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1、菌种鉴定菌种鉴定制作人：张立岩制作人：张立岩制作人：张立岩制作人：张立岩2021/6/161内容内容简述简述16sRNA鉴定菌种鉴定菌种总结总结2021/6/162 传统的细菌学检验与鉴定的主要依据是形态特征和生理性状传统的细菌学检验与鉴定的主要依据是形态特征和生理性状, ,需要进行需要进行细菌培养及一系列生化反应或免疫学检测细菌培养及一系列生化反应或免疫学检测. .方法复杂费时方法复杂费时, ,对有些细菌对有些细菌也往往不能给出理想的鉴定结果。也往往不能给出理想的鉴定结果。 诸如引起肺结核的分支杆菌，其生长缓慢，经常要培养几周才能得到诸如引起肺结核的分支杆菌，其生长缓慢，经常要培养几周才能得
2、到供生物化学分析，鉴定和株系供生物化学分析，鉴定和株系/ /亚种分型亚种分型(subtyping)(subtyping)的纯净培养物。的纯净培养物。通过传统的培养和生物化学分析方法对其检测和鉴定费时且费用大，通过传统的培养和生物化学分析方法对其检测和鉴定费时且费用大，影响医生给予患者最合适的治疗。因为如果不能对细菌进行快速精确影响医生给予患者最合适的治疗。因为如果不能对细菌进行快速精确的鉴定，医生只能给患者开广谱抗生素，因而引发无效治疗和细菌耐的鉴定，医生只能给患者开广谱抗生素，因而引发无效治疗和细菌耐药性。药性。 简述简述2021/6/163分子生物学鉴定分子生物学鉴定 随着分子生物学技术的
3、发展随着分子生物学技术的发展,PCR ,PCR 技术以快速、敏感和特技术以快速、敏感和特异等优点迅速地应用到微生物检测领域异等优点迅速地应用到微生物检测领域 。 DNADNA所包含的遗传信息决定了不同种生物之间以及同种生所包含的遗传信息决定了不同种生物之间以及同种生物的不同亚种物的不同亚种/ /株系之间的差异。因此分子诊断对细菌的株系之间的差异。因此分子诊断对细菌的分型比传统方法更为准确。分型比传统方法更为准确。 2021/6/164类别类别分子生物学分子生物学分子生物学分子生物学菌种鉴定菌种鉴定菌种鉴定菌种鉴定PCR-RFLPPCR-RFLPPCR-RFLPPCR-RFLP分析法分析法分析法
4、分析法 16S rDNA16S rDNA16S rDNA16S rDNA序列分析法序列分析法序列分析法序列分析法 REP-PCRREP-PCRREP-PCRREP-PCR指纹法指纹法指纹法指纹法2021/6/165 RAPD-PCRRAPD-PCR是使用较短的寡核苷酸引物扩增一群长度不等的是使用较短的寡核苷酸引物扩增一群长度不等的DNADNA片段混合物，这些产物经琼脂糖凝胶电泳呈现出的带片段混合物，这些产物经琼脂糖凝胶电泳呈现出的带型，反映了用于扩增模板的型，反映了用于扩增模板的DNADNA分子的总体结构特征，所分子的总体结构特征，所以能够测出以能够测出2 2个生物体（包括同一物种的不同个体）
5、基因个生物体（包括同一物种的不同个体）基因之间的差异。亲缘关系越近的种，之间的差异。亲缘关系越近的种，PCRPCR扩增带型就越相似，扩增带型就越相似，反之差异悬殊。反之差异悬殊。 RAPD-PCRRAPD-PCR 2021/6/166 目前在细菌分类学及菌种鉴定研究中最有用和最常目前在细菌分类学及菌种鉴定研究中最有用和最常用的分子是用的分子是rRNArRNA。rRNA rRNA 结构既具保守性又具高变性。结构既具保守性又具高变性。保守性反映生物物种的亲缘关系保守性反映生物物种的亲缘关系, ,高变性则揭示生物高变性则揭示生物物种的特征核酸序列物种的特征核酸序列, ,是属种鉴定的分子基础。是属种鉴
6、定的分子基础。rRNA rRNA 的这种特性使得这一段核酸序列成为目前人们利用的这种特性使得这一段核酸序列成为目前人们利用PCR PCR 技术检测不同细菌种间或种内差异的最为理想技术检测不同细菌种间或种内差异的最为理想的模板。的模板。 一般的菌种鉴定还是最常用一般的菌种鉴定还是最常用16S rDNA16S rDNA分析分析. .由于它能由于它能快速准确地对微生物进行分类鉴定快速准确地对微生物进行分类鉴定, ,所以它在分类学所以它在分类学中的核心地位不可替代中的核心地位不可替代, ,还是受人们的青睐还是受人们的青睐. .但当但当16S 16S rDNArDNA序列同源性大于序列同源性大于99.5
7、99.5时难以获得准确的鉴定时难以获得准确的鉴定结果结果. .2021/6/167卡拉胶：一种红藻多糖，由卡拉胶：一种红藻多糖，由1,3-1,3-D-吡喃半乳糖和吡喃半乳糖和1,4-1,4-D- -吡喃吡喃 半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的线性多糖。半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的线性多糖。加拿大加拿大LabattLabatt公司的研究人员在啤酒腐败菌的乳酸菌的检测中公司的研究人员在啤酒腐败菌的乳酸菌的检测中使用使用5S5S和和16SRNA16SRNA基因进行基因进行PCRPCR扩增，用于菌种的特性鉴定。扩增，用于菌种的特性鉴定。已成功地对乳杆菌、片球菌、明膜串珠菌属中的菌株做出鉴定。已成
8、功地对乳杆菌、片球菌、明膜串珠菌属中的菌株做出鉴定。现状现状2021/6/16816S rDNA16S rDNA序列分析法序列分析法 2021/6/169具体流程具体流程基因组的制备基因组的制备PCRPCR克隆克隆16sRNA16sRNA阳性克隆鉴定，测序阳性克隆鉴定，测序同源性分析，系统进化树建立同源性分析，系统进化树建立2021/6/1610系统发育树系统发育树根据同源性分析结果和系统发生树来判定该菌株为根据同源性分析结果和系统发生树来判定该菌株为Cellulophaga属细菌属细菌, ,命名命名Cellulophaga sp.QY201。2021/6/1611总结 筛选得到一株高产酶菌株
9、筛选得到一株高产酶菌株QY201，该菌株具有酶活高、降解，该菌株具有酶活高、降解 速率快、并且能同时分泌出速率快、并且能同时分泌出-、-、-卡拉胶酶等特点。卡拉胶酶等特点。 通过采用形态观察和通过采用形态观察和16S rDNA技术，菌株技术，菌株QY201可以鉴定为可以鉴定为 Cellulophaga属，命名为属，命名为Cellulophaga sp.QY201。加拿大加拿大LabattLabatt公司的研究人员在啤酒腐败菌的乳酸菌的检测中使用公司的研究人员在啤酒腐败菌的乳酸菌的检测中使用5S5S和和16SRNA16SRNA基因进行基因进行PCRPCR扩增，用于菌种的特性鉴定。已成功地对扩增，用于菌种的特性鉴定。已成功地对乳杆菌、片球菌、明膜串珠菌属中的菌株做出鉴定。乳杆菌、片球菌、明膜串珠菌属中的菌株做出鉴定。2021/6/1612Thanks!Thanks!2021/6/1613 结束语结束语若有不当之处，请指正，谢谢！若有不当之处，请指正，谢谢！
