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1、第一章第一章PCR技术原理技术原理2021/7/131定义：定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内，是通过模拟体内DNA复制的复制的方式，在体外选择性地将方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩某个特殊区域扩增出来的技术。增出来的技术。nPCR技术技术:2021/7/132PCR概念的提出概念的提出n1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。n1983，Kary Mul
2、lisn1993年获得诺贝尔奖2021/7/133引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段2021/7/134技术难点Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。2021/7/135thermusaquaticusTaq DNA聚合酶的发现1988年年Saiki等从温泉等从温泉（Hotspring）中分离）中分离的一株水生嗜热杆菌的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNA聚合酶。聚合酶。2021/7/136耐
3、高温，耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度长度(2.0Kb)。酶命名为酶命名为TaqDNA多聚酶多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被。此酶的发现使被PCR广泛应用。广泛应用。在在1989年，年，Science将将PCR中的中的TaqDNA多聚酶命多聚酶命名为当年的风云分子名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear) Taq DNA聚合酶优点2021/7/1371 1 1 1、PCRPCRPC
4、RPCR技术的基本原理技术的基本原理技术的基本原理技术的基本原理在微量离心管中在微量离心管中在微量离心管中在微量离心管中, , , ,加入适量的加入适量的加入适量的加入适量的缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液, , , , 微量的微量的微量的微量的模板模板模板模板DNADNADNADNA, , , ,四种脱氧四种脱氧四种脱氧四种脱氧单核苷酸单核苷酸单核苷酸单核苷酸, , , ,耐热性耐热性耐热性耐热性多聚酶多聚酶多聚酶多聚酶, , , , 一对合成一对合成一对合成一对合成DNADNADNADNA的的的的引物引物引物引物, , , ,通过通过通过通过高温变性、高温变性、高温变性、高温变性、低温退火低温退火
5、低温退火低温退火和和和和中温延伸中温延伸中温延伸中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程三个阶段为一个循环的反应过程三个阶段为一个循环的反应过程三个阶段为一个循环的反应过程, , , ,每一次循每一次循每一次循每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍环使特异区段的基因拷贝数放大一倍环使特异区段的基因拷贝数放大一倍环使特异区段的基因拷贝数放大一倍, , , ,一般样品是经过一般样品是经过一般样品是经过一般样品是经过30303030次循环次循环次循环次循环, , , ,最终最终最终最终使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍; ; ; ; 扩增了特异区段的扩增了
6、特异区段的扩增了特异区段的扩增了特异区段的DNADNADNADNA带。带。带。带。 PCR技术的基本原理和工作方式2021/7/138模板DNA952.PCR工作方式2021/7/139PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点9550引物1引物2DNA引物2021/7/1310PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶2021/7/1311PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始2021/7/1312PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072
7、TaqTaqTaqTaq2021/7/1313PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束2021/7/1314PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增2021/7/13153.PCR基本材料模板：单链或双链模板：单链或双链DNA引物：引物：16-30bp合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸DNA聚合酶：耐热的聚合酶：耐热的DNA聚合酶聚合酶底物：四种脱氧三磷酸核苷底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)Mg2+Mg2+： DNADNA聚合酶的激活剂聚
8、合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂2021/7/13164.PCR反应程序949630-3预变性（使模板预变性（使模板DNA充分变性）充分变性）9430变性变性50-6030-1复性（使引物与模板充分退火）复性（使引物与模板充分退火）72n(按按1扩增扩增1kb计算）延伸计算）延伸723-7总的延伸（使产物延伸完整）总的延伸（使产物延伸完整）4-10保存保存 25-35个循环个循环2021/7/13175.PCR要素解析1）复性和延伸复性和延伸温度温度 复性的温度是复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60之间。具体的温度主要由引物的之间。具
9、体的温度主要由引物的Tm值决定值决定（低于（低于Tm值值2-3）。）。延伸温度绝大多数设定为延伸温度绝大多数设定为72。如果复性的温度很高，。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法步法PCR。2）反应）反应时间时间 变性一般使用变性一般使用30秒钟，如果模板的秒钟，如果模板的G+C含量较高，含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有复性时间有30秒种一般是足够的。秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1k
10、b用用1分钟来保证充足的时间。分钟来保证充足的时间。 2021/7/13185.PCR要素解析3）循环）循环次数次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为2535次。次。平台效应（平台效应（plateaueffect）：）：PCR扩增过程后期出扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和和DNA聚合酶的稳定性或活性降低聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或
11、引物的二聚体出现端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。产物变性不彻底。 2021/7/13195.PCR要素解析4）PCR反应液的配制顺序反应液的配制顺序最后加入最后加入DNA聚合酶。聚合酶。早期的早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。性扩增的问题。 2021/7/1320 5.
