专题一-兽药的毒理学试验和安全性评价-课件PPT

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1、专题一专题一 兽药的毒理学试验和安全性评价兽药的毒理学试验和安全性评价一般毒性试验一般毒性试验: : 急性毒性试验急性毒性试验 亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验 长期毒性试验长期毒性试验 特殊毒性试验特殊毒性试验: : “三致三致”试验试验 致畸、致突变、致癌致畸、致突变、致癌2021/8/261第一节第一节 一般毒性试验一般毒性试验一、急性毒性试验一、急性毒性试验一、急性毒性试验一、急性毒性试验 (1) (1) (1) (1)经口或注射给药的急性毒性试验经口或注射给药的急性毒性试验经口或注射给药的急性毒性试验经口或注射给药的急性毒性试验 (2) (2) (2) (2)经皮给药的急性毒性试验经皮给

2、药的急性毒性试验经皮给药的急性毒性试验经皮给药的急性毒性试验目的：目的：目的：目的： （1 1 1 1）求出受试物的半数致死量（）求出受试物的半数致死量（）求出受试物的半数致死量（）求出受试物的半数致死量（LDLDLDLD50505050）。）。）。）。（2 2 2 2）阐阐阐阐明明明明受受受受试试试试物物物物急急急急性性性性毒毒毒毒性性性性的的的的剂剂剂剂量量量量- - - -反反反反应应应应关关关关系系系系与与与与中中中中毒毒毒毒特特特特征征征征，为为为为急急急急救治疗措施提供依据。救治疗措施提供依据。救治疗措施提供依据。救治疗措施提供依据。 （3 3 3 3）为受试物的毒性作出初步判断，

3、为其它毒性试验设计提）为受试物的毒性作出初步判断，为其它毒性试验设计提）为受试物的毒性作出初步判断，为其它毒性试验设计提）为受试物的毒性作出初步判断，为其它毒性试验设计提供依据。供依据。供依据。供依据。 2021/8/262经口或注射给药的急性毒性试验经口或注射给药的急性毒性试验1.1.动物动物 小鼠（体重小鼠（体重18182222g g）、）、大鼠（体重大鼠（体重180180200200g g）或其他敏感动物。应注明动物的品系。每组小鼠不或其他敏感动物。应注明动物的品系。每组小鼠不少于少于1010只、大鼠不少于只、大鼠不少于6 6只，雌雄各半，雌性应未只，雌雄各半，雌性应未产无孕。产无孕。2

4、.2.供试药物的配制供试药物的配制 一般用水为溶剂一般用水为溶剂, ,将药物配成一定浓度的溶液将药物配成一定浓度的溶液. .2021/8/263 3.3.给药方式与最大体积给药方式与最大体积 灌胃法灌胃法: : 一次最大一次最大灌胃灌胃量量 1.0ml/只只(小鼠小鼠) 4.0ml/只只(大鼠大鼠) 腹腔注射腹腔注射: 一次最大一次最大注射注射量量 1.0ml/只只(小鼠小鼠) 3.0ml/只只(大鼠大鼠) )4.4.剂量与分组剂量与分组 预试验预试验 全部致死的最小剂量全部致死的最小剂量LDLD100100和全部存和全部存 活的最大剂量活的最大剂量LDLD0 0 正式试验正式试验 5-7 5

5、-7个剂量组个剂量组, ,组间剂量呈等比级数组间剂量呈等比级数, , 其比值为其比值为1.2-1.41.2-1.4. .2021/8/264 5.5.观察指标观察指标 动物一般健康状况，中毒表现和死亡过程。动物一般健康状况，中毒表现和死亡过程。 时间：时间：7天。天。 死亡动物：大体剖检、病理组织学检查（必要时）死亡动物：大体剖检、病理组织学检查（必要时）6.LD50计算计算 寇氏法寇氏法 计算供试药的计算供试药的LD50值及其值及其95%可信限范围。可信限范围。7.结果判定结果判定 大鼠一次经口大鼠一次经口LD50在在1 mg/kg以下为极毒，以下为极毒，150 mg/kg为剧毒，为剧毒，5

6、0 500 mg/kg为中等毒，为中等毒，500 5000 mg/kg为低毒，为低毒，5000 mg/kg以上者为实际无毒。以上者为实际无毒。2021/8/265小鼠腹腔注射敌百虫小鼠腹腔注射敌百虫LD50计算表计算表 组别组别剂量剂量(mg/kg)对数剂量对数剂量(Xi)实验动实验动物数物数(ni)死亡动物死亡动物数数(ri)死亡率死亡率(pi)存活率存活率(q)13002.47711000123602.55631020.20.834322.63551050.50.545182.71431070.70.356222.793810101.00合计合计- ri24 Pi2.4 q2.62021/

7、8/266 计算计算LD50，代入下列公式：代入下列公式： lgLD50=Xk - d（ Pi 0.5) LD50 =Lg 1 Xk - d（ Pi 0.5)式中式中Xk 为最大对数剂量为最大对数剂量, Pi为死亡率的总和为死亡率的总和;d为相邻两组剂量比值的对数为相邻两组剂量比值的对数, d=lg1.2=0.0792则则: LD50 = Lg 1 2.7938-0.0792(2.4-0.5)= Lg 1 2.6433 =439.87(mg/kg)2021/8/267经皮给药的急性毒性试验经皮给药的急性毒性试验1.1.动物动物 选用健康选用健康家兔（家兔（2.03.0 kg）、）、豚鼠豚鼠(3

