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1、血清碱性磷酸酶活力测定血清碱性磷酸酶活力测定( (磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法) )n n酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反响的酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反响的才干。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学才干。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。速度表示。n n 酶催化反响速度越快，酶活力升高，反之活力酶催化反响速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。愈低。n n n n 底物减少量或生成物添加量底物减少量或生成物添加量n n酶促反响速度酶促反响速度= =n n 单位时间单位时间n n酶酶的活力的活力单单位位n n国国际单际单位：位：KatalKatal，1s1s转转化化
2、1mol1mol底物的底物的酶酶量量n n临临床表示：床表示：KingsKings，如血清谷丙，如血清谷丙转转氨氨酶酶活力活力单单位，位，每每100ml100ml血清在血清在3737。pH=7.4pH=7.4的条件下与底物作的条件下与底物作用用60min60min，生成，生成1mol1mol丙丙酮酮酸所需的酸所需的酶酶量量为为1 1个活力个活力单单位位n n酶酶的比活力：的比活力：单单位位质质量量酶酶蛋白或蛋白或单单位体位体积酶积酶制制剂剂所所含有含有酶酶活力活力单单位数，即位数，即酶酶活力活力浓浓度。度。n n酶酶活力的活力的测测定方法定方法n n 1. 1.终终止止测测定法定定法定时时法或
3、法或终终点法点法n n 2. 2.动动力学分析法延力学分析法延续监测续监测法或速率法法或速率法实验目的n n熟习酶活性测定方法的普通原理n n掌握血清ALP测定原理与临床意义实验原理n n碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-4-氨基氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化构成红色醌类化安替比林作用，经铁氰化钾氧化构成红色醌类化合物，其颜色深浅与合物，其颜色深浅与ALPALP活性成正比。活性成正比。n n磷酸苯二钠磷酸苯二钠+H2O +H2O 苯酚苯酚+ +磷酸氢二钠磷酸氢二钠n
4、n苯酚苯酚+4-+4-氨基安替比林氨基安替比林 红色醌亚胺衍生红色醌亚胺衍生物物ALPpH=10铁氰化钾实验器材和试剂：n n 一一 器材：器材：5ml5ml移液管，移液管，1ml1ml移液管，移液管，100100或或200ul200ul微量可微量可调调式移液器，式移液器，721E721E分光光度分光光度计计，1cm1cm比色皿，比色皿，3737 恒温水浴恒温水浴n n 二二 试剂试剂：n n 1 10.1mol/L0.1mol/L碳酸碳酸盐缓盐缓冲液冲液(pH10.0) (pH10.0) 称取无水碳酸称取无水碳酸钠钠6.36g6.36g，碳酸，碳酸氢钠氢钠3.36g3.36g，4-4-氨基安
5、替比林氨基安替比林1.5g1.5g，溶于，溶于800mL800mL蒸蒸馏馏水中，定容至水中，定容至1L1L。置棕色瓶中保管。置棕色瓶中保管。n n 2 220mmol/L20mmol/L磷酸苯二磷酸苯二钠钠溶液溶液 先将先将500ml500ml蒸蒸馏馏水煮沸，水煮沸，迅速参与磷酸苯二迅速参与磷酸苯二钠钠2.18g(2.18g(磷酸苯二磷酸苯二钠钠如含如含2 2分子分子结结晶水，晶水，那么那么应应称取称取2.54g) 2.54g) ，冷却后加，冷却后加氯氯仿仿2ml2ml防腐，在防腐，在4 4冰箱保冰箱保管。管。 用剩的溶液不用剩的溶液不应应再倒回瓶中再倒回瓶中 n n 3 3铁氰铁氰化化钾钾的
