好，可避免放射性污染稳定性好，可避免放射性污染标记物不同，因而检测方法也不同标记物不同，因而检测方法也不同A荧光免疫分析法荧光免疫分析法FluonescenseImmuuoassay1荧光探针荧光探针（1）一般要求一般要求a检检测测最最常常遇遇到到的的样样品品为为血血清清，它它有有很很高高的的荧荧光光背景。背景。血清蛋白血清蛋
8、白em325-350nm(ex280nm)血清中血清中NADH和胆红素和胆红素430-470nm(ex330-360nm)探针探针em500nmb.荧光探针的斯托克斯位移荧光探针的斯托克斯位移50nmc.荧光探针的摩尔吸光系数要大荧光探针的摩尔吸光系数要大荧光产率应尽可能地高荧光产率应尽可能地高d. 荧荧光光探探针针要要稳稳定定，且且联联结结于于抗抗体体或或抗抗原原 时不应损害它们的活性时不应损害它们的活性e.荧荧光光探探针针的的激激发发波波长长应应位位于于可可见见光光区区，因为较长波长处荧光杂质较少因为较长波长处荧光杂质较少ex应位于应位于vis区区(2)有机探针有机探针荧光黄荧光黄常用的探
9、针常用的探针荧荧光光产产率率高高，有有较较好好的的光光稳稳定定性性和和低低的的温温度度系系数。其缺点是斯托克斯位移较小。数。其缺点是斯托克斯位移较小。在在碱碱性性的的条条件件下下，荧荧光光黄黄与与免免疫疫球球蛋蛋白白IgG的的自由氨基起反应自由氨基起反应.罗丹明类化合物罗丹明类化合物广泛用来标记抗体广泛用来标记抗体和和荧荧光光黄黄相相比比，其其荧荧光光产产率率不不如如荧荧光光黄黄，可可是是其其发发射射波波长长较较长长，样样品品背背景景干干扰扰较较少少。此此外外，罗丹明类亦常作为能量转移的接受体。罗丹明类亦常作为能量转移的接受体。(3)金属螯合物金属螯合物某某些些稀稀土土金金属属离离子子会会与与
10、某某些些配配位位体体生生成成会会发发强强荧荧光光的的配配合物。合物。如：如：Eu(),Tb(),Nd()与与-二酮衍生物二酮衍生物对对-氨基甲酰三氟丙酮氨基甲酰三氟丙酮聚氨羧酯盐聚氨羧酯盐邻菲罗啉邻菲罗啉2荧光免疫检测法的类型荧光免疫检测法的类型（1）均质检测法均质检测法均均质质检检测测法法不不需需要要分分离离步步骤骤，方方法法简简便便快快速速，但但它它常常受受到到来来自自背背景景（血血清清）的的干干扰扰，该该法法系系根根据据已已标标记记抗抗原原联联接接于于抗抗体体时时发发生生已已标标记记抗抗原原荧光性质的改变。通常将均质检验法分为：荧光性质的改变。通常将均质检验法分为：荧光增强法荧光增强法荧
11、光猝灭法荧光猝灭法间接猝灭法间接猝灭法荧光激发转移荧光激发转移水解法水解法荧光偏振法荧光偏振法a荧光增强法荧光增强法本本法法基基于于当当标标记记物物的的抗抗原原联联接接于于抗抗体体时时原原标标记记的抗原荧光强度增强。的抗原荧光强度增强。b荧光猝灭法荧光猝灭法当当被被标标记记的的抗抗原原联联接接到到抗抗体体时时荧荧光光的的量量子子产产率率下下降降，例例如如庆庆大大霉霉素素的的测测定定，将将限限量量的的抗抗体体加加入入一一已已被被标标记记和和未未标标记记的的庆庆大大霉霉素素混混合合物物中中，荧光猝灭程度与庆大霉素量相关。荧光猝灭程度与庆大霉素量相关。c.荧光激发转移荧光激发转移如如荧荧光光黄黄作作
12、为为给给予予体体，罗罗丹丹明明作作为为接接受受体体，荧荧光光黄黄的的荧荧光光与与罗罗丹丹明明的的吸吸收收光光谱谱重重叠叠，后后者者可可吸收前者的荧光。吸收前者的荧光。例：吗啡的测定例：吗啡的测定i)用荧光黄（用荧光黄（F）标记抗原标记抗原罗丹明（罗丹明（R）标记抗体标记抗体Ag+AgF+AbR(Ag-AbR)+(AgF-AbR)Ag的存在减少了荧光的猝灭程度的存在减少了荧光的猝灭程度ii)抗体既是给予体又是接受体抗体既是给予体又是接受体Ag+AbF+AbRAbF-Ag-AbR2）非均质检测法非均质检测法非均质检测法在检测之前，必须进行分离。非均质检测法在检测之前，必须进行分离。既既游游离离的的
