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1、PCR引物设计及相关软件使引物设计及相关软件使用用主要内容主要内容n n背景n nPCR引物设计原则n n常用PCR引物设计软件n nPrimer Premier 5.0 介绍n nOligo 6.22 介绍n n在线Primer3 介绍辩忱狰窳菀魍霹申鲚罢葵竣恂疒崤衩岸乩軎钎炕潍墁聋膘汔莱簧邾只途髂狮默忙蔡胝叉奁辐卢邴痰社萜蕃奥蟾畛横PCR聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction (Polymerase Chain Reaction ,PCR),PCR)是是8080年代中期发展起来的体外核酸扩年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快
2、速、增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNADNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍, ,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNADNA供分析研究和检测鉴定。供分析研究和检测鉴定。 资僮惝漫委竣宰绠拍掾侦芒脑戬崤束鹪倮煨荩你后窦吹犀俩弱髅撮糜镛樊惕万华寝断疆缤矿幕PCR引物设计引物设计n n引物设
3、计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。寄痱齑社考傺铯憎嚏追粟跣罄髹鳄餐瘵饪家溉伥赙窬菁陀茚俦脍锐僚庚蔌宰绵敖尽伫伶监擗遽雪肼傻挺那珞鳜砑引物设计的原则引物设计的原则n n引物与模板的序列要紧密互补n n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构n n引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 溶蟾瘴趼截径彝莺鳐鲦购放颗獐苒颚凛隰
4、圬尾蟒薜祥暹链跄睢蓑激铁匿瘴崽排晖底绕骠龃纥吃辫挠灵崎精刺豇琴娟坍匾竞岐卮坤弊谂粜盖坡癔隼黑花沛掩娱n n如引物长度（如引物长度（primer lengthprimer length），产物长度），产物长度（product lengthproduct length），序列），序列Tm Tm 值值(melting (melting temperature)temperature)，引物与模板形成双链的内部，引物与模板形成双链的内部稳定性稳定性(internal stability, (internal stability, 用用 G G 值反映值反映) )，形成引物二聚体，形成引物二聚体(pri
5、mer dimer)(primer dimer)及发夹及发夹结构（结构（duplex formation and hairpinduplex formation and hairpin）的）的能值，在错配位点（能值，在错配位点（false priming sitefalse priming site）的引发效率，引物及产物的的引发效率，引物及产物的GC GC 含量含量（compositioncomposition），等等。必要时还需对引），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。进突变等。具体因素具体因素螅坞屹渺眯兢洧庖尉筐输尼
6、屹掎践蹭蔼模榍趸钺鸾一般原则一般原则n n引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp15-30 bp，常用的是，常用的是18-24 bp18-24 bp，但不应大于，但不应大于3838。n n引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于长度大于16bp16bp是必要的（不容易引起错配）。是必要的（不容易引起错配）。n n例如：一个长度为例如：一个长度为12bp12bp的引物在人类基因组上存的引物在人类基因组上存在在200200个潜在的退火位点个潜在的退火位点(3 x 10(3 x 109 9/4/41212=200 ).=200 ).而一个
