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1、蛋白质一级结构蛋白质一级结构（primarystructure）的测定）的测定 蛋白质氨基酸序列测定的一般策略和蛋白质氨基酸序列测定的一般策略和涉及的一些重要方法与技术涉及的一些重要方法与技术序列测定前的准备工作：序列测定前的准备工作：样品的纯度：样品的纯度：97%97%以上以上相对分子质量：允许误差在相对分子质量：允许误差在10%10%左右左右 肽链的数目肽链的数目氨基酸组成氨基酸组成一级结构的测定主要用一级结构的测定主要用小片段重小片段重叠叠的原理的原理 一、蛋白质氨基酸测序的策略一、蛋白质氨基酸测序的策略 (1)(1)肽链的拆开和分离肽链的拆开和分离 (2) (2)测定蛋白质分子中多肽链
2、的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 (3) (3)二硫键的断裂二硫键的断裂 (4) (4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出 氨基酸成分的分子比氨基酸成分的分子比 (5)N (5)N端、端、C C端的测定端的测定 (6) (6)多肽链断裂多肽链断裂 (7) (7)测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。 (8) (8)确定肽段在多肽链中的次序。确定肽段在多肽链中的次序。 (9) (9)确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。二、测定步骤二、测定步骤(一) 多肽链的拆分多肽链的拆分 由多条多肽链组由多条多肽链组成的蛋白质分子，必成
3、的蛋白质分子，必须先进行拆分。须先进行拆分。 几条多肽链借助几条多肽链借助非共价键非共价键连接在一连接在一起，称为寡聚蛋白质；可用起，称为寡聚蛋白质；可用8mol/L8mol/L尿素尿素或或6mol/L6mol/L盐酸胍盐酸胍或高浓度的盐或高浓度的盐处理，即处理，即可使寡聚蛋白质中的亚基拆开可使寡聚蛋白质中的亚基拆开. . 如果多肽链间通过如果多肽链间通过共价键共价键（S-SS-S）连接在一起，可采用连接在一起，可采用氧化剂或还原剂氧化剂或还原剂将将其断裂。其断裂。(一) 多肽链的拆分多肽链的拆分(二) 测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过通过测定末端氨基酸残基的摩尔
4、数与测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽，即可确定多肽链的数目。链的数目。(三) 二硫键的断裂二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起，几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在可在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的 - -巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫键还处理，使二硫键还原为巯基，然后用原为巯基，然后用烷基化试剂烷基化试剂保护生成保护生成的巯基的巯基，以防止它重新被氧化。，以防止它重新被氧化。作用：作用：这些反应可用于巯基的保护这些反应可用于巯基的保护。巯基（巯基（-SH-SH
5、）的保护）的保护苄氧（苯甲氧）甲酰氯苄氧（苯甲氧）甲酰氯碘乙酰胺碘乙酰胺( (4 4) )测测定定每每条条多多肽肽链链的的氨氨基基酸酸组组成成，并并计计算算出出氨氨基基酸酸成成分分的的分分子子比比( (五五) )分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端。末端。N N末端：末端：1、Sanger法法2、Edman法法3、DNS-Cl法法4、酶降解法酶降解法C C末端末端：1 1、肼解法、肼解法2 2、酶降解法、酶降解法3 3、硼氢化锂法、硼氢化锂法n在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。( (五五) )分析多肽
6、链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端nSangerSanger法法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链能够与肽链N-N-端的游离氨基作用，生成端的游离氨基作用，生成黄色黄色二硝基苯衍生物（二硝基苯衍生物（DNP-DNP-氨基酸）氨基酸）。 二硝基氟苯二硝基氟苯（DNFBDNFB）法法（黄色）（黄色）弱碱弱碱N N末端：末端： Edman Edman 降解法降解法(I)(I) PITCPITC（pH8.3pH8.3）三氟乙酸三氟乙酸CHCH3 3NONO2 2Edman Edman 降解法降解法(II)(II)nPITC法可用来连续测定出法