8、50450 g)或或大鼠大鼠(200300 g)，每组动物每组动物不少于不少于6 6只，雌雄各半。只，雌雄各半。2.2.供试药物的配制供试药物的配制 供试药物如是固体，应磨成细粉状，过供试药物如是固体，应磨成细粉状，过120目筛，并用目筛，并用适量水或无毒无刺激性赋型剂（橄榄油、羊毛脂、凡士适量水或无毒无刺激性赋型剂（橄榄油、羊毛脂、凡士林等）混匀。如为液体，一般不要稀释。林等）混匀。如为液体，一般不要稀释。2021/8/268 3.3.给药方式给药方式 脱去动物背部脊柱两侧毛发（不得损伤皮肤），脱毛脱去动物背部脊柱两侧毛发（不得损伤皮肤），脱毛后后2424小时检查皮肤，如无损伤才能进行试验。

9、将供试药小时检查皮肤，如无损伤才能进行试验。将供试药物均匀地涂敷于脱毛区，不应少于动物体表面积的物均匀地涂敷于脱毛区，不应少于动物体表面积的10%10%，用塑料纸和两层纱布覆盖，再用胶布或绷带固定，以防用塑料纸和两层纱布覆盖，再用胶布或绷带固定，以防脱落和动物舔食。敷药脱落和动物舔食。敷药2424小时。试验结束后，用温水或小时。试验结束后，用温水或适当溶剂清除残留供试药。适当溶剂清除残留供试药。大鼠可采用浸尾方法给药大鼠可采用浸尾方法给药。2021/8/269 4. 4.剂量与分组剂量与分组 正式试验前，用少量动物做预备试验，根据正式试验前，用少量动物做预备试验，根据2424小时内动物死亡情况

10、，估计小时内动物死亡情况，估计LDLD5050的可能范围，以的可能范围，以确定正式试验的剂量。一般分为确定正式试验的剂量。一般分为4 4个剂量组，组间个剂量组，组间剂量呈等比级数。其比值为：剂量呈等比级数。其比值为：1:1.5-3.01:1.5-3.0。若用赋。若用赋形剂，需设赋形剂对照组。形剂，需设赋形剂对照组。2021/8/26105.5.观察指标观察指标 观察动物的全身中毒表现和死亡情况，观察观察动物的全身中毒表现和死亡情况，观察时间为一周。若给药时间为一周。若给药4天后仍有动物死亡时，仍天后仍有动物死亡时，仍需继续观察一周，对死亡动物应做大体剖检，必需继续观察一周，对死亡动物应做大体剖

11、检，必要时进行病理组织学检查。要时进行病理组织学检查。2021/8/2611 6 . . 结果判定结果判定 兔涂皮兔涂皮LD50在在5 mg/kg以下为极毒，以下为极毒，544mg/kg为剧毒，为剧毒，44 350 mg/kg为中等毒，为中等毒，350 2180 mg/kg为低毒，为低毒，2180mg/kg以上者为以上者为实际无毒。实际无毒。2021/8/2612二、亚慢性毒性试验二、亚慢性毒性试验 确定外来化学物质在动物确定外来化学物质在动物1/101/10左右的生命时间左右的生命时间内，反复多次接触后有无引起损害的观测过程。内，反复多次接触后有无引起损害的观测过程。又称短期试验、亚又称短期

12、试验、亚急性毒性试验（急性毒性试验（急性毒性试验（急性毒性试验（Subchronic Subchronic Subchronic Subchronic toxicity testtoxicity testtoxicity testtoxicity test）。）。）。）。 目的：目的：目的：目的：1.1.1.1.毒性确定毒性确定毒性确定毒性确定 2. 2. 2. 2.靶器官靶器官靶器官靶器官 3. 3. 3. 3.慢性毒性试验依据慢性毒性试验依据慢性毒性试验依据慢性毒性试验依据2021/8/2613试验方法试验方法1.1.动物动物 一一般般选选用用大大鼠鼠(100(100200200g)g)或

13、或小小鼠鼠(15(152020g)g)。有有条条件件时时，采采用用供供试试药药物物的的靶靶动动物物鸡鸡等等。外外购购动物需饲养一周后才能供试验用。动物需饲养一周后才能供试验用。2021/8/26142.2.试验周期试验周期 临床用药期（天）临床用药期（天）毒性试验给药期（天）毒性试验给药期（天）1314728309030天以上天以上6个月个月2021/8/26153.3.给药方式给药方式 试验周期试验周期给药途径给药途径1414天天大鼠、小鼠大鼠、小鼠 灌胃灌胃 鸡鸡 药丸药丸2828天以上天以上混饲混饲 自由采食自由采食 饮水不限饮水不限2021/8/26164.4.剂量与分组剂量与分组 大

