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1、植物细胞植物细胞胞吞作用胞吞作用和和内膜系统内膜系统 的荧光显微观察的荧光显微观察内吞与内膜系统课件植物细胞的吞排作用植物细胞的吞排作用细胞伸长生长所需要的物质分别在细胞伸长生长所需要的物质分别在内质网内质网(如蛋白质、脂类如蛋白质、脂类)和和高尔基体高尔基体(细胞壁的一些组分，如果胶、半纤维素细胞壁的一些组分，如果胶、半纤维素)合成，合成，运输小泡运输小泡胞吐作用分泌至胞外或质膜上胞吐作用分泌至胞外或质膜上，促进，促进新的细新的细胞膜胞膜和和细胞壁细胞壁的生长的生长n另一方面，在细胞扩展增长过程中一些另一方面，在细胞扩展增长过程中一些过剩的蛋白质、多过剩的蛋白质、多糖、细胞壁前体物质糖、细胞
2、壁前体物质等细胞成分，需要通过等细胞成分，需要通过胞吞作用胞吞作用重重新回到胞质中使之得以新回到胞质中使之得以及时回收，循环利用及时回收，循环利用， 即细胞的内吞和外排两个过程保持基本的相对平衡即细胞的内吞和外排两个过程保持基本的相对平衡n在整个膜泡吞排作用（在整个膜泡吞排作用（cytosis）中，必须有）中，必须有能量能量的保的保证。证。例如，例如，膜泡组装形成过程中膜泡组装形成过程中的小的小G蛋白，蛋白，运输过程运输过程中的中的细胞骨架及相应的马达蛋白，以及细胞骨架及相应的马达蛋白，以及膜融合过程膜融合过程中中Rab蛋白等均蛋白等均发生发生GTP或或ATP的水解反应。的水解反应。内吞与内膜
3、系统课件内膜系统内膜系统(endomembrane systems) 内膜系统是指内膜系统是指内质网内质网、高尔基体高尔基体、囊泡囊泡、溶酶体溶酶体和和液液泡泡等细胞器。这些等细胞器。这些细胞器的膜是相互细胞器的膜是相互流动的流动的, 处于动态处于动态平衡平衡, 在功能上也在功能上也是相互协同的。是相互协同的。内吞与内膜系统课件FM类染料类染料 nFM类染料是水溶性的苯乙烯类复合物，对细胞无毒性作用，类染料是水溶性的苯乙烯类复合物，对细胞无毒性作用，使用方便使用方便n常广泛用于质膜和囊泡等的各类研究常用的染料有常广泛用于质膜和囊泡等的各类研究常用的染料有FM1-43（Ex510/Em626）和
4、）和FM4-64（Ex558/Em734）。）。nFM类染料与类染料与质膜质膜及及内膜细胞器内膜细胞器特异结合后发出高强度的荧特异结合后发出高强度的荧光，需要借助光，需要借助胞吞作用胞吞作用才能进入细胞内。才能进入细胞内。nFM4-64在水相中没有荧光在水相中没有荧光，只有插入脂质生物膜后才显示，只有插入脂质生物膜后才显示较强的荧光，胞吞回收的囊泡因吞进细胞内部而被荧光标记，较强的荧光，胞吞回收的囊泡因吞进细胞内部而被荧光标记，利用这种荧光探针能够对细胞的胞吞过程进行有效标记。利用这种荧光探针能够对细胞的胞吞过程进行有效标记。内吞与内膜系统课件FM类染料染色原理类染料染色原理内吞与内膜系统课件
5、一、材料、试剂一、材料、试剂1.材料：材料： 烟草悬浮细胞烟草悬浮细胞 2.试剂：试剂： 1）烟草悬浮细胞培养基）烟草悬浮细胞培养基 2）FM4-64 （膜染料）（膜染料） 3）叠氮化钠）叠氮化钠 4）山梨醇）山梨醇 5）ER Tracker-Blue/White (内质网的特异染料内质网的特异染料) 内吞与内膜系统课件二、实验步骤二、实验步骤a)取取3个共聚焦专用培养皿，分别编号个共聚焦专用培养皿，分别编号、；b)往往中加入中加入198 L 含含BY2细胞培养液（细胞培养液（1000mL移液器）移液器）和和2 L FM4-64；c)往往中加入中加入178 L含含BY2细胞培养液（细胞培养液（