13、已已标标记记的的抗抗原原必必须须从从联联接接于于抗抗体体的的抗抗原原中中分分离离出出来来，或或者者未未联联接接的的已已标标记记的的抗抗体体从从抗抗原原联联接接的的部部分分分分离离出出来来。其其分分离离可可通通过过离离心心沉降，或固相联接抗原（或抗体）来实现。沉降，或固相联接抗原（或抗体）来实现。固相型检测法固相型检测法包括竞争性和非竞争性反应的标记抗原或抗体包括竞争性和非竞争性反应的标记抗原或抗体抗原联接于聚合物表面抗原联接于聚合物表面-免疫吸附剂免疫吸附剂时间分辨荧光法时间分辨荧光法消消除除样样品品背背景景干干扰扰的的另另一一种种方方法法是是时时间间分分辨辨荧荧光光法法。样样品品背背景景的的
14、荧荧光光寿寿命命一一般般为为10ns，而而镧镧系系鳌鳌合合物物的的荧荧光光寿寿命命一一般般为为10-100s。且且斯斯托托克斯位移较大，很适用于时间分辨法进行测定。克斯位移较大，很适用于时间分辨法进行测定。时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫原理图原理图（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）荧光免疫分析法优点：荧光免疫分析法优点：消除放射性同位素的污染消除放射性同位素的污染稳定性较好稳定性较好缺点：缺点：高的背景光，限制了灵敏度高的背景光，限制了灵敏度干扰测定干扰测定B化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法这这种种分分析析方方法法既既有有发发光光检检测测的的高高
15、灵灵敏敏度度，又又有有免免疫分析法的特异性。疫分析法的特异性。1主要发光体系主要发光体系鲁米诺，异鲁米诺及其衍生物鲁米诺，异鲁米诺及其衍生物焦焙酚焦焙酚光泽精光泽精吖啶酯吖啶酯1，2-双氧基化合物双氧基化合物过氧化草酸酯过氧化草酸酯萤火虫发光体系萤火虫发光体系细菌发光体系细菌发光体系2.发光标记物发光标记物（1）发光反应中消耗掉的标记物）发光反应中消耗掉的标记物aLuminol及其衍生物及其衍生物Luminol偶联于配体后，其发光效率较低偶联于配体后，其发光效率较低Isoluminol及其衍生物被广泛应用及其衍生物被广泛应用Luminol的氨基取代导致的氨基取代导致降低降低Isoluminol
16、的氨基取代导致的氨基取代导致增加增加此此类类标标记记可可用用于于各各种种分分析析物物，但但CL需需催催化化剂，因此有较高的背景信号。剂，因此有较高的背景信号。b吖啶酯类吖啶酯类不需要催化剂不需要催化剂优点：优点：高高量量子子产产率率，低低背背景景信信号号和和易易于于与与蛋蛋白白质质连连接接，主主要要用用于标记半抗原和蛋白质。于标记半抗原和蛋白质。缺点：缺点：光发射是瞬时的光发射是瞬时的The molecular structure of the used acridinium ester NHSMechanism of Acridinium Salt Chemiluminescence wit
17、h hydrogen peroxideOrg. Lett. (2003)21:37793782（2）不起发光反应的标记物）不起发光反应的标记物这这类类标标记记物物在在发发光光过过程程中中不不被被消消耗耗，反反应应过过程程中起催化作用的物质。中起催化作用的物质。a过氧化物酶（过氧化物酶（peroxidase,POD）Luminol+H2O2用用POD标记分析物标记分析物b虫荧光素酶，细菌荧光素酶虫荧光素酶，细菌荧光素酶酶成本昂贵，不稳定，荧光酶基因的制造酶成本昂贵，不稳定，荧光酶基因的制造c荧光物质作为标记物荧光物质作为标记物荧光素，丹璜酰氯，荧光胺，罗丹明荧光素，丹璜酰氯，荧光胺，罗丹明d.碱