14、鼠大鼠 20 20只只/ /组，雌雄各半组，雌雄各半对照组对照组 低剂量组低剂量组 高于有效量，不出现毒性反应高于有效量，不出现毒性反应中剂量组中剂量组 高剂量组高剂量组 部分动物出现毒性反应或死亡部分动物出现毒性反应或死亡 但死亡数不超过但死亡数不超过20%20%2021/8/26175.5.观察指标观察指标 分六大项，具体指标为：分六大项，具体指标为：（1）健康状况）健康状况 每天每天（2）体重，饲料消耗）体重，饲料消耗 2-3次次/周周（3）血液学检查）血液学检查 定期定期 （4）血液生化学检查）血液生化学检查 定期定期（5）肝、肾绝对重量和脏器指数）肝、肾绝对重量和脏器指数 试验结束时

15、试验结束时（6）剖检、组织病理学检查）剖检、组织病理学检查 试验结束时试验结束时2021/8/26186.6.结果处理结果处理 试验数据试验数据 方差分析或方差分析或X X2 2 病理变化病理变化 照片照片 写出评价报告写出评价报告2021/8/2619三、长期毒性试验三、长期毒性试验1.概念概念 外来化学物质在动物生命期的大部分时间或外来化学物质在动物生命期的大部分时间或终生接触于机体时所引起的损害作用，称为长期终生接触于机体时所引起的损害作用，称为长期毒性作用或慢性毒性作用。毒性作用或慢性毒性作用。 确定外来化学物质这种慢性毒性作用的动物确定外来化学物质这种慢性毒性作用的动物试验观察方法，

16、称为长期毒性试验。试验观察方法，称为长期毒性试验。2021/8/26202.目的目的 观测长期反复摄入低剂量的受试物，可能对观测长期反复摄入低剂量的受试物，可能对机体造成的损害、严重程度、停药后的发展和恢机体造成的损害、严重程度、停药后的发展和恢复情况，为临床试验提供依据。复情况，为临床试验提供依据。3 . 试验方法试验方法（1）动物）动物 两种动物（啮齿类和非啮齿类），目前要求两种动物（啮齿类和非啮齿类），目前要求用一种啮齿类动物进行全面系统的试验。用一种啮齿类动物进行全面系统的试验。2021/8/2621 （2 2）剂量分组）剂量分组 试验组：试验组：45个，设高剂量组个，设高剂量组12个

17、，中剂量组个，中剂量组12个，低剂量组个，低剂量组12个。个。 以以LD50 的的1/10、1/50、1/100、1/1000剂量分组。剂量分组。 对照组：对照组：1 1个个（3 3）染毒方式）染毒方式混饲或饮水，由动物自由进食。或涂擦皮肤。混饲或饮水，由动物自由进食。或涂擦皮肤。2021/8/2622（4 4）观察指标）观察指标一般情况一般情况：健康、生长发育、进食量，特别是体重。：健康、生长发育、进食量，特别是体重。生物化学指标生物化学指标：肝、肾功能。：肝、肾功能。血液学变化血液学变化：Hb，WBC，RBC，病理学检查病理学检查 ： 病理解剖和病理组织学变化。病理解剖和病理组织学变化。（

18、5） 结果评价结果评价 参考亚急性毒性试验。参考亚急性毒性试验。2021/8/2623第二节第二节 特殊毒性试验特殊毒性试验致突变致突变致突变致突变: : : : 体外体外体外体外: : : :（1 1 1 1）艾母氏）艾母氏）艾母氏）艾母氏( ( ( (Ames)Ames)Ames)Ames)试验试验试验试验( ( ( (必做必做必做必做) ) ) ) （2 2 2 2）哺乳动物培养细胞染色体畸变（）哺乳动物培养细胞染色体畸变（）哺乳动物培养细胞染色体畸变（）哺乳动物培养细胞染色体畸变（CHOCHO、CHLCHL）选做选做选做选做 体内体内体内体内: : : :（3 3 3 3）微核试验）微

19、核试验）微核试验）微核试验( ( ( (必做必做必做必做) ) ) ) （4 4 4 4）精子畸形试验）精子畸形试验）精子畸形试验）精子畸形试验 选做选做选做选做 （5 5 5 5）小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验）小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验）小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验）小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验 选做选做选做选做 （6 6 6 6）显性致死试验）显性致死试验）显性致死试验）显性致死试验 若（若（若（若（4 4 4 4）、（）、（）、（）、（5 5 5 5）任一项为阳性，）任一项为阳性，）任一项为阳性，）任一项为阳性，必做（必做（必做（必做（6 6 6 6）2021/8/2624 致

20、畸致畸: :（1 1 1 1）传统致畸试验）传统致畸试验）传统致畸试验）传统致畸试验( ( ( (必做必做必做必做) ) ) ) 一般兽药必做一般兽药必做一般兽药必做一般兽药必做 （2 2 2 2）喂养繁殖毒性试验）喂养繁殖毒性试验）喂养繁殖毒性试验）喂养繁殖毒性试验（3 3 3 3）喂养致畸试验）喂养致畸试验）喂养致畸试验）喂养致畸试验 （2 2 2 2）、（）、（）、（）、（3 3 3 3）饲料药物添加剂必须增做）饲料药物添加剂必须增做）饲料药物添加剂必须增做）饲料药物添加剂必须增做2021/8/2625一、一、艾母氏艾母氏( (Ames)Ames)试验方法试验方法1.原理原理 组氨酸缺陷