12、PCR要素解析5）各种成分浓度作用：各种成分浓度作用：各种成分浓度作用：各种成分浓度作用：缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的PHPH值和值和值和值和DNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂10mMTrisHCl10mMTrisHCl（ pH8.3-9.0pH8.3-9.0），），），），1.5mM1.5mMMgCl2，50mMK+ dNTPdNTP（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的 44种种种种 dNTPdNTP（即即即即 dATPdATP、dTTPdTTP、dCTPdCTP
13、和和和和dGTPdGTP），），），），终浓度一般为终浓度一般为终浓度一般为终浓度一般为 200mM200mM（即饱和浓度），（即饱和浓度），（即饱和浓度），（即饱和浓度），dNTPdNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。 引物：引物：引物：引物： 1 1M/LM/Ln n 2021/7/13215.PCR要素解析模板：模板：模板：模板：单、双链单、双链单、双链单、双链DNADNA均可。均可。均可。均可。 模板的数量会直接影响扩增的效果。模板的数量会直接影响扩增的效果
14、。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过模板浓度过模板浓度过模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。高会导致反应的非特异性增加。高会导致反应的非特异性增加。高会导致反应的非特异性增加。DNADNA聚合酶：聚合酶：聚合酶：聚合酶：最常用的是最常用的是最常用的是最常用的是TaqDNATaqDNA聚合酶，最适反应温度聚合酶，最适反应温度聚合酶，最适反应温度聚合酶，最适反应温度7272。PfuDNAPfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有聚合酶：是目前使用最广泛的具有聚合酶：是目前使用最广泛的具有聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3-53-5外切活性的外切活性的外切活
15、性的外切活性的 PCRPCR酶，酶，酶，酶，目前为止错配率最低的高温目前为止错配率最低的高温目前为止错配率最低的高温目前为止错配率最低的高温DNADNA聚合酶。聚合酶。聚合酶。聚合酶。酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降; ;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。2021/7/1322长度：至少长度：至少16bp，通常为，通常为18-25bp。更短的引物一般会降低扩。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性增的特异性，但会提高扩增的有效性引物的解链温度：两个引物之间的引物
16、的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在值差异最好在2-5。对于小于对于小于20个碱基的引物其个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。）。避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的3端）。端）。G+C含量：尽量控制在含量：尽量控制在40%至至60%之间，之间，4种碱基的分布应种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在在3末末端的重复排列。端的重复排列。引物的引物的3末端最好是末端最好是G或或C，但不要，但不要GC
17、连排。连排。5.PCR要素解析：引物设计2021/7/13236. PCR技术特点n n1）高度的灵敏性3030轮循环轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍2021/7/1324 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反应反应结果的关键。结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物6. PCR技术特点n n1）特异性2
18、021/7/13253 3 3 3）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行PCRPCRPCRPCR扩增法扩增法扩增法扩增法, , , ,只需要只需要只需要只需要数小时数小时数小时数小时, , , ,就可以用电泳法检出就可以用电泳法检出就可以用电泳法检出就可以用电泳法检出1g1g1g1g基基基基因组因组因组因组DNADNADNADNA中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。 6. PCR技术特点2021/7/13264 4 4 4 ）用途广泛）用途广泛）用途广泛）用途广泛生命学科生命学科生命学科生命学科医学工程医学工
19、程医学工程医学工程遗传工程遗传工程遗传工程遗传工程疾病诊断疾病诊断疾病诊断疾病诊断法医学法医学法医学法医学考古学考古学考古学考古学6. PCR技术特点2021/7/13271、2Taq PCR MasterMix2、DNA模板3、引物：本次实验所用材料材料2021/7/1328PCR反应体系试剂试剂体积（体积（l）2TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板模板100ng1ddH2Oto252021/7/1329PCR反应程序955min1个循环个循环9530sec35个循环个循环6030sec7230sec7210min1个循环个循环4hold2021/7/
20、1330琼脂糖凝胶电泳n琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。2021/7/1331琼脂糖n琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中2021/7/1332电荷效应n琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分
21、离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中2021/7/1333分子筛效应nDNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。2021/7/1334线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶的百分琼脂糖凝胶的百分浓度（浓度（%）线状线状DNA分子的有效分子的有效范围（范围（Kb）
22、0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.12021/7/1335实验材料n【材料材料】n1. 琼脂糖n2. 10mg/ml EBn3. markern4. TAETris242gCH3COOH57.1ml0.5MEDTA（pH8.0）100mlddH2Oto1000ml2021/7/1336实验步骤n【步骤步骤】n1、称1.5g琼脂糖，加100ml电泳缓冲液（1TAE）加热熔化。n2、胶液冷却至60时，加入4l EB，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。n3、待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于水平电泳槽中，加入1TAE，让液面高于
23、胶面至少1mm。n4、上样。n5、接通电泳仪电源，1-5V/cm电压（一般80100V），开始电泳。n6、根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源后，取出凝胶，使用凝胶成像仪进行观察或拍照。2021/7/1337琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳DNA回收回收2021/7/1338实验原理离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤膜，这种滤膜在低低PH值值、高浓度盐（盐酸胍，NaI, NaClO4等）存在的条件下，可以选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将
24、纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。利用硅基质膜的过滤吸附操作，大大简化了核酸纯化过程，提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外，已经有96孔板、384孔板等核酸纯化产品。目前，硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。2021/7/1339试剂盒组成及储存方法名称 用途溶胶/结合液 DA 溶胶（红色）结合液DD无色 与DA混合后变为黄色洗涤液W1洗涤液去盐液W2洗脱盐离子（75% EtOH）洗脱液EB洗脱DNA 吸附柱 AC 结合DNA收集管 （2ml） 收集废液2021/7/1340实验步骤2021/7/13412021/7/1342注意事项n切胶回收DNA时，应尽量使用能量较低的长波长紫外线，并缩短操作时间，以减少紫外线对DNA的损伤。n第一次使用前先在漂洗液W2中加入指定量的无水乙醇，加入后及时做好标记，以免多次加入。n各种溶液使用后应及时盖紧，以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化。n所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时，立即用大量清水冲洗。n适当减小洗脱体积可提高回收DNA的浓度。但体积小于30l将降低洗脱效率。2021/7/1343凝胶电泳检测2021/7/1344问题？问题？