7、可用来连续测定出60个以上的氨个以上的氨基酸顺序。基酸顺序。 Edman降解法降解法(I) 丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法）法 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨基酸的端氨基酸的游离氨基游离氨基作用，得到丹磺酰作用，得到丹磺酰- -氨基酸。氨基酸。 此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰- -氨基酸有很强的荧光性质，检测氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。n丹磺酰氯主要与氨基（包括丹磺酰氯主要与氨基（包括Lys的的-氨氨基基）反应。蛋白质除含有）反应。蛋白质除
8、含有N-末端的末端的-氨氨基外，在它的序列中可能含有一个或几基外，在它的序列中可能含有一个或几个个Lys残基。残基。n为什么某多肽链用丹磺酰氯处理后，继为什么某多肽链用丹磺酰氯处理后，继之用酸水解可产生几种丹磺酰氨基酸？之用酸水解可产生几种丹磺酰氨基酸？n氨肽酶是一种肽链外切酶，氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的它能从多肽链的N-N-端逐端逐个地向里水解。个地向里水解。n根据不同的反应时间测出根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而量作动力学曲线，从而知道蛋白质的知道蛋
9、白质的N-N-末端残末端残基顺序。基顺序。 氨肽酶法氨肽酶法 AlaAlaValValGlyGlyn多肽与肼在无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即端氨基酸即从肽链上解离出来从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼其余的氨基酸则变成肼化物化物。肼化物能够与。肼化物能够与苯甲醛苯甲醛缩合成不溶于水缩合成不溶于水的物质而与的物质而与C-C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。 肼解法肼解法 100100C-C-末端末端 n n肼解肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏不易测出，胱氨酸等被破坏不易测出，C-末端的精末端的精氨酸转变为鸟氨酸。氨酸转变
10、为鸟氨酸。 肼解法肼解法 n羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端端逐个的水解逐个的水解。根据不同的反应时间测出。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。n目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,A,B,C C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。 羧肽酶法羧肽酶法 4 4种羧肽酶的来源和专一性种羧肽酶的来源和专一性 羧肽酶羧肽酶来源来源专一
11、性专一性CpA胰脏胰脏能能释释放放除除pro、Arg和和Lys以外的所有以外的所有C端氨基酸端氨基酸CpB胰脏胰脏主主要要水水解解C端端为为Arg或或Lys的肽键的肽键CpC植物或微植物或微生物生物相相当当广广泛泛，几几乎乎能能释释放放C端的所有氨基酸端的所有氨基酸CpY面包酵母面包酵母可释放可释放C端所有氨基酸端所有氨基酸 多肽多肽C-C-端氨基酸可被端氨基酸可被硼氢化锂硼氢化锂还原成还原成-氨基醇氨基醇，用层析法可以鉴定氨基酸，用层析法可以鉴定氨基酸种类。种类。 Sanger Sanger早期测定胰岛素早期测定胰岛素C-C-末端氨基末端氨基酸采用此法。酸采用此法。 硼氢化锂硼氢化锂（LiB
12、HLiBH4 4）还原法还原法 硼氢化锂硼氢化锂（LiBH4LiBH4）还原法还原法( (六六) ) 多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段 可采用可采用两种或多种不同两种或多种不同的断裂方法将的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。并对每一肽段进片，并将其分离开来。并对每一肽段进行氨基酸组成和末端残基的分析行氨基酸组成和末端残基的分析多肽链的多肽链的选择性降解选择性降解 酶解法酶解法: : 胰蛋白酶胰蛋白酶：得到以：得到以ArgArg和和LysLys为为C-C-末端末端的肽段，的肽段，产生的肽段数一般等于产生的肽段数一般等于Arg