21、型（即突变型）鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨组氨酸缺陷型（即突变型）鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培养，则可使突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成养，则可使突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成组氨酸的能力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长，组氨酸的能力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长，根据其生长菌落的数量判断受试物是否具有致突变性。根据其生长菌落的数量判断受试物是否具有致突变性。2021/8/2626 野生型（能合成组氨酸）野生型（能合成组氨酸） 缺乏组氨缺乏组氨酸的培养基酸的培养基加有致突变原

22、加有致突变原的培养基的培养基组氨酸缺陷型（即突变型）组氨酸缺陷型（即突变型）鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌。 。 。2021/8/2627 2.2.菌种菌种 组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、 TA100、TA102 四个标准株。四个标准株。3.剂量分组剂量分组 每次试验要求每次试验要求4-5个剂量组，每个剂量做三个平行平皿。个剂量组，每个剂量做三个平行平皿。高剂量以不抑菌为原则。高剂量以不抑菌为原则。 液态受试物：液态受试物：0.05-50 ul/平皿平皿 固态受试物：固态受试物：0.1-1000 ug/平皿，最高剂量可达平皿，最高剂量可达500

23、0 ug/平平 皿。皿。 选定后剂量的药物应配制成适当浓度选定后剂量的药物应配制成适当浓度 体积：体积：100ul或或200 ul/皿皿。2021/8/2628 4. 溶剂溶剂 水水 5. 对照物对照物 每次检测均需要每次检测均需要 阳性对照：已知的阳性药物阳性对照：已知的阳性药物 阴性对照：溶剂阴性对照：溶剂 加加S9混合液时要同时作不加混合液时要同时作不加S9混合液的对照平皿混合液的对照平皿6. S9混合液混合液 如果受试物可能是经动物体酶系统活化代谢后才具有如果受试物可能是经动物体酶系统活化代谢后才具有致突变作用，则试验过程需要在培养基上同时加入哺乳致突变作用，则试验过程需要在培养基上同

24、时加入哺乳动物的肝微粒体（动物的肝微粒体（S9混合液），使受试物被活化而呈现混合液），使受试物被活化而呈现致突变作用。致突变作用。 2021/8/2629 S9制备制备 选体重选体重200 g 左右成年雄性大鼠，经诱导剂诱左右成年雄性大鼠，经诱导剂诱导后宰杀（处死前导后宰杀（处死前12小时禁食）。在低温条件下，小时禁食）。在低温条件下，无菌操作取出肝脏，用无菌操作取出肝脏，用KCI液淋洗后置匀浆器中液淋洗后置匀浆器中制成匀浆。低温离心后分装，保存于液氮或制成匀浆。低温离心后分装，保存于液氮或 80 冰箱。冰箱。2021/8/2630 7.试验步骤试验步骤 TA97a TA98 TA100 TA

25、102 37 水浴水浴 振荡培养振荡培养 活菌数不得少于活菌数不得少于12 x 109/ml 增菌培养液增菌培养液增菌培养液增菌培养液增菌培养液增菌培养液增菌培养液增菌培养液2021/8/2631试验步骤试验步骤 受检物受检物 + + 菌液菌液 + + S9S9混合液混合液 或磷酸盐缓或磷酸盐缓（0.1-0.2ml） （0.1ml） （0.5ml） 37 水浴水浴 振荡培养振荡培养20imns加入加入45 顶层顶层培养基培养基2ml混匀混匀 37 培养培养48h 无菌小试管无菌小试管含底层含底层培养基培养基的平皿的平皿2021/8/26328.结果评价结果评价 受试组的菌落数大于受试组的菌落数

26、大于2 2倍自发回变数，并有剂倍自发回变数，并有剂量反应关系和重现性，判为诱变阳性。量反应关系和重现性，判为诱变阳性。2021/8/2633二、微核试验二、微核试验 原理原理： 骨髓细胞骨髓细胞骨髓细胞骨髓细胞染色体染色体染色体染色体经经经经诱变物诱变物诱变物诱变物作用，发生突变后出作用，发生突变后出作用，发生突变后出作用，发生突变后出现断裂，并有部分断片在有丝分裂后期不移向两极，现断裂，并有部分断片在有丝分裂后期不移向两极，现断裂，并有部分断片在有丝分裂后期不移向两极，现断裂，并有部分断片在有丝分裂后期不移向两极，在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中，因而在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中

27、，因而在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中，因而在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中，因而存存留留留留于细胞浆中，形成一个或几个圆形至杏仁状的结构，于细胞浆中，形成一个或几个圆形至杏仁状的结构，于细胞浆中，形成一个或几个圆形至杏仁状的结构，于细胞浆中，形成一个或几个圆形至杏仁状的结构，并存留一定时间。由于这种圆形结构比普通细胞核小，并存留一定时间。由于这种圆形结构比普通细胞核小，并存留一定时间。由于这种圆形结构比普通细胞核小，并存留一定时间。由于这种圆形结构比普通细胞核小，故称故称故称故称微核（微核（微核（微核（micronucleusmicronucleusmicronucleusmicro