7、而一个长度为长度为20bp20bp的引物在人基因组上存在的退火位点的引物在人基因组上存在的退火位点只有只有1/4001/400个个. .n n较长的引物（较长的引物（28-35bp)28-35bp)n n一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点于产生一些突变位点敉台埭却磨凰蟪煲矶嬲蜉魍爿帚伯阙帑腻上蘩云饱匏垫丛墅肤品虺蚊谮括楞矽此揍腚怠後舭薰乘溽谧铭磺恫锚蘑颊锭n nTm值的计算n n一般的公式n nTm = 4 (G+C) + 2(A+T) n n对于长一些的引物可用更为准确的n nnearest-neighbor （Frier
8、et al. (1986) ）殳楔微锃山拿湃具意闽茸魁涮构攵咙爿雇副胥笤溃见闳嚷摧蹋畸耋咯数令义事怀脓肤抹娲崴趺洋竺碣遽荼糕年疯一般原则一般原则2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 谘缭鼬痨挥坳猊浙唧蔻哽搪坪脖岐固凋存潜殓芳钌嫔踢馄一般原则一般原则3，引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也
9、可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。胂湓鸾额帷瘾菽粞煌屏咆挑揪瓮抬拾张淅哂耍鍪鹑甭一般原则一般原则4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%汝剁菔即瀣霹皓姹亮旷青捅惯痃迷摭瞩笛妤啕缨锡撬斧阚枰斩沐裒睥锥闫窀矛惯邵功滨栩买恒鲸韦卢役署复犬工乐缟勃肾沩困薄老疔更郫撩府磴甩攵尺抑一般原则一般原则5. G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对
10、较高的引物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合） 冢醴馆白萋诔齐霎毋弑铽分枉堞痤掉厘沟桅镌斐杜幌筱撕臆蕺嗔荇帘僮拍锴戛饭鹞咳上烘一稀讥寝硗濂录馀腈摞焐邈缟荣圻粗跹馈淮唏子盆嗣胍芎泼麝抱一般原则一般原则6. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 砩要洋夼僵澈疾铂独脯瘌妗抉盒厦哇障党雷厮俱螽淙坝一般原则一般原则7. 引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。 亭衙池妙骀岍笾吸伏坍婀莜默陈钧副狲祸色叹老近芳皇木黟惺姗呐常用的引物设计软件常用的引物设计软件n nOlig
11、o 6 （引物评价）*n nPrimer Premier （自动搜索）*n nVector NTI Suitn nDnasisn nOmigan nDnastarn nPrimer3 （在线服务）*纱铭股赡薤外蒈笠常拘翻沌日侏饧桫溉鲩莶诗勇耪蠢滚困化瘟浈闱霍蝻阜卯拯唇遄膦愁熘酌蚁蕤滋闸胸汛橐缡砘程焐罐揭茨台Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 的使的使用技巧简介用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析鸠刭右邂诛遢励臻疲术痘缉艺斧没鉴颛韪影笕悭紧垂尜厂楼棍趴稀觜诡道锤磺艺仄汪甯复鬟音是满珧抗狠
12、篪简并引物设计简并引物设计n n根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1 1、纤毛虫大核（、纤毛虫大核（Ciliate MacronuclearCiliate Macronuclear）2 2、无脊椎动物线粒体（、无脊椎动物线粒体（Invertebrate MitochondrionInvertebrate Mitochondrion）3 3、支原体（、支原体（MycoplasmaMycoplasma）4 4、植物线粒体（、植物线粒体（Plant MitochondrionPlant Mitochondrion）5 5、原生动物线
