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1、DIGE实验步骤 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16631DIGE实验步骤一、DIGE实验原理及流程二、DIGE双向电泳样本制备三、DIGE双向电泳样本标记四、第一向电泳IEF电泳五、胶条平衡五、第二向电泳SDS-PAGE电泳六、图片扫描七、DIGE荧光图片分析 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16632一、DIGE实验原理DIGE 双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)，是在传统双向电泳的基础上发展而来的
2、新型蛋白质组学定量技术，其分离蛋白质混合的原理与双向电泳是一致的，主要利用蛋白质的等电点和分子量的差异来分离蛋白质混合物，同时应用荧光染料的灵敏度及内标的使用等技术，使其在定量蛋白质组学的研究中效果明显优于传统双向电泳。DIGE使用的荧光染料有Cy2, Cy3和Cy5，它们能与蛋白质的赖氨酸侧链氨基反应而使蛋白质被标记，被标记蛋白质的等电点和分子量几乎不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，不同凝胶之间可以通过cy2内标匹配，消除凝胶之间的差异，蛋白质表达量的变化则通过cy3和cy5不同荧光的强度来体现。 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16633一、
3、DIGE实验流程图（最小标记法） DIGE荧光定量方法流程图. 1、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有实验组与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。2、蛋白质分离：等量混合三种荧光素标记后的蛋白质，2D-PAGE电泳分离，荧光显色。3、蛋白质定量分析：ImageMaster 7.0（DIGE)分析同一蛋白质不同处理后的表达量变化。4二、二、DIGE双向电泳样本制备双向电泳样本制备动物样本动物样本 （1 1）将组织切细后置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可。 （2 2）在研钵中加入800LB（使用前加入1
4、 PMSF），充分溶解（收集）粉末后转移至1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。 （3 3）超声处理，破碎核酸。每个EP管超声3次，每次58下，然后进行离心，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。 （4 4）将上清液分装成3管，每管约250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀过夜。沉淀完的蛋白质于4，12000r/min，离心20min，倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。 (5) (5)在干燥后的蛋白质团块中加入200uL LB，用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质充分分散。超声助溶，8
5、0W，0.8秒开，0.8秒关，超声4下后放于冰上冷却，再重复1次，超声后4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。纯化好的蛋白质团块需用LB（pH8.5）溶解，如果溶解后PH不是8.5，需调节PH值。 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16635二、二、DIGE双向电泳样本制备双向电泳样本制备植物样本植物样本 （1 1）植物样本置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可，在研钵中加入一小勺PVPP（用于吸附植物组织破碎后释放出的酚类物质），用药勺将粉末转移至50mL离心管中。 （2 2）在50mL离
6、心管中加入8mL提取液混匀，再加入8mLTris饱和酚，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，45000r/min，离30min，此时溶液会分层，下层为水相，上层为酚相，吸出上层液体，转移到15mL离心管中。 （3 3）加入与酚相同体积的提取液，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4，5000r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移至新的15mL离心管中。重复一次苯酚抽提。 （4 4）加入最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀，充分振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-20沉淀过夜。 （5 5）对沉淀过夜的蛋白质4，5000