28、nucleus）。2021/8/2634图示图示原理：原理： 诱变物诱变物嗜多染红细胞嗜多染红细胞微核直径相当于红细胞直径的微核直径相当于红细胞直径的1/201/201/51/5。2021/8/2635 1.1.动物动物 成年健康小鼠（品系），随机分为受试组和对照组。成年健康小鼠（品系），随机分为受试组和对照组。 10 10只只/ /组，雌雄各半。组，雌雄各半。2.2.受试物的处理受试物的处理 将受试物溶于适宜的溶剂中将受试物溶于适宜的溶剂中, ,以以0.1-0.20.1-0.2ml/10gml/10g体重的给体重的给药体积配制成适当的浓度。药体积配制成适当的浓度。3.3.给药方式给药方式给药

29、途径：与临床用药途径相同。内服时需灌胃。给药途径：与临床用药途径相同。内服时需灌胃。给药剂量：以给药剂量：以LDLD5050为依据，设三个剂量组。为依据，设三个剂量组。高剂量组高剂量组 LDLD5050的的0.8-0.5 0.8-0.5 ； 低剂量组低剂量组 LDLD5050的的0.05-0.10.05-0.1 并设阴性对照和阳性对照组，阳性对照物可选用已知的并设阴性对照和阳性对照组，阳性对照物可选用已知的能诱发微核阳性的诱变剂。能诱发微核阳性的诱变剂。2021/8/2636 4.4.试验操作试验操作 一次给药一次给药：2424，4848，7272小时取样制片。小时取样制片。 二次给药二次给药

30、：第二次给药后的：第二次给药后的6 6，2424小时取样制片。小时取样制片。 处死小鼠，将股骨骨髓洗入离心管，离心，常规涂片。处死小鼠，将股骨骨髓洗入离心管，离心，常规涂片。姬姆萨染色，镜检。姬姆萨染色，镜检。5.5.镜检镜检 计数：计数： 1000 个嗜多染红细胞（个嗜多染红细胞（PCE）/片片 求出：嗜多染红细胞求出：嗜多染红细胞/正染红细胞（正染红细胞（NCE） 必要时，丫啶橙染色，荧光显微镜分析计数。必要时，丫啶橙染色，荧光显微镜分析计数。2021/8/2637 6.6.结果评价结果评价 将数据列表，分别列出嗜多染红细胞数，微核数及将数据列表，分别列出嗜多染红细胞数，微核数及PCE/N

31、CE之比。所得结果用之比。所得结果用t检验进行数据分析，经重复检验进行数据分析，经重复试验试验P0.01并有剂量反应关系时，判为阳性。并有剂量反应关系时，判为阳性。2021/8/2638三、三、异常毒性检查异常毒性检查 （一）目的（一）目的 将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药，在规定时间内观察小鼠的死或口服给药，在规定时间内观察小鼠的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。种方法。 2021/8/2639 （二）（二） 实验动物实验动物 小鼠小鼠 健康无伤，健康无伤， 体重体重17172020g g。 做过本

32、实验的小鼠不能重复使用。做过本实验的小鼠不能重复使用。2021/8/2640（三）检验方法（三）检验方法 取取5 5只小鼠，按药物的给药途径，每只小只小鼠，按药物的给药途径，每只小鼠分别给予供试品溶液鼠分别给予供试品溶液0.50.5mlml。静脉注射：静脉注射：尾静脉注入供试品溶液，注射时尾静脉注入供试品溶液，注射时间一般为间一般为4 45 5秒，规定缓慢注射的药品可延秒，规定缓慢注射的药品可延长至长至3030秒。秒。皮下注射：皮下注射：可见注射部位皮下出现泡状隆起可见注射部位皮下出现泡状隆起。2021/8/2641（四）结果判定（四）结果判定 除另有规定外，除另有规定外，5 5只小鼠在给药后

33、只小鼠在给药后4848小时小时内不得死亡。如有死亡，另取体重内不得死亡。如有死亡，另取体重17172020g g小鼠小鼠1010只复测，全部小鼠在只复测，全部小鼠在4848小时内不得小时内不得有死亡，否则，判为不合格。有死亡，否则，判为不合格。2021/8/2642第三节第三节 制剂的安全性评价制剂的安全性评价一、热原反应试验一、热原反应试验二、溶血性检查二、溶血性检查三、局部刺激性试验三、局部刺激性试验 1. 家兔点眼法家兔点眼法 2. 家兔股四头肌法家兔股四头肌法四、过敏性试验四、过敏性试验五、降压物质检查五、降压物质检查2021/8/2643一、热原反应试验一、热原反应试验1.1.概念概

34、念 是指某些微生物的尸体及其增殖时的产物是指某些微生物的尸体及其增殖时的产物, ,主要主要是细菌的一种内毒素。是细菌的一种内毒素。 大多数细菌都能在增殖时产生热原，霉菌与酵大多数细菌都能在增殖时产生热原，霉菌与酵母菌也能产生热原。母菌也能产生热原。 热原随注射液进入动物体后，轻则能引起体温热原随注射液进入动物体后，轻则能引起体温升高，严重的虚脱死亡。升高，严重的虚脱死亡。2021/8/2644 检查对象：检查对象： 注射用原料注射用原料 溶媒溶媒 注射液注射液 注射器注射器2021/8/2645注射剂热原污染的途径注射剂热原污染的途径1. 1. 溶媒溶媒 注射用水注射用水2. 2. 原料原料