6、硼酸溶液的硼酸溶液 称取称取铁氰铁氰化化钾钾2.5g2.5g，硼酸，硼酸17g17g，各自溶于蒸，各自溶于蒸馏馏水水400ml400ml中，两液混合后，加蒸中，两液混合后，加蒸馏馏水至水至1L1L，置棕色瓶中避光保管，置棕色瓶中避光保管( (如出如出现蓝绿现蓝绿色即弃去色即弃去) )。n n 4 4酚酚规规范任范任务务液液 0. 05mg/ml0. 05mg/ml ：购买购买合格的二合格的二级规级规范范品。品。实验操作1.1.取试管取试管4 4支，按下表操作支，按下表操作测定管测定管规范管规范管空白管空白管对看管对看管血清血清mlml0.1000.100酚规范液酚规范液0.1000.100蒸馏
7、水蒸馏水0.1000.100pH10pH10碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液1.001.001.001.001.001.001.001.00混匀，混匀，3737水浴保温水浴保温5min5min，同时将底物预热，同时将底物预热底物液底物液1.001.001.001.001.001.001.001.00混匀，混匀，3737水浴维护水浴维护15min15min铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液3.003.003.003.003.003.003.003.00血清血清0.1000.1002.立刻混匀。在510nm波优点比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。n n计算n n ALP活性=A测定A对照/A规范A空白*0.05
8、*100(金氏单位临床意义：血清中血清中ALPALP活力活力测测定在定在临临床常作床常作为为肝胆疾病和骨骼疾病的肝胆疾病和骨骼疾病的临临床床辅辅助助诊诊断目的。断目的。 1 1血清血清ALPALP活性升高能活性升高能够缘够缘由如下由如下 ：肝胆疾病：阻塞性黄肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨骼疾病：由于骨的骨的损伤损伤或疾病使成骨或疾病使成骨细细胞内所含高胞内所含高浓浓度的度的ALPALP释释放放进进入血入血液中，引起血清液中，引起血清ALPALP活性增高，如活性增高，如纤维纤维性骨炎、成骨不全症、性骨炎、成骨不全症、佝佝偻偻
9、病、骨病、骨软软化病、骨化病、骨转转移癌和骨折修复愈合期等。移癌和骨折修复愈合期等。2 2血清血清ALPALP活性降低比活性降低比较较少少见见： 主要主要见见于呆小病、重症慢于呆小病、重症慢性性肾肾炎、乳糜泻、炎、乳糜泻、贫贫血、血、恶恶病病质质等。等。本卷须知1.1.目前市售的酚规范液多数为安瓿瓶，开后不能目前市售的酚规范液多数为安瓿瓶，开后不能久置久置2.2.底物液中不应含有酚，如空白管显红色，阐明底物液中不应含有酚，如空白管显红色，阐明磷酸苯二钠已分解，不宜运用。磷酸苯二钠已分解，不宜运用。3.3.参与铁氰化钾后必需迅速混匀，否那么对实验参与铁氰化钾后必需迅速混匀，否那么对实验结果会有影
10、响。结果会有影响。规范曲线法n n制制备备如下：如下： 取取试试管管6 6支，分支，分别别加酚加酚规规范液范液(1ml=0(1ml=01mg)1mg)，0 0、0.050.05、0.10.1、0.20.2、0.30.3、0.4ml0.4ml，各管，各管依次加复合基依次加复合基质质液液3.13.1、3.053.05、3.03.0、2.92.9、2.82.8、2.7ml2.7ml。混匀后。混匀后3737水浴保温水浴保温5 5分分钟钟，各管参与，各管参与1.0ml1.0ml碱性溶液，再加碱性溶液，再加0.50.5铁氰铁氰化化钾钾2.0ml2.0ml，立刻，立刻混匀。静置混匀。静置1010分分钟钟，510nm510nm波波长长下比色。将以上下比色。将以上各管所得各管所得读读数与其相数与其相应应的碱性磷酸的碱性磷酸酶单酶单位位( (依次依次为为0.50.5、1010、2020、3030、4040单单位位) )在坐在坐标纸标纸上作上作图图，绘绘制成制成规规范曲范曲线线。