7、r/min，离心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次。 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16636（6 6）加入4mL丙酮对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次操作。加入3mL丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min。倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。 (7) (7)在干燥后的蛋白质团块中加入200uL LB，用枪头将蛋白质团块戳小
8、后反复吹打直至蛋白质充分分散。超声助溶，80W，0.8秒开，0.8秒关，超声4下后放于冰上冷却，再重复1次，超声后4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。纯化好的蛋白质团块需用LB（pH8.5）溶解，如果溶解后PH不是8.5，需调节PH值。二、二、DIGE双向电泳样本制备双向电泳样本制备植物样本植物样本 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16637Alklysis buffer(LB)ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationTris20mMThiourea (FW
9、76.12)2MUrea (FW 60.06)7MCHAPs (FW 64.89)2%(W/V)Phenol extraction bufferReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationSucrose (FM 342.30）0.7MKCl（FM 74.55）0.1MEDTA（FM 292.25）50mMTris（FM 121.14）0.5MHClTo pH7.5醋酸醋酸铵甲醇溶液甲醇溶液Ammonium acetate in methanolAmmonium acetate in methanol用甲醇配制0.1M的醋酸铵二、二、D
10、IGE双向电泳样本制备双向电泳样本制备8三、DIGE双向电泳样本标记1: 1: 蛋白质定量蛋白质定量 一般使浓度需保证在5-10ug/ul。 2 2：染料溶解：染料溶解 DIGE试剂盒放于-20保存，染料使用前需于室温下复温10min以上，复完温后的染料10000r/min离心8min，加入相应量的DMF溶解，配制染料储液，使其浓度为1nmol/uL。用移液器吸取相应量的DMF，打到装染料的离心管管壁上，再离心将DMF甩至管底，震荡8min后离心即可。3 3：标记蛋白：标记蛋白 染料的工作液浓度为400pmol/uL，将储液和DMF按照1：1.5的比例混合即可配成工作液，标记时每50ug蛋白需
11、要使用400 pmol染料。吸取各个样本蛋白50ug至0.6mLEP管中，再分别吸取等量的各个样本2混合成一管（总量以为50ug)，实验组和对照组蛋白按照实验设计加入相应的Cy3和Cy5染料，每个样加入1uL染料，混合样本按照蛋白总量加入相应量的Cy2染料。 加入时先吸取所需的染料，打在各蛋白样本EP管的管壁上，统一离心甩至管底，然后统一震荡1min，立于冰上避光反应30min，Cy3和Cy5可分别作为一组进行操作，以保证各个样本有相同的标记时间。标记反应进行30min后各管加入1uL 10 mM Lysine，立于冰上10min，终止标记反应。 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热
12、线：400-699-16639四、第一向电泳IEF电泳1 1：IEFIEF上样蛋白质准备上样蛋白质准备 每根胶条的上样液的成分为：三管标记的蛋白质（cy2,cy3,cy5)、1%DTT、1%IPG Buffer、1溴酚蓝、LB调制最终体积至460L。将样品溶液混合均匀后，4 12000r/min，离心20min，吸取上清液450L进行泡胀。2 2：上样：上样 取出水化盘，在底下铺上白色纸巾（方便观察胶条泡胀情况），调节水平备用。从冰箱取出干胶条复温（如不复温胶条会吸潮）。吸取离心后的样品上清液加到水化盘的槽中，450L样液可分3枪加入，第一二枪每枪吸160L，从槽顶端开始，沿左右边缘加入，将样
13、液加成一条细线，长约22cm，第三枪吸至管中样液剩余20L左右即可，加至槽的顶端，将顶端部分覆盖满。调节室内温度为20，让胶条泡胀过夜（1012h），3 3：等点聚焦（：等点聚焦（IEF)IEF) 等点聚焦（IEF),等电聚焦程序为：S1 stp 300V 0:45Hr S2 stp 700V 0:45Hr S3 stp 1500V 1:30Hr S4 grd 9000V 3:00Hr S5 stp 9000V 4:00Hr 整个聚焦过程所用总电压：52KVh4 4：胶条保存：胶条保存 跑完等电聚焦以后，取出胶条，吸干表面的覆盖油，胶面朝上将胶条放入平衡管中，胶条应置于-20保存。如果需要运输
14、，则要用冰完全包埋平衡管保温。10五、胶条平衡五、胶条平衡1 1：作用：作用 DDT与IAA联合使用，还原蛋白质的巯基，SDS使蛋白质带上负电荷以利于第二向SDS-PAGE电泳。2 2：实验步骤：实验步骤 （1）：取出放置有胶条的平衡管，每管加入10mL左右去离子水洗掉胶条表面的覆盖油，去掉去离子水。 （2）：SDS平衡液加入100mM DTT混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液。 （3）：SDS平衡液加入250mM IAA混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液。 （4） SDS 平衡液： 50mM Tris-HCl (pH8.8)， 6M