35、适宜微生物生长、生物制品适宜微生物生长、生物制品 如葡萄糖、水解蛋白、氯化钠如葡萄糖、水解蛋白、氯化钠 3. 3. 用具或容器污染用具或容器污染 4. 4. 生产过程中污染生产过程中污染 及时灭菌，缩短时间及时灭菌，缩短时间2021/8/2646热原的性质热原的性质1.耐热性耐热性 60 1小时不受影响小时不受影响;180-200 干热干热2小时或小时或250 30mins彻底破坏彻底破坏2.滤过性滤过性 过细菌滤器过细菌滤器;不能过透析膜不能过透析膜 3.水溶性水溶性 不溶于有机溶媒不溶于有机溶媒 4.不挥发性不挥发性 但可随水蒸气带入蒸馏水但可随水蒸气带入蒸馏水5.被吸附性被吸附性 活性炭

36、活性炭,硅藻土硅藻土,树脂等树脂等2021/8/2647除去热原的方法除去热原的方法1. 防止污染防止污染 药液、溶媒（药液、溶媒（24小时内小时内ddH2O）2. 清除热原清除热原 容器用强酸、强碱、干热容器用强酸、强碱、干热3. 吸附吸附 0.1- 0.2%活性炭；多层石棉板活性炭；多层石棉板4. 超声波超声波 破坏热原破坏热原5. 氧化剂氧化剂 高锰酸钾、双氧水高锰酸钾、双氧水2021/8/26482.热原检查法热原检查法 本法系将一定剂量的供试品，静脉注射本法系将一定剂量的供试品，静脉注射入家兔体内，在规定时间内，观察家兔入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中

37、所含体温升高的情况，以判定供试品中所含热原热原的限度是否符合规定。的限度是否符合规定。2021/8/2649(1)选符合规定的家兔选符合规定的家兔1. 健康无伤，体重健康无伤，体重1.73.0kg，同一来源、同一品系，同一来源、同一品系，雌兔无孕。雌兔无孕。2. 1兔兔1笼，标兔号，经笼，标兔号，经7日同一饲养条件饲养，测温日同一饲养条件饲养，测温条件相同。在此期间，体重应不减轻，精神、食欲、条件相同。在此期间，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常排泄等不得有异常。2021/8/2650(2)试验前的准备试验前的准备1、试试验验前前12日日，供供试试用用家家兔兔应应处处于于同同一一温温度

38、度的的环环境境中中，实实验验室室与与饲饲养养室室环环境境温温度相差不得大于度相差不得大于5。2021/8/26512.室温应在室温应在1728，在试验全部过程中，在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于应注意室温变化不得大于3，应避免噪，应避免噪音干扰。音干扰。3.家兔在试验前停食家兔在试验前停食1小时并置于固定盒内，小时并置于固定盒内，直至试验完毕。直至试验完毕。2021/8/26524、肛温计插入深度约、肛温计插入深度约6cm，不得少于不得少于1.5分钟，每隔分钟，每隔30分钟测量体温分钟测量体温1次，一般测次，一般测量量2次，两次体温之差不得超过次，两次体温之差不得超过0.2，以，以此两

39、次体温的平均值作为该兔的正常体此两次体温的平均值作为该兔的正常体温温。2021/8/2653 5.试试验验用用的的注注射射器器、针针头头及及一一切切与与供供试试品品溶溶液液接接触触的的器器皿皿，应应置置烘烘箱箱中中用用250加加热热30分分钟钟或或用用180加加热热2小小时时，也也可可用用其其他他适宜的方法除去热原。适宜的方法除去热原。2021/8/2654(3)检查方法检查方法1.每每个个供供试试样样品品用用家家兔兔3只只，在在测测定定正正常常体体温温(38.3-39.6 )后后15分钟内给药。分钟内给药。2.供供试试品品注注射射的的体体积积，按按家家兔兔体体重重不不少少于于1ml/kg，不

40、不大大于于10ml/kg，体体积积在在510ml/kg的的溶溶液液应应在在37 38预热后注射。预热后注射。2021/8/26553.耳静脉缓慢注射，但每兔不超过耳静脉缓慢注射，但每兔不超过3分钟。分钟。4.给药后每隔给药后每隔30分钟测温分钟测温1次，共测次，共测6次。次。2021/8/26565、温差计算：、温差计算：（1）以）以6次体温中最高的一次减去正常体温，次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度。即为该兔体温的升高温度。（2）以）以6次体温中最低的一次减去正常体温，次体温中最低的一次减去正常体温，即为该兔体温的降低温度。即为该兔体温的降低温度。2021/8/2657(

41、4)结果判断结果判断1.判断复试：判断复试：（1）初初试试3只只兔兔中中仅仅有有1只只体体温温升升高高0.6或或0.6以以上上，或或3只只家家兔兔升升温温均均低低于于0.6，但但升升温温的的总总数数达达1.4或或1.4以以上上,应应另另取取5只家兔复试。只家兔复试。2021/8/2658（2）含有热原的供试品，一般在给家兔静）含有热原的供试品，一般在给家兔静脉注射后脉注射后12小时出现升温高峰，当第小时出现升温高峰，当第3小小时升温大于时升温大于0.6时，宜复试后再作判断。时，宜复试后再作判断。（3）3只家兔中有只家兔中有1只降温值小于只降温值小于0.6，或，或3只家兔中有只家兔中有2只降温值