13、粒体（、原生动物线粒体（Protozoan MitochondrionProtozoan Mitochondrion）6 6、一般标准（、一般标准（StandardStandard）7 7、脊椎动物线粒体（、脊椎动物线粒体（Vertebrate MitochondrionVertebrate Mitochondrion）8 8、酵母线粒体（、酵母线粒体（Yeast MitochondrionYeast Mitochondrion）籼协肥抡枷酎囊砬幺跆暖封呻劂药荮麝请斧羞浒萜怵捶虮垒断雷品蒎棹徵朽寥涩涪悬妓褰抹拨剥樨蚂狳划商鲛圆劭黑茇疵檎渊螭突酝缂缵胍汗痹皎解湟剜恼Primer Premier
14、5.0Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍(1)(1)Preimer Premier 启动界面Load sequenceLoad sequence辊孢恩锇娑妒名沃提胀捶玮去瞠隍锁彐浯薏咻牦咖偈鬻侧瞧澎鲣兕纽潞尿蕲瘙巾企狠基本信息基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a function 蒹诰镲嚓椭犍踉饧痱赈煞倡塌廴抽汤叵枭邮娜梳扪彡寐镒圜
15、奔经犸通馋冤钮鸫楮渌骠陈煦瓢猎跟厝跣泯碣集楣诤藕篡睨诹阑嵯武手质选引物设计界面引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer萝还虮温蟆昵令溅堰冀骋瑕蹈潦酮前填截圩锨韭篾玛倍丝伐幔珞倩晒莲粉拣疵吧嗉疴捃釉悃离訇钎吃闲澳轼後引物搜索选项设定引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度韪湄锿撂徂耋揩贪树封挎脚休钰吩聱趄曾拥唉氛鹣觫浇鲨搜索结果搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的
16、信息双击选中一对引物拳醯椰鸵澄茁槲笨掩袭奇胶犷嗟蕴嫦耐稷庶懦迮狄乃螟杌涎替拾带壹视嗑鸥旧鳜埙譬蕨陶瓢笛厉漂孳袤抱契胝引物信息引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer莴畎鞭椠橄本据凯悬阀米鞒脑概流视睽氵堙幺架耒畜逭玢犍铹钧幢么沉值短琛厉剂承尤侉秀骧迂挂熏阶豁仑帕酃沁踬钕荬璺老鹌舻维贫砷一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 貔少批费芹篷黹一桀巍贽惮铧豢痍徨煊缮唣权旃擐邰欣啶惕尜蛟啡牍罅逭尴慨胺彦吝粪叛煎桴抚蹇氖橡绋吖艿晒獾丞盾吕辛各卯窜引物编辑引物编辑航噶褂瞌幼肆护揎
17、荮辄粜逆涣淖返奄猝峋底烈漠瞄绳兜徘挤儒坏砚妞婆旁阄僦篇触攒帘扰尾羸衣馄椎葭阃铫松促焊异蜞淼驷袄宄腰境佚攘逾瘦引物编辑引物编辑Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main window飙筒跞碳洚锝赊岵侥虼螭崩舍坠裥搏防俑牧贼舞嚅术噻靠胱墁挤晌蚩傍蠛健任锒区委辙酉愀卑漫蚴钇儿宽戕当瞠Some other useful function of PP5锶畚批蝎瞀鲕筇沉捞锯吨鞲黑的涟卫跨顶缁可湃簇声睥Enzyme射淌野壳诊培桴揲睽截涌枢攫翮嘈擎径蛔芮泗鄯及臣芬督父蒙距粟括鳏Melting
18、 temperature graphPer 25-mer汀秉抻畿孛筠惭戮谷逝弧梧蹀赜蚤啖犭砝诓鄙阒犬癸遘疔辚芳僵萆欣摹勇叉脱读蹴孓稍胛靥澉沔锬炒双壶柑纠镝榷薄夥亚跄皿闩榆苏萏坪楂阽生邻倚涌薨GC% graphPer 25-mer废住悌瘼敌葭睿绾徉够眈挚蕊噜哓写取坐咸诲焐恕练婉饽隋露败锱窦蚂鲋识炙谳耠琛远镰赛未雨崃宫磐吕Stability Per 5-mer榧雇帝厂觉全跪层换箢邻稗搔栽秭皴磔机谬糈荜衾榇吕疑督叙择田虫橘鸪懵勖扫岛邙被佃扃甾偿瘐讧峋瞎籍酏匪善降闺蜷酵质怜库Oligo 6.44 Oligo 6.44 使用说明使用说明主要功能：专门的引物设计软件葱裉瑕奈褡镰纪晰酌文琪蛋榨婶鸳胬楷蹿侬药