15、 Urea (FW 60.06)，30%(v/v) Glycerol (87% v/v)，2% (w/v) SDS (FW 288.38)，0.002%(w/v) Bromophenol blue。 注：在进行IPG胶条平衡前，第二向凝胶必须准备好. 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-166311六、第二向电泳六、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳1 1、根据实验分离片段大小选择不同浓度的、根据实验分离片段大小选择不同浓度的PAGEPAGE胶：胶：2 2、配制、配制12.5%SDS-PAGE12.5%SDS-PAGE凝胶：凝胶：ReagentsR
16、eagentsVolumn of reagentsVolumn of reagents123456Monomer solution50.04 ml75.06 ml100.08 ml125.1 ml150.12 ml175.14 ml4 resolving gel buffer30ml45 ml60 ml75 ml90 ml105 ml10%SDS1.2ml1.8 ml2.4 ml3.0 ml3.6 ml4.2 mlDouble distilled water38.16ml57.24 ml76.32 ml95.4 ml114.48 ml133.56 ml10%ammonium persulfat
17、e600l900 l1.2 ml1500 l1800 l2.1 mlTEMED39.6l59.4 l79.2 l99 l118.8 l138.6 lTotal volumn120ml180 ml240 ml300 ml360 ml420 ml12五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳30%T,2.6%C Monomer stock solution：ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationAcylamide (FW 71.08)30%N,N-methylenebisacrylamide (FW 154
18、.17)0.8% 0.2m膜过滤，4保存4 Resolving gel buffer4 Resolving gel buffer：ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationTris-base (FW 121.1)1.5MHCl (FW 36.46)To pH8.8 0.2m膜过滤，4保存10% SDS：ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationSDS (FW 288.38)10%0.2m膜过滤，室温保存 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1
19、66313五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 3 3、灌胶：灌胶： 灌胶时使胶液沿着灌胶口斜面的厚塑料垫板流下，动作均匀，灌至液面到灌胶口平为止。迅速在胶面上加入水饱和正丁醇压平液面，加入时使枪头贴着玻璃长板缓慢划动均匀加入，当所有玻璃板加完2mL后，在玻璃板和灌胶器的缝隙处也各加入2mL使内外液面相平，然后再加正丁醇至没过短板为止。蒙上保鲜膜过夜。 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-166314 4: 4: 电泳电泳 （1）用1x电泳缓冲液配制1%的低熔点琼脂糖45mL，1%的普通琼脂糖80mL，加入溴酚蓝溶液至1X后放于泡沫
20、盒中备用，吸取低熔琼脂糖封住SDS-PAGE整个胶面。迅速从平衡管中取出胶条，在装上槽液的量筒中稍微涮洗一下，将胶条放入玻璃板中，酸性端朝左放置，用尺子把胶条压到二向胶胶面处，使胶条下端紧密接触二向胶胶面，注意不要让胶条下端困住气泡。 （2）依次放好胶条后将玻璃板装入下槽中，装玻璃板时可倾斜放入，避免玻璃板下端产生气泡。装好玻璃板后装上槽，然后在槽与玻璃板的缝隙处加入1%普通琼脂糖封住缝隙防止垂直方向上漏电。在上槽中轻轻地加入上槽液（2 x 电泳缓冲液）至最大刻度处，用上槽液稀释一倍配置成下槽液（1 x 电泳缓冲液），加入到下槽中直到上下槽液面相平，盖上盖子，接上电极后开始电泳。电泳条件为，
21、2W/gel 45min后改为17W/gel继续电泳，当BPB跑出二向胶以后可停止电泳。 10 SDS 电泳缓冲液，1% SDS，250mM Tris-base，1.92M Glycine。 300 X 溴酚蓝储存液，1% 溴酚蓝， 50mM Tris-base。五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-166315六、图片扫描使用Typhoon 9400(GE)进行扫描。 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-166316七、图片分析常用的常用的DIGEDIGE分析软件分析软件 1：ImageMaster 7.0 2：DeCyder 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-166317 辉骏生物：辉骏生物： 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663THANKS!18