42、在只降温值在0.450.55，应，应另取另取3只家兔复试。只家兔复试。2021/8/26592.2.判断合格判断合格（1）初试）初试3只家兔中，体温升高只家兔中，体温升高0.6以下，以下，并且并且3只家兔升温的总数在只家兔升温的总数在1.4以下可判以下可判断为符合规定。断为符合规定。2021/8/2660（2）复复试试5只只家家兔兔中中，体体温温升升高高0.6或或0.6以以上上的的家家兔兔数数仅仅有有1只只，并并且且初初复复试试合合并并，8只只家家兔兔的的升升温温总总数数为为3.5或或3.5以下，可判断为符合规定。以下，可判断为符合规定。 2021/8/26613 3、判断不合格、判断不合格（

43、1）初初试试3只只家家兔兔中中，体体温温升升高高0.6或或0.6以以上上的的家家兔兔数数有有2只只或或3只只，可可判判断断为为不符合规定。不符合规定。2021/8/2662（2）复复试试的的5只只家家兔兔中中，体体温温升升高高0.6或或0.6以以上上的的家家兔兔数数有有2只只或或2只只以以上上，可可判判断为不符合规定。断为不符合规定。（3）初初复复试试合合并并8只只家家兔兔的的升升温温总总数数超超过过3.5，可判断为不符合规定。，可判断为不符合规定。2021/8/2663二、中草药注射剂的质量检查二、中草药注射剂的质量检查1.1.急性毒性急性毒性 中草药注射剂的耐受量应为家畜临床用中草药注射剂

44、的耐受量应为家畜临床用量的量的100倍为安全，倍为安全，60倍以上者可慎用。倍以上者可慎用。2021/8/2664具体方法具体方法n取取小小鼠鼠5 只只，尾尾静静脉脉或或腹腹腔腔注注射射0.5ml药药液液，观观察察小小鼠鼠有有无无震震颤颤、惊惊厥厥、四四肢肢瘫瘫痪痪、步步态态不不稳稳、竖毛、呼吸抑制或死亡等反应。竖毛、呼吸抑制或死亡等反应。n一一般般观观察察48-72小小时时，如如有有死死亡亡，应应另另取取10只只重重做，不得有死亡。做，不得有死亡。2021/8/26652 2、溶血试验、溶血试验n含皂苷或鞣质或成分尚未十分明确的中含皂苷或鞣质或成分尚未十分明确的中草药注射液必须做溶血试验。草

45、药注射液必须做溶血试验。2021/8/2666具体方法具体方法（1）2%兔的红细胞生理盐水的配制兔的红细胞生理盐水的配制 兔耳缘静脉采血兔耳缘静脉采血1ml，置青霉素小瓶（西林置青霉素小瓶（西林瓶）中，加玻璃珠搅拌除纤维蛋白，用生理盐水瓶）中，加玻璃珠搅拌除纤维蛋白，用生理盐水离心洗涤至上清液澄清为止，然后配成离心洗涤至上清液澄清为止，然后配成2%混悬混悬液液。 2021/8/2667（2）溶血试验设计表）溶血试验设计表 试管号试管号1234567被试药液被试药液（ml）0.10.2 0.3 0.4 0.500生理盐水生理盐水（ml）2.42.3 2.2 2.1 2.0 2.50红细胞液红细胞

46、液（ml）2.52.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5蒸馏水蒸馏水（ml）0000002.52021/8/2668 取洁净试管取洁净试管7支，按上表排列加入各种溶液，支，按上表排列加入各种溶液，第第6管为阴性对照管，第管为阴性对照管，第7管为阳性对照管。各管管为阳性对照管。各管轻轻摇匀后，轻轻摇匀后， 37恒温箱或水浴中保温（或恒温箱或水浴中保温（或25-37 室温下），开始每隔室温下），开始每隔15分钟，分钟，1小时后每隔小时后每隔1小时分别观察小时分别观察1次，共次，共3小时。小时。2021/8/2669（3）结果判断）结果判断判定标准判定标准: :1.1.全溶血全溶血: :溶液澄

47、明红色溶液澄明红色, ,管底无红细胞残留管底无红细胞残留. .2.2.部分溶血部分溶血: :溶液澄明红色或棕色溶液澄明红色或棕色, ,管底有少量红细胞残留管底有少量红细胞残留. .3.3.无溶血无溶血: :红细胞全部下沉红细胞全部下沉, ,上层液体无色上层液体无色澄明澄明. .4.4.凝集凝集: :虽不虽不溶血溶血, ,但出现红絮状物但出现红絮状物, ,振摇后不能分散振摇后不能分散. .将凝将凝集物置于载玻片上集物置于载玻片上, ,盖上盖玻片盖上盖玻片, ,从边缘滴加生理盐水从边缘滴加生理盐水, ,显微显微镜下观察镜下观察, ,红细胞散开者为假红细胞散开者为假凝集凝集, ,反之为真凝集反之为真

