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1、第八章第八章 生物样品内中药制剂化学成分生物样品内中药制剂化学成分的测定的测定 1 概述概述生物药物分析的对象生物药物分析的对象药物所到之生物体的药物所到之生物体的体液、器官、组织、排泄物等。体液、器官、组织、排泄物等。生物药物分析的目标生物药物分析的目标母体药物和代谢产物母体药物和代谢产物生物药物分析的意义生物药物分析的意义药物质量的正确评价药物质量的正确评价临床合理用药临床合理用药1 1 概述概述 生物药物分析的特点生物药物分析的特点生物样品中被测组分的存在形式多样生物样品中被测组分的存在形式多样原型药游离型）、结合型、代谢物、缀合物等原型药游离型）、结合型、代谢物、缀合物等被测组分浓度低
2、被测组分浓度低(10-6-10-9g/ml)，变化幅度，变化幅度大大样品干扰物质多，部分样品稳定差样品干扰物质多，部分样品稳定差样品量少样品量少要求较快提供结果要求较快提供结果测定数据的处理和阐明有时不太容易测定数据的处理和阐明有时不太容易1 1 概述概述 生物药物分析的任务生物药物分析的任务分析方法学的研究分析方法学的研究药物浓度的监测药物浓度的监测药代动力学的研究药代动力学的研究生物样品内内源性物质的测定生物样品内内源性物质的测定2 2 药物在生物体内的存在状态与生物转化药物在生物体内的存在状态与生物转化药物在生物体内的存在状态药物在生物体内的存在状态药物代谢药物代谢保证临床用药的安全、合
3、理和有效保证临床用药的安全、合理和有效药物代谢的部位：肝脏、肾、脾、肺、肠粘膜、药物代谢的部位：肝脏、肾、脾、肺、肠粘膜、胎盘等胎盘等药物代谢反应药物代谢反应第一阶段一相）：细胞色素第一阶段一相）：细胞色素P450等催化下的等催化下的氧化、复原、水解等反应，增大极性氧化、复原、水解等反应，增大极性第二阶段二相）：与葡萄糖醛酸、硫酸盐等结第二阶段二相）：与葡萄糖醛酸、硫酸盐等结合，进一步增大极性，随尿排出合，进一步增大极性，随尿排出3 3 生物样品的制备生物样品的制备 常用生物样品常用生物样品生物样品的选取原则生物样品的选取原则能够反映出浓度与药效之间的关系能够反映出浓度与药效之间的关系易于获得
4、易于获得便于处理便于处理根据不同目的和要求进行选取根据不同目的和要求进行选取3 3 生物样品的制备生物样品的制备 常用生物样品常用生物样品常用生物样品的种类、特点与采集常用生物样品的种类、特点与采集 血浆血浆(plasma)血样血样 血清血清(serum) 全血全血(whole blood)尿液尿液(urine)用于药物剂量回收、药物肾清用于药物剂量回收、药物肾清除率及生物利用度的研究除率及生物利用度的研究 尿液药物浓度变化大，应测定一定时间内尿尿液药物浓度变化大，应测定一定时间内尿中药中药 物总量。物总量。 尿液与血液中药物的相关性差。尿液与血液中药物的相关性差。 尿中药物大多呈缀合状态。尿
5、中药物大多呈缀合状态。3 3 生物样品的制备生物样品的制备 常用生物样品常用生物样品常用生物样品的种类、特点与采集常用生物样品的种类、特点与采集唾液唾液(saliva)用于药物浓度监测和药代动力学研究用于药物浓度监测和药代动力学研究其他其他动物脏器组织匀浆等动物脏器组织匀浆等样本的代表性样本的代表性力求取样条件标准化力求取样条件标准化样品的贮存样品的贮存血样血样离心，冷冻保存离心，冷冻保存尿液立即测定，否则应冷藏或加防腐剂尿液立即测定，否则应冷藏或加防腐剂3 3 生物样品的制备生物样品的制备 样品预处理样品预处理提取方法的选择依据提取方法的选择依据药物的理化性质药物的理化性质-酸碱度、极性、挥
6、发性、可能的生物转化途径等酸碱度、极性、挥发性、可能的生物转化途径等药物的浓度范围药物的浓度范围药物测定的目的药物测定的目的生物样品的类型生物样品的类型样品处理与分析技术的关系样品处理与分析技术的关系3 3 生物样品的制备生物样品的制备 样品预处理样品预处理药物的提取药物的提取蛋白质处理蛋白质处理利用蛋白质脱水沉淀利用蛋白质脱水沉淀有机溶剂、中性盐等有机溶剂、中性盐等利用蛋白质形成不溶性盐沉淀利用蛋白质形成不溶性盐沉淀酸性沉淀剂酸性沉淀剂TCA、高氯酸、苦味酸等）、高氯酸、苦味酸等）重金属盐重金属盐Zn2+、Cu2+）3 3 生物样品的制备生物样品的制备 样品预处理样品预处理药物的提取药物的提