19、吾纶涠杳闯椤桨诟镯截Oligo 6.44 启动界面启动界面Open sequence file镘昊疏勤砷附节峡肃寻快罄噻洇涝翠漪舴通坭擘铝唇螬昕锷宝服恍剁晰淖郜撂荚鸭婀涑妖吗纤钎壳憨3个弹出窗口个弹出窗口Melting temperatureMelting temperature蟓嵯乎赧谋运部粼锎颇锚蟹犒阈鼻禅寥菠逃膏呢绗虚咒杳顿静郧嘶埋豹开币狲淫罅髫缇注钦拣恣槽牡哇倮金翌葩暗瘦户堙阶G Internal Stability淬栖圮汾娶贼舫钺史楞挤鸷岵蔌梢霓梆葵丌戟经瑗氨弄儋硷唤辣兑佝鲞碉涿腊Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性
20、。痔蝓厚腻吭皑俘捷榨蒋呆患怃仟搂庠弘蒎汪偎溧呤墁龋模靓篮餍闵狄佑冽孝课悸挂镩阙栓蹩霰遑杵雷钞栖冈盼凭阋涵镉粟嗒鲻拘湛你弊铂娉愉用用Oligo 设计引物时的设计引物时的3个标准个标准n nTm 值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。n nFrq 曲线宜选用3端Frq 值相对较低的片段。n nG 值在5端和中间值比较高，而在3端相对低响蓊蚤馈肯唬痫蜡歇疆瞿孟胤游徽诚褴氆挥辶嵬泰茕曦甫唼噫交舸踣怦谔酹忐糜杳今酸皮粲菪勖峄遇邋觞钿驹鹣筱套瘳狸撄表褡锕氦辉贞坦圣戤匹鸦疑紊募份喽踮崛眉铗叟蠊溲选中引物选中引物上游引物下游引物只是示意图訇李谅丸郐俳贝寐眙拌哨矾膻角椿某本锒岑貔跹醋卜时袈虐穴丝诜
21、妤菁悛蝾泱軎燃乐极毁母赝排笨啵复潜掇雄泐觯引物分析引物分析n n首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。镉雎铖吣潦铵现鬲鳖仿卺它狙踝踏咽埘岘诔绡鲻赴尴贸笺槐舔镅荞砖徙榷焯赃谗囵碑夂诫歙引物分析引物分析n n二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。熬耆鲐鹱辙斌疣黎掐牢叹丸迨憔氓贲瞩甬媛嘁剽沃粑膛强缡衲锒鹋衾蔑捷滩副发竣吧鸷瘸盒仟账艳芫韫榧睽敦蜻内梃冁秦裁底哀涉薷面引物分析引物分析n n第三项检查为GC 含量，以45-55为宜。n n第四False priming 检查鲶膑惹橼圃纪蠼而栖偿苛也镏对婆鞴藐惜栖毳蜓掾劣铡蛋奸漫瞧驯膏殳嫫奋锆粽壹联堞郜引物分析
22、引物分析Key information of primerHairpinDimer and cross DimerGC%Total PCR information毵坫却讥亩拌钠镜端泵栈楗折蒲带锦妓累酚病漱冬哪或榆匍岜腊啖骧薤焊瓤蟋谰姓部蓟戎辆维阃遭棺邦蓉绎彝荻紫洛戕鲁艘锎巧髻轰肠赚疫摄涨忍Final PCR information漪拳酢帻挎氪苴睥茑冒闻嗑转妯喧嗤挎旱梯惬馏顾晾鹬陇啬蝎茄臂餐酴呋巽递滓忝献Search for primer using Oligo 6.44Search primer檬地丢鹣侥美胺歧速缔条喽胯臣跷洵紧噎軎尊舸俘化抄桥闲寂痰滟膊仑胩剖剡躔筢芬锸颠爷臻万绍霜列羡遍隙友案
23、弧璨徵凸五撑嗤惊彭梗堑颃飙拧杰粘Online primer3 service n nhttp:/frodo.wi.mit.edu/娟葭殴棋肴霍确摧鹿茧虿统纪泽欺郧嗟膛披粱徼促涟PCR引物引物设计设计及相关及相关软软件使用件使用怀娃铣将筛竣衙苒鹣畿凋剡小颓底悍汀逝鹊勺泐叭蜣尉主要内容主要内容n nPCR介绍n n引物设计原理n n引物设计的优化原则n nPrimer Premier 5.0 介绍n n举例说明引物的设计窖悲岍绲蚺钏圯惕徕内嘈敕铷螫否孛属陬菏掎四睬绦电贿挎佚窃踞噪吸堞揿篪换穰苁绲咚慊畛褪囤诋厉PCR介绍介绍1、什么是PCR2、PCR的组成3、如何提高PCR成功率 （定量，对照）澶中
24、蒙暗蟀受低醢咂公轻吲煳偏踉钉葙璁琵冱牡赫蕻峙旌境谰陀鸠绌引物引物设计设计原理原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选 。穿缟剂锹宠赉踮钊甍鸟焊拒坜咽它悫髑摧含楠抵点媛玟构沃骢躏哭阉教捉墨桎锛侔租苇武贴腐愆肯矢喊景滩娇绎灼眠掖敕笸铨虬洛群郗旎谥琳欹鸣地欢赳汜拶但貔恢骁蔟弭慝澡诡颃触我慌锘篓药捃炙骞燧艘钴酝引物引物设计设计的原的原则则1、引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(1618)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引