48、凝集. .2021/8/2670 结果判定结果判定: : 一般认为一般认为, , 第第3 3管或第管或第3 3管以前被试药液在管以前被试药液在3030分钟内引分钟内引起溶血、起溶血、部分溶血部分溶血或出现凝集现象的，不宜作静脉注射或出现凝集现象的，不宜作静脉注射用；不溶血或出现假凝集现象的才可作注射用。用；不溶血或出现假凝集现象的才可作注射用。2021/8/2671 三、局部刺激性试验三、局部刺激性试验1. 家兔点眼法家兔点眼法 取取健健康康家家兔兔1 1只只，固固定定，观观察察眼眼结结膜膜色色泽泽和和血血管管分分布布情情况况；然然后后将将下下眼眼睑睑拉拉成成杯杯状状，取取被被测测试试药药液液

49、2 2滴滴（1010mg/mlmg/ml）滴滴入入左左眼眼结结膜膜囊囊内内，1 1分分钟钟后后放放开开眼眼睑睑，任任药药液液自自溢溢；右右眼眼同同样样滴滴入入生生理理盐盐水水为为对对照照。观观察察给给药药后后3030、6060、9090、120 120 minsmins时时结结膜膜有有无无充充血血、水水肿肿、畏畏光光和和流流泪泪等等现现象象。如如无无这这些些现现象象该该药药即为合格。本法适用于滴眼剂和其他黏膜用药刺激性的测试。即为合格。本法适用于滴眼剂和其他黏膜用药刺激性的测试。2021/8/2672 三、局部刺激性试验三、局部刺激性试验2. 家兔股四头肌法家兔股四头肌法 本试验考察药物制剂，

50、应用于局部组织后，是否引起本试验考察药物制剂，应用于局部组织后，是否引起红肿、充血、肌肉变性或坏死等刺激反应，以确定该药物红肿、充血、肌肉变性或坏死等刺激反应，以确定该药物制剂的局部试验是否符合规定。制剂的局部试验是否符合规定。方法方法：家兔股四头肌法。选用健康、体重：家兔股四头肌法。选用健康、体重2 2kgkg左右的家兔左右的家兔2 2只，分别于一侧股四头肌处以无菌操作方法注入受试制剂只，分别于一侧股四头肌处以无菌操作方法注入受试制剂 2.02.0mlml；另侧相应部位同法注入等容积的灭菌生理盐水作另侧相应部位同法注入等容积的灭菌生理盐水作为对照。为对照。4848小时后处死家兔，解剖后取出股

51、四头肌，纵向小时后处死家兔，解剖后取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应。切开，观察注射部位肌肉的刺激反应。 2021/8/2673注射剂刺激反应评分标准注射剂刺激反应评分标准 反应级数反应级数 刺激反应刺激反应 0 0 给药部位无明显反应给药部位无明显反应 1 1 给药部位轻度充血，直径在给药部位轻度充血，直径在0.50.5cmcm以下以下 2 2 给药部位中度充血，直径在给药部位中度充血，直径在1.01.0cmcm以下以下3 3 给药部位重度充血，红肿，肌肉有变性给药部位重度充血，红肿，肌肉有变性 4 4 肌肉褐色变性，坏死，直径在肌肉褐色变性，坏死，直径在0.50.5cmcm

52、以下以下 5 5 肌肉严重变性，出现大片坏死肌肉严重变性，出现大片坏死 2021/8/2674结果判定结果判定 凡两只家兔的平均反应级数在凡两只家兔的平均反应级数在2 2以下者，可供以下者，可供肌注；如平均反应级数在肌注；如平均反应级数在2 23 3之间者应复试，或之间者应复试，或结合其他项目考虑其临床试用问题。结合其他项目考虑其临床试用问题。2021/8/2675四、过敏性试验四、过敏性试验 取体重取体重250-350250-350g g 豚鼠豚鼠6 6只，隔日肌肉注射受试药液只，隔日肌肉注射受试药液0.2-0.50.2-0.5mlml，共三次，然后分两组，每组共三次，然后分两组，每组3 3

53、只。第一组首次只。第一组首次注射后的第注射后的第1414日由颈静脉注射受试品日由颈静脉注射受试品1-21-2mlml，或腹腔注射或腹腔注射受试品受试品2-32-3mlml。第二组于首次注射后的第第二组于首次注射后的第2121天同样静脉或腹天同样静脉或腹腔注射受试品，并进行观察。观察注射后有无用爪搔鼻、腔注射受试品，并进行观察。观察注射后有无用爪搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克和死亡喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克和死亡等反应。如两组豚鼠均未出现明显的上述过敏现象，即可等反应。如两组豚鼠均未出现明显的上述过敏现象，即可以认为受试品不会引起过敏反应。以认为受试品不会引起过敏反应。2021/8/2676五、降压物质检查五、降压物质检查 药典中规定供注射用的脏器制剂和生化制药典中规定供注射用的脏器制剂和生化制剂，须经过降压物质检查。剂，须经过降压物质检查。 方法方法：将一定量的受试品与一定量的组胺对：将一定量的受试品与一定量的组胺对照品注射入麻醉猫（或狗）的静脉，以比较照品注射入麻醉猫（或狗）的静脉，以比较两者引起血液下降的程度，从而判定受试品中降两者引起血液下降的程度，从而判定受试品中降压物质的限度是否符合规定。压物质的限度是否符合规定。2021/8/2677部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！