7、取蛋白质处理蛋白质处理其他方法其他方法加热加热离心、超滤和透析离心、超滤和透析分析游离的待测组分分析游离的待测组分酶消化法酶消化法分析与蛋白质强结合的待测组分分析与蛋白质强结合的待测组分3 3 生物样品的制备生物样品的制备 样品预处理样品预处理药物的提取药物的提取缀合物结合物水解缀合物结合物水解酸水解酸水解无机酸无机酸 简便快速，但专属性差，有可能造成被测简便快速，但专属性差，有可能造成被测物分解。物分解。酶水解酶水解葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase)芳基硫酸酯酶芳基硫酸酯酶(arylsulfatase) 专属性强，一般不会造成被测物分解，但专属性强，一般不会造成被测物
8、分解，但水解时间长，费用高。水解时间长，费用高。溶剂解溶剂解3 3 生物样品的制备生物样品的制备 样品预处理样品预处理药物的提取药物的提取冷冻干燥冷冻干燥适用于适用于-大批量的生物样品大批量的生物样品-水溶性很强的样品水溶性很强的样品-挥发性样品挥发性样品-对热不稳定的样品对热不稳定的样品3 3 生物样品的制备生物样品的制备 样品预处理样品预处理药物的分离与净化药物的分离与净化液液-液萃取液萃取萃取率：不低于萃取率：不低于50%影响提取率的因素影响提取率的因素pH值值提取溶剂提取溶剂离子强度离子强度离子对提取离子对提取3 3 生物样品的制备生物样品的制备 样品预处理样品预处理药物的分离与净化药
9、物的分离与净化液液-固萃取固萃取固相提取柱使用硅藻土、氧化铝、离子交固相提取柱使用硅藻土、氧化铝、离子交换树脂、活性炭等填充剂）换树脂、活性炭等填充剂）“干混合物萃取干混合物萃取待测组分的富集待测组分的富集真空挥发或通气流挥发真空挥发或通气流挥发衍生化处理衍生化处理3 3 生物样品的制备生物样品的制备 样品预处理样品预处理待测物的损失待测物的损失吸附、化学降解、衍生化反应、络合、蒸发吸附、化学降解、衍生化反应、络合、蒸发样品玷污样品玷污增塑剂增塑剂脂肪酸和酯类脂肪酸和酯类其他其他4 4 生物样品内药物分析方法生物样品内药物分析方法分析方法建立的一般步骤分析方法建立的一般步骤 以纯品进行测定以纯
10、品进行测定 确定线性范围、最适测定浓度、灵敏度、确定线性范围、最适测定浓度、灵敏度、最佳测定条件等最佳测定条件等空白样品测定空白样品测定以水代替空白样品，添加对照品后测定以水代替空白样品，添加对照品后测定 了解提取回收率和最低检测浓度的大致了解提取回收率和最低检测浓度的大致情况情况空白样品中添加对照品后测定回收率实空白样品中添加对照品后测定回收率实验）验）实际样品测定实际样品测定4 4 生物样品内药物分析方法生物样品内药物分析方法 方法的评价方法的评价准确度准确度accuracy）回收率回收率相对稳定相对稳定与参比方法相比较与参比方法相比较相关系数相关系数r 0.95精密度精密度precisi
11、on） 各浓度点各浓度点RSD不应大于不应大于15%，最低定量限，最低定量限不应大于不应大于20%。灵敏度灵敏度检测限检测限(LOD)、定量限、定量限(LOQ)、最低检测浓度、最低检测浓度4 4 生物样品内药物分析方法生物样品内药物分析方法 方法的评价方法的评价方法的专属性方法的专属性specificity） 注重考虑代谢物、内源性物质和同注重考虑代谢物、内源性物质和同时服用药物的干扰时服用药物的干扰线性范围线性范围-相关系数相关系数r 0.99 样品稳定性考察样品稳定性考察长期贮存长期贮存(-20 /-70)、短期室、短期室温贮存温贮存冷冻冷冻-解冻循环稳定性解冻循环稳定性贮备液稳定性贮备液
12、稳定性5 5 生物药物分析的常用测定方法生物药物分析的常用测定方法 光谱法光谱法紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法荧光分光光度法荧光分光光度法色谱法色谱法电泳法电泳法免疫分析法免疫分析法6 6 应用实例应用实例人尿中槲皮素含量测定 取15mL氩气消泡后的尿液，用0.12mol/L醋酸盐(含1%抗坏血酸)调尿液pH至5，样品中加入1g漆树黄酮做内标，用葡萄糖醛酸苷酶/芳基磺胺酶在37温孵1h震荡水解，取500mg反相C18填料，甲醇湿润装柱，随后用1%甲酸5mL平衡ODS柱，酶解后的尿液上样，流速为5mL/min左右，用3mL5%甲醇和3mL90%甲醇(含1%甲酸和1%抗坏血酸)洗脱，最后用3