6、1000mL移液器）移液器）和和20 L山梨醇山梨醇；d)往往中加入中加入194 L含含BY2细胞培养液（细胞培养液（1000mL移液器）移液器）和和4 L NaN3；内吞与内膜系统课件e)置显微镜下观察置显微镜下观察中的荧光分布模式；中的荧光分布模式；f)观察完毕观察完毕中的中的FM4-64后再往后再往中加入中加入4 L ER Blue/white；g)往往、中分布加入中分布加入2 L FM4-64，随后先观察，随后先观察中的荧中的荧光分布；光分布；h)接着再观察接着再观察中的荧光分布模式；中的荧光分布模式；i)最后再次观察最后再次观察中中FM4-64、ER-Blue/White双染下的荧双
7、染下的荧光分布。光分布。内吞与内膜系统课件内膜系内膜系统及内吞作用的及内吞作用的荧光光标记观察察取取3个共聚焦专用培养皿，分别编号个共聚焦专用培养皿，分别编号、；往往中加入中加入178 L含含BY2细胞培养液（细胞培养液（1000mL移液器）和移液器）和20 L山梨醇；山梨醇；往往中加入中加入194 L含含BY2细胞培养液（细胞培养液（1000mL移液器）和移液器）和4 L NaN3；往往中加入中加入198 L 含含BY2细胞培养液（细胞培养液（1000mL移液器）和移液器）和2 L FM4-64；置显微镜下观察置显微镜下观察中的荧光分布模式；中的荧光分布模式；观察完毕观察完毕中的中的FM4-
8、64后再往后再往中加入中加入4 L ER Blue/white；往往、中分布加入中分布加入2 L FM4-64，随后先观察，随后先观察中的荧光分布；中的荧光分布；接着再观察接着再观察中的荧光分布模式；中的荧光分布模式；最后再次观察最后再次观察中中FM4-64、ER-Blue/White双染下的荧光分布。双染下的荧光分布。内吞与内膜系统课件三、结果与分析三、结果与分析内吞与内膜系统课件正常正常BY2 的的FM4-64标记标记 FM4-64先标记于先标记于BY2外周，并随着时间的延长外周，并随着时间的延长逐渐进入细胞内部。逐渐进入细胞内部。内吞与内膜系统课件叠氮化钠叠氮化钠处理的的处理的的BY2
9、的的FM4-64标记标记 叠氮化钠能抑制叠氮化钠能抑制BY2的的呼吸作用呼吸作用，进而抑制细胞的，进而抑制细胞的内吞内吞作用作用，导致，导致FM4-64不会进入不会进入BY2内部，说明内部，说明FM4-64是通过是通过内吞作用内吞作用而不是而不是扩散扩散进入进入BY2的。的。内吞与内膜系统课件质壁分离质壁分离的的BY2 的的FM4-64标记标记 用山梨醇处理用山梨醇处理BY2 2-3分钟，使分钟，使BY2发生质壁分发生质壁分离，证明离，证明FM4-64是一种是一种膜膜染料。染料。 内吞与内膜系统课件ER tracker-Blue/white和和FM4-64双标记双标记 细胞膜显示红色，而一部分细胞器显示紫色（红色细胞膜显示红色，而一部分细胞器显示紫色（红色蓝色叠加）表明内吞的蓝色叠加）表明内吞的FM染料部分进入内质网。染料部分进入内质网。 内吞与内膜系统课件实验报告告1）FM4-64染料可以染料可以进行什么生理行什么生理过程及程及细胞胞器的器的标记？2）你在）你在实验过程中看到的程中看到的FM4-64/山梨醇山梨醇预处理及叠氮化理及叠氮化钠预处理后再染色的理后再染色的实验现象象有何不同，有何不同，为什么？什么？内吞与内膜系统课件