13、Arg和和LysLys总数加总数加1 1 酶解法酶解法: :糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）专一性水解专一性水解芳香族氨基酸羧基端芳香族氨基酸羧基端形成的肽形成的肽键，若羧基端与键，若羧基端与Pro相连，则不被水解相连，则不被水解多肽链的多肽链的选择性降解选择性降解 酶解法酶解法: :酸性磷酸酶酸性磷酸酶多肽链的多肽链的选择性降解选择性降解 酶解法酶解法: : 弹性蛋白酶弹性蛋白酶多肽链的多肽链的选择性降解选择性降解 化学法化学法：溴化氰溴化氰(CNBr)(CNBr)水解法，它能水解法，它能选择性地切割由选择性地切割由甲硫氨酸的羧基甲硫氨酸的羧基所形成所形成的肽键。的肽键。多肽
14、链的多肽链的选择性降解选择性降解 化学法：化学法： 羟胺断裂法，羟胺断裂法，NHNH2 2OHOH在在pH9pH9下能专一性地下能专一性地断裂断裂Asn-Gly之间的肽键，但专一性不之间的肽键，但专一性不很强，很强，Asn-LeuAsn-Leu、Asn-AlaAsn-Ala键也能部分水键也能部分水解。解。多肽链的多肽链的选择性降解选择性降解ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE*A,*A+B, *A+B+C+D+E*A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论结论：A B C D EDNDNF F F FB B完全水解完全水解完全水解
15、完全水解部分水解部分水解部分水解部分水解( (七七) )测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。( (八八) )确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的此间的交错重叠交错重叠，拼凑出拼凑出整条多肽链的氨整条多肽链的氨基酸顺序。基酸顺序。n重叠法重叠法 多肽多肽 氨基酸序列氨基酸序列( (九九) )确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置确定二硫键的位置一般采用确定二硫键的位置一般采用胃蛋白酶胃蛋白酶水水解原来的含二硫键的蛋白质。解原来的含二硫键的蛋白质。选用胃蛋白酶水解的好处？选用胃蛋白酶水
16、解的好处？该酶的专一性比较低，切点多，生成的该酶的专一性比较低，切点多，生成的肽段包括含有二硫键的肽段比较小，肽段包括含有二硫键的肽段比较小，对后面的分离、鉴定比较容易；该酶对后面的分离、鉴定比较容易；该酶的作用的作用pHpH在酸性范围，有利于防止二在酸性范围，有利于防止二硫键发生交换而造成的麻烦。硫键发生交换而造成的麻烦。方法方法-对角线电泳对角线电泳n把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在在pH6.5的条件下，进行第一次电泳，的条件下，进行第一次电泳，肽段将按其大小及电荷的不同分离开来；肽段将按其大小及电荷的不同分离开来；n把滤纸暴露在把滤纸暴露在过甲酸蒸汽
17、过甲酸蒸汽中，使中，使S-S断裂。断裂。每个含二硫键的肽段被氧化成一对含磺每个含二硫键的肽段被氧化成一对含磺基丙氨酸的肽；基丙氨酸的肽；n滤纸旋转滤纸旋转90角在与第一次完全相同的条角在与第一次完全相同的条件下进行第二次电泳。件下进行第二次电泳。二硫键位置的确定二硫键位置的确定 对角线电泳分离对角线电泳分离 结果：结果：大多数肽段大多数肽段的迁移率未变，的迁移率未变，并将位于滤纸的并将位于滤纸的一条对角线上。一条对角线上。含磺基丙氨酸的含磺基丙氨酸的成对肽段比原来成对肽段比原来含二硫键的肽小含二硫键的肽小而负电荷增加，而负电荷增加，偏离了对角线。偏离了对角线。 a.Sanger的双脱氧链终止法
18、的双脱氧链终止法FrederickSanger在在1977年发明用年发明用双脱氧链终止法测定单链双脱氧链终止法测定单链DNA的序列的序列-双脱双脱氧末端终止法（氧末端终止法（分析用酶法合成的互补链分析用酶法合成的互补链）。bMaxam-Gilbert化学修饰法化学修饰法(哈佛大学哈佛大学)AlanMaxam和和WalterGilbert发明的发明的-化学化学修饰法（化学化学修饰法（分析待序的分析待序的DNADNA链链）. .cDNA序列分析自动化序列分析自动化DNADNA序列分析序列分析1.双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法：DNA聚合酶聚合酶能够用单链能够用单链DNA作为模板，合作为模板，合成
19、准确的成准确的DNA互补链互补链；该酶能够用该酶能够用2，3-双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸作作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末末端，从而终止其延伸反应。端，从而终止其延伸反应。1.双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法：在在DNA测序反应中，测序反应中，(1)加入模板加入模板DNA，(2)引物（特异性引物，如引物（特异性引物，如T7，M13等），等），(3)DNA聚合酶，聚合酶，(4)dA，dT，dG，dC和一种和一种ddNTP。常用常用Klenow大片段，无大片段，无53外切酶活性。外切酶活性。双脱氧核苷酸末端终止法双脱氧核苷酸末端终止法特点特点是在是在