13、mL甲醇洗脱。馏分合并，真空吹干，残渣用150uL甲醇复溶后进样。NielsenSE, et al. J Chromatogr (B),2019,707(2):812891五灵胶囊中五味子乙素在小鼠体内药代动力学研究五灵胶囊中五味子乙素在小鼠体内药代动力学研究色谱条件：色谱条件：KromasilC-18色谱柱色谱柱 (4.6mm150mm,粒度粒度:5um); 流动相为甲醇流动相为甲醇-水水(80:20); 流速流速1.0mlmin; 检测波长检测波长254nm; 柱温为室温。柱温为室温。给药方法：昆明小鼠给药方法：昆明小鼠456只，雄性，置相对湿度只，雄性，置相对湿度45%75%、温度、温度
14、(251)动物试验室饲养动物试验室饲养3d，禁食过夜，自由，禁食过夜，自由饮水，次日按体重分层，随机分组，每时间点为一组，每组饮水，次日按体重分层，随机分组，每时间点为一组，每组4只，五灵胶囊按只，五灵胶囊按16.6g/kg (相当于人体给药剂量相当于人体给药剂量10倍倍,其其中含五味子乙素中含五味子乙素45.0mg)给药给药,分别在分别在0.16, 0.32, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 ,5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 18.0, 20.0, 24.0, 26.0, 28.0, 32.0
15、h眼眼眶采血，置于肝素钠的离心管内，室温放置眶采血，置于肝素钠的离心管内，室温放置30min，3000rmin离心离心10min,分离血浆分离血浆,每组血浆合并置每组血浆合并置-20冻冻存。乙素供试品按存。乙素供试品按45.0mg/kg给药给药,分别在分别在0.16, 0.32, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0h采血，同上法操作得血浆，采血，同上法操作得血浆，-20冻存。冻存。五灵胶囊中五味子乙素在小鼠体内药代动力学研究五灵胶囊中五味子乙素在小鼠体内药代动力学研究血浆供试品溶液、血浆乙素供试品溶液与阴性供试
16、血浆供试品溶液、血浆乙素供试品溶液与阴性供试品溶液的制备品溶液的制备 取上述依时间点取每组小鼠混匀血浆取上述依时间点取每组小鼠混匀血浆0.7ml，分，分别加别加0.25g硫酸胺，振荡混匀硫酸胺，振荡混匀1min，再加乙腈，再加乙腈-甲甲醇醇(4:1)溶液溶液4ml，振荡混匀，振荡混匀3min，3000rmin离离心心20min，取上清液置蒸发皿内，于，取上清液置蒸发皿内，于40水浴上用水浴上用氮气吹干，残渣加色谱甲醇溶解至氮气吹干，残渣加色谱甲醇溶解至1ml，摇匀，摇匀，-20放置过夜。次日用放置过夜。次日用0.22Lm微孔滤膜抽滤，作微孔滤膜抽滤，作为血浆供试品溶液。取上述乙素供试品依时间点
17、取为血浆供试品溶液。取上述乙素供试品依时间点取每组混匀血浆每组混匀血浆0.7ml，按供试品溶液的制备方法制，按供试品溶液的制备方法制得血浆乙素供试品溶液得血浆乙素供试品溶液,另取五灵胶囊缺五味子阴性另取五灵胶囊缺五味子阴性样品和供试品溶液的制备方法制得的阴性供试品溶样品和供试品溶液的制备方法制得的阴性供试品溶液。液。 结论：五味子乙素在小鼠体内从吸收到消除历程结论：五味子乙素在小鼠体内从吸收到消除历程10h，五灵胶囊中乙素在小鼠体内从吸收到消除历，五灵胶囊中乙素在小鼠体内从吸收到消除历程大于程大于32h。方剂改变了处方中主要成分在体内动。方剂改变了处方中主要成分在体内动力学参数，使有效成分在血中滞留时间延长，生物力学参数，使有效成分在血中滞留时间延长，生物利用度提高，从而增强了药物的治疗作用。利用度提高，从而增强了药物的治疗作用。 王胜春等王胜春等. 时珍国医国药时珍国医国药. 2019, 15(8)