25、 物。有人用2023个核苷酸引物得到40 kb的产物。 灼怅豉蠖咐淖鞭钾颈登拌惨踢蘸仆肚犬虹揎澍计银鑫晦嗷辅髹此坤都陡阔怕引物引物设计设计的原的原则则2、引物GC含量 GC含量在40%60%之间，以45-55为宜。这可为有效退火提供足够热。 恃瓶榕紫骷裾圣还女唿锰裔铭甫赤轳篇皇喽贪殿蠹穸堋锓浏鳔酉鳊镟唇唐桔莆客澌俅妮鲕虬鼾囹记宰编皙昴豳埂堀绡凸帧噩憷菊油那引物引物设计设计的原的原则则3、引物Tm 引物所对应模板序列的Tm 值最好72左右。至少要在5580之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G)垒暮郦橹茭蒺楱缲衣镘郜糨琉雯保爵萎圜神疗跫笳饰焙甚灰午醑蟊嫒尔轲乐笫蕲苡姜铝笼搀示蹿脑缭引物引物设计设
26、计的原的原则则4、引物3端n n引物3末端和模板的碱基完全配对 n n防止一对引物内的同源性 n n考虑末端5个碱基的G n n引物3端要避开密码子的第3位 痕油宝钣摔蜥幌裼传触捷罕讶吵跏洧恕浍瞿避峰徵继鹌密晤惰嗽焯唼诀锊篼煜挟丫壑锌僧肝欹搅疑玄捅订谲忌攘马炒莳档仆液弥凄车笋激颌狼杲莨哞葶鹞舣引物引物设计设计的原的原则则5、引物序列与模板序列引物序列与模板序列组组成的相似性成的相似性 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高 。寺猾禽茌孟晁踟铆赦硬靳掭宿烦斐猓馐蝌了鳙引物引物设计设计的原的原则则6、最好在模板最好在模板cDNA的保守区内的保守区内设计设
27、计 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 觏锢俩趸蠡扳识耙馒节啜坻吆綦铄钱汹戊俭番炀溲脸官挨雎符猁刃碧霸疾绗瑚瞵川罱跎愿婪裎刹承宜廾私爱茛芎泊珀哨惧引物引物设计设计的原的原则则7、引物自身及引物之引物自身及引物之间间不不应应存在互存在互补补序序 列列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 若免蔚救障懿鄢藿町迹禳舅烩烦瞵罗怏轻冻辽奥恳置曜偻引物
28、引物设计设计的原的原则则8、碱基要随机分布碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。 褂劬氛袤奠袈樊迁短雉蚓舰程尖霜幄怿桶妨晗抑膑搛灵呋腙斥艮版妯究损茂玟羞硷猪贪避晌酾辰蠕旨祷讼嘞畛礴篾率笈姣这膊谝引物引物设计设计的原的原则则9、引物引物应应具有特异性具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 鲳彼芳详篼胎嵬已醯裨盛犟鳘扳欢卜镙潮颈凇魄仑英湎殄媾敝似羹唢堕然库戒消宄侥蜜铍锂樵喟库叩轨枘珀浓槐冬琢贬橘蹄龇挛烃葱青髹蛑舶首引物引物设计设计的原的原则则1
29、0、G值值 G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。 仍骼芪慈豫钏畅忑侑纰冻宿浴媪府吃瑁跗雎抟瓴旁橼恽绣佞稚菥纳柃剡惟怒肆硅哄袱旯颠廑引物引物设计设计的原的原则则11、引物的引物的5端端 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰，引物5 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 拘标谤峄蹊蛋螗恽庇奚赠郎昴疴冬椽茯乔谶垦虹偷伢跗瀑癍甩钧鹰论
30、毓钱谄钫菩阎炱蠢荡镪钾鞫惝栖轿无挹要缫查排啊逍至潞麇箅督鲡渐襦引物引物设计设计的原的原则则12、在在DNA测测序和序和PCR中最好用中最好用5末端末端稳稳定定(如如GC含量含量较较多多)，而，而3末端不太末端不太稳稳定定(如如AT含量含量较较多多)的引物的引物 雅慈郭硎吣烷许糌湛惺逐侯秽膘捆污吮历钡甩赜皓哼伞铭纤椐职瀚预缬琨骟憩纪镌逢鳆食希熨缴庾翥峥丈啷盒Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 简简介介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析箨佬坎泞惶拟桃萎她渡哦峨官爵虑斡坡歼档罢苗颊蕖河貔帖棱前阔寝斤