18、性磷酸酶碱性磷酸酶（ALP）ALP-AMPPD SystemAlkalinephosphatase(ALP)dephosphorylatesAMPPD(1,2-二氧杂环丁烷类）toformadioxetaneanion,whichfragmentsintoadamantanone（金刚烷酮）andtheexcitedstateofmethylmeta-oxybenzoateanion（间氧苯甲酸甲酯阴离子）,thelightemitter.ThedetectlimitofALPis10-21mol/L.ThederivativesofAMPPDaresuperiorthantheparentc
19、ompoundtothelightingratesandsignalintensities.（3）酶标记物酶标记物GOD和和G-6-PDH利利用用某某些些酶酶作作为为标标记记物物，然然后后通通过过标标记记的的酶酶催催化化生生成成的的产产物物，再再作作用用于于发发光光物物质质，以以产产生生生生物发光和化学发光。物发光和化学发光。葡萄糖葡萄糖（4）固相法发光免疫分析）固相法发光免疫分析它它不不需需要要离离心心处处理理，操操作作简简便便，精精确确度度高高，所用固相支持物主要有聚苯乙烯制的管和球所用固相支持物主要有聚苯乙烯制的管和球竞争法：（检查小分子抗原多采用）竞争法：（检查小分子抗原多采用）启动发
20、光试剂启动发光试剂lAg+Ag-L+AbAg-Ab+Ab-Ag-Lh 夹心法夹心法：（检查大分子抗原多采用）（检查大分子抗原多采用）lSp-Ab+AgSp-Ab-AglSp-Ab-Ag+Ab-LSp-Ab-Ag-Ab启动发光试剂启动发光试剂hvl其中其中:L为发光标记物或发光底物为发光标记物或发光底物,Ag为抗原为抗原,Ab为抗体为抗体,Sp为固相。为固相。ACS 180由德国拜耳公司生产，商品名为ACS180全自动化学发光免疫分析系统有ACS180Plus和ACS 180sE等型号,2000年又推出新代的ADVIACentaur免疫测定系统吖啶酯可通过化学反应直接标记抗体或抗原当在碱性介质中
21、氧化时，经过一个二氧酮的中间体，产生一个电激发的10一甲基吖啶酮，当它回复到基态时释放出光子Elesys (1010 2010 E-170)瑞士罗氏公司(Roche)的ElecsysECLIA系统，综合了各种先进技术，具有独特的优越性，是目前在医学检验中应用的唯一的电化学发光免疫测定仪器3化学生物发光免疫分析法的特点化学生物发光免疫分析法的特点（1）优点：）优点：高灵敏度高灵敏度宽的线性范围宽的线性范围分析速度快分析速度快高选择性高选择性高稳定性高稳定性花费少花费少所用试剂无毒所用试剂无毒消除放射性同位素的污染。消除放射性同位素的污染。（2）缺点：）缺点：实验结果的重复性方面存在一定问题实验结
22、果的重复性方面存在一定问题发光免疫测定是一种瞬时的化学反应发光免疫测定是一种瞬时的化学反应免疫反应中各种因素的干扰免疫反应中各种因素的干扰氧化反应中各种因素的干扰氧化反应中各种因素的干扰对对催催化化反反应应原原理理有有的的还还不不十十分分清清楚楚，对对实实验验的的反反应应条条件件不不易易控控制制，干干扰扰现现象象不不易估计和说明。易估计和说明。（3）最新进展）最新进展a多分析物系统的发展多分析物系统的发展b流动注射分析在免疫分析中的应流动注射分析在免疫分析中的应用，使分析速度加快，适用于大量样用，使分析速度加快，适用于大量样品的测定。品的测定。c由于发光仪的商业化，刺激了化学发由于发光仪的商业化，刺激了化学发光免疫分析的常规临床应用的发展。光免疫分析的常规临床应用的发展。d.无标记免疫分析法无标记免疫分析法e.微流控芯片免疫分析微流控芯片免疫分析f.基于纳米探针的免疫分析基于纳米探针的免疫分析课程论文课程论文均相荧光免疫分析法非均相荧光免疫分析法化学发光免疫分析电致化学发光免疫分析