20、PCR PCR 反应中反应中加入加入 2 2，3-3-二脱氧核苷三磷酸（二脱氧核苷三磷酸（ddNTPddNTP）。OHHHOCH2OHHO12345碱基碱基PO2 3二脱氧核苷酸二脱氧核苷酸, 由于双脱氧的由于双脱氧的 ddNTP 比正常的比正常的 dNTP 少少了了3-羟基，当它在羟基，当它在 DNA 聚合酶作用下掺入到聚合酶作用下掺入到正在延伸的正在延伸的 DNA 链时，因链时，因 ddNTP 不含不含 3 -羟羟基，于是就阻止了其它基，于是就阻止了其它 dNTP 的继续掺入，的继续掺入，起了起了特异性终止剂特异性终止剂的作用的作用。（1）将被测将被测 DNA 制成单链模板，分别加入制成单
21、链模板，分别加入 4 个反应管中；个反应管中；（2）在每个管中加入引物、缓冲液、）在每个管中加入引物、缓冲液、DNA 聚聚合酶合酶 和和 4 种种 dNTP（其中一种为（其中一种为32P标记）；标记）；（3）在）在 1、2、3、4 个管中分别加入个管中分别加入 ddTTP、ddCTP、ddGTP 和和 ddATP* ，然后进行保温，然后进行保温反应。反应。Sanger Sanger 法的程序法的程序 dATP+ddATPdGTP+ddGTPdCTP+ddCTPdTTPdTTP+ddTTPdCTPdGTPdATPdATPdCTPdTTPdTTPdGTPdATPdCTPdGTP1234-ATCGT
22、ddT-ATCGddT-AddT-ATddC-ATCGTTddG-ATCddG-ATCGTTGddA-ddA35TAGCAACT5模板引物双双脱脱氧氧法法原原理理示示意意图图管管管管引物延长和合成阻断电泳后的放射自显影直读图产物按长短排列：AGTTGCTA35 -ATCGTTGddA-ATCGTTddG-ATCGTddT-ATCGddT-ATCddG-ATddC-AddT-ddATGCAATCGTTGA荧光标记b.Maxam-Gilbert化学修饰法化学修饰法 该方法的基本原理是用化学试剂处理该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的具有末端放射性标记的DNADNA片段，造成碱基片段
23、，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNADNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测显影之后，可直接读出待测DNADNA片段的核苷片段的核苷酸序列。酸序列。 DNADNA序列分析序列分析该反应的关键在于使该反应的关键在于使DNA的的4种核苷酸中，种核苷酸中，只有只有1-2种发生特异性的化学切割反应：种发生特异性的化学切割反应：碱基的特异性修饰；碱基的特异性修饰；被修饰的碱基从核糖环上转移；被修饰的碱基从核糖环上转移；失去碱基的糖环部位发生失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。链断裂。专门用来对核
24、苷酸作化学修饰，并打断专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和和肼肼(hydrazine)。DNADNA序列分析序列分析硫酸二甲酯硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使是碱性化学试剂，能使DNA链中链中鸟嘌呤的鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的和腺嘌呤的N6位发位发生甲基化，在中性生甲基化，在中性PHPH环境中就能使糖苷键环境中就能使糖苷键发生水解，并引起发生水解，并引起DNA链的断裂链的断裂。肼肼在碱性条件下，能特异性切割在碱性条件下，能特异性切割C和和T。如果加入如果加入1mol/L的的NaCl，那么，只有那么，只有C被特异性切割。被特异性切割。 DNADNA序列分析序列分析p经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量pStudyConstantly,AndYouWillKnowEverything.TheMoreYouKnow,TheMorePowerfulYouWillBe写在最后谢谢你的到来学习并没有结束，希望大家继续努力Learning Is Not Over. I Hope You Will Continue To Work Hard演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