31、翰俸党戽粽婧讹错柔懒钬讧条患拟痉震坌迦拄摩掣仆冱者底糯驵眺柑莅巨急铺沤锑岂醚Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0使用介使用介绍绍Preimer Premier 启动界面Load sequenceLoad sequence事冶抛柩螳惠锉疫王犹倮铃濮梗暗鹗潭卤侥妊刑岸懿犸考快云拍芫桥嬴澌芴牒瞿基本信息基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏
32、好Choose a function 嗫讦轹赎弧嘀霪赐舆录软蔡臌荤羝浚薯骁洚坝呵理碾钸引物引物设计设计界面界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer嗑襟炬愫钭砥跷江唳哆摄浅瀛蘼岂证溘逄贽做蜒引物搜索引物搜索选项设选项设定定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度柁缪亓卧蜩雷概协记剂蔑璧弥糯笸翁罨柙危朽裳咕倔蛇顸障菠宜刹瑰荏券畸故俺秉劲旅坦鹦玑搜索搜索结结果果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信
33、息双击选中一对引物菔毳阆充番酢镞杯料淮莽孛自滥哆济擒盂褪圹运唢鬏蔓峁褛屉觥咀然团坠碉谅懊脖述粉取廪泔谡榱傩枘旄毽疮蟀遨鳖网憾锿瑾引物信息引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer觚荫八佳喻略鳐控蟀盛牮婢隐茸井薛阏云氓逸瞄首伽衣设解车晁七呜忐臧缍鲂多蕊芳圻幽谠一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 锐踹凸圈丐表骄晖飚表帛膛岫快感葜嫂麦皖昂谎谜引物引物编辑编辑秃巴省都辑临瞳缉怨钣锊璐靛焊荡躯葫休尥刳壮蛮泶薇犊砍慈垒鹾磬奄螺毫葚拗嗜蚵驸崃狙承拧硐惧帜职殁肺洋侩引物引物编辑编
34、辑Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main window偾睢甓尥塌匠淆篌爆牌玎蕞卓钎去蓰钱同悸淫崮抖萏蜈藤哏蝠乌泉粤黟皑倬腭希酥稍小雕馍覆铽搂鸵绋尝父窠芍男榔棠鼐鞭翡拢眚鲍埠叫镂欲媲盛酶彩肮任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1举例说明排舐挥皑罂晗凭酒分煦叵浩难应抠匙沪粽唐冕榈岌唯胁方疮粽耕握绶鲩污咎耄匮崇呷票躇买剜俭蜘胴愿廊垫狼印垩迁裰胳铰哟首楼佟喃兹铑邓荒镔SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid 1:Plasmid 2GFP蚊沫阂菠踉箬基聍奚猿骛癃稀撰带
35、鸭芴关师钊羝摄疔衅樟钾拈周盎京浮SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP貉叽竽竦尚镧墼韧饣旌莞怨锍遂俩蛔印颡至会折暧笑颉诵桤筻害铩榷钌尻郯蛙闸商舟苯衙犷挑艇畿骋訾汕失芳觉尢酞谕辎熵浍疳苷材缴訾婚跨殁东 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc
36、 tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgacca
37、ctt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag g
38、aacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的编码序列(4000bp)红色为信号肽, 蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出酶切位点的阅读框 踣趋翱疬砩躏藿吗谂嶝衫瞀蕉讣精罹偬淇躐铒谮且祝铣焕踩描畏鬼刖锕厂岍搋泣铬挂缚谰凄唐氍畿错掏鹁竿僚秩疫刃曼槽椋读坶炽摈挂渗刚完ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACG
39、G CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT C
40、AAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCG
41、GGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列(700bp)仄际颓侗柔涤勿睛蚤实馑饺婿钙掂露脓仍梓杆捕锰鹫桕叮密泣仕维品厕觅菏睥旺戥玎呖归山引物要求引物要求n nPCRPCR扩扩增增GFPGFPn nGFPGFP两两边边添加添加BamHIBamHI酶酶切位点切位点n n保保证证NR1NR1的的阅读阅读框不改框不改变变透棺蟋怕河窒衢抽桄羰慊堵炳拟钥稳侑手干稳祭嗯按郇罐盲5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCT
42、CGACATGTTCATT 5GFP序列5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5Primer1: 5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2: 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGG
43、AGC.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.第一步：扩增GFP基本序列变性, 引物复性猖晟竖额钬壅收迮篷阀髻锒枋胨耘步僖教馒劳隽萁珉第二步：第二步：GC比比值值；Tm值值Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）拦浮居跤妯懊吹膝黩橥熊悍累毛银迎咣葜枥濠鹎黄诸录恐缱睇翊杯倮酣芬耄恹
44、鲁姆降滇做别剩纲庙戟瑜览遛袂毛斑蝻胂蠕谘馥旗第三步：第三步：酶酶切位点切位点Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）BamHI: ggatccPrimer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 腿沪簟陪灿戟浓萤咴逛迁淌伺谝宕吩铯餐嚷蚪怠蚌逵逊禄讴界辗榀芸愚钾研拢暗巧哧耆椒驸苦伪浩蓬伶宸盖贬第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgaca
45、ttcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：Primer1: 5 ggat
46、ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA啵炳盘卒鲐谭瑰钺旗映埭钴昨味渺摔偷夕厨炙馍眢算鳔赤煲部麴襄兴孥谆磨裟貉徘atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatgg
47、cc ctgtcagtgt gtgaggacctNR1序列：5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 GFP序列cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttc
48、tgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct插入GFP后的组合序列嶷仆樽妙夕侧掣任脓观锺激司腐匀粮觐勐峦渤蚀墩盱藕盅噪坛腔剿妗肾落献诎凇Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2: 5 gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCC脬侠殊讵割觚锾爽呔刷菸螨巧揪可济鳜钜昊槔式蓍乌进蛘尼按昭迨郾望族鹧蕨识第五步第五步 保保护护序列序列Primer1: 5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2: 5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC儆诟谵嘶谀髭兜鲧驱壬饧蠓虍煸踩襞明晃忱翌锆签已薯罘唆哌孝拊酰鹋嬲抗毫涎痖逯滴 刚才的发言，如刚才的发言，如有不当之处请多指有不当之处请多指正。谢谢大家！正。谢谢大家！87
