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1、 第三章第三章 分子荧光光谱法分子荧光光谱法Molecular Fluorescence Spectroscopy 化学分子荧光光谱法本章主要内容荧光分析法的基本原理1荧光分析仪2荧光法的应用34 自然界存在这样一类物质，当吸收了外界能量后，能发出不同波长和不同强度的光，一旦外界能源消失，则这种光也随之消失，这种光称为荧光。什么是荧光？ 外界提供能量的方式有多种，如光照、加热、化学反应及生物代谢等。通过光照激发产生的荧光称为光致荧光。光致荧光是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光。u 物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产生激发导至发光的现象。u它大致经过吸收、能
2、量传递及光发射三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之间的跃迁，都经过激发态。而能量传递则是由于激发态的运动。u紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光。如磷光与荧光。光致发光3.1分子荧光产生机理1.1.光谱类型光谱类型 荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的分子发分子发射光谱。射光谱。2.2.跃迁类型跃迁类型 分子中原子的电子能分子中原子的电子能级跃迁，伴随振动能级级跃迁，伴随振动能级的跃迁。的跃迁。（1）分子的激发u基态激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射，跃迁一次到位。3.分子的激发与失活单重态：单重态： 一个分子中所有电子自旋
3、都配对的电子状态。一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。三三重重态态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。激发态基态：多种途径和方式，速度最快、激发态寿命最短的占优势。激发态分子不稳定，以辐射或无辐射跃迁的方式回到基态。（2）激发态分子的失活无辐射跃迁无辐射跃迁u振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。激发态分子常常首先发生振动驰豫。u内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。（3）失活的方式u系间窜越：系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的激发态分子的电子自
4、旋发生倒转而使分子的多重态多重态发生变化发生变化的过程。含有重原子的分子中（如的过程。含有重原子的分子中（如I I、BrBr等），等），系间窜跃最常见。系间窜跃最常见。 u外转换：外转换：激发态激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。u荧光：受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发光波长长。辐射跃迁辐射跃迁u磷光：若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发
5、的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长比荧光的波长稍长。磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。l l 2l l 1l l 3l l 2S1T1系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫S2S0能能量量T2内转换内转换发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光外转换外转换振动弛豫振动弛豫4.荧光产生的过程：（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；（2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过无辐射跃迁降落到
6、第一电子激发态的最低振动能级；（3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光：（4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级（1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性的体系才会产生荧光现象。（2）具有一定的荧光量子产率。 5.分子产生荧光必须具备的条件u物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表示：1）荧光与分子结构的关系要求：有强的紫外可见吸收要求：有强的紫外可见吸收u电子跃迁类型 * 的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。u共轭效应 含有* 跃迁能级的芳香族
7、化合物的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光。u取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。 给电子取代基如NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高。而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等吸电子取代基，可减弱分子电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如R、SO3H、NH3 等。u平面刚性结构效应 可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。u荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧
8、光强度（F）与荧光物质的吸光程度发射荧光的能力有关： F = K（I0I） I0 入射光辐射强度； I 透射光辐射强度； K取决于荧光量子产率（）。6. 荧光强度与浓度的关系Lambert-Beer 定律：定律：= 溶液浓度较低时：当入射光的1和I0一定时： F = K c即：在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。这是荧光法定量的基础。（1 1）内部因素）内部因素u自猝灭发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。u自吸收荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。7.
9、影响荧光强度的因素(2）环境因素温度 温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶液在0以下每降低10，荧光产率增加3%，当温度降低至-80 时，荧光产率为100%。 pH值含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。(1).荧光激发光谱和荧光发射光谱u荧光激发光谱（荧光物质的吸收光谱）：保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光
10、物质的激发光谱。8荧光光谱的特征激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。 荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长。u荧光发射光谱使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上，亦即进行扫描，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。200250300350400450500nm荧光激发光谱荧光激发光谱荧光光谱荧光光谱荧荧光光强强度度 激发光波长激发光波长 荧光波长荧光波长蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱2.激发光谱与发射光谱的关系镜像规则荧光光谱的形状与基态
11、中振动能级的分布有关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态中的振动能级的分布。S1S0Stokes位移Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长差值。荧光的波长总是大于大于激发光的波长。这是由于发射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能量。荧光光谱的形状与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能量，产生不同的吸收带，但荧光均是激发态电子回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态而产生的，这与荧光物质分子被激发至哪一能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波长1无关。关于激发光的波长1：决定荧光物质是否能够产生吸收并发射出
12、荧光；能够使荧光物质产生吸收并发射出荧光的激发光的波长并不具有唯一性；在保证激发的前提下，不同激发波长处的荧光发射光谱相同，但荧光强度不同。在进行荧光测定时，须选择激发光波长以保证荧光强度最大。（1）首先，在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意选择几个）对荧光物质进行荧光发射光谱的扫描，从而确定产生最大的荧光强度时的荧光波长2；（2）固定荧光波长2，对荧光物质进行激发光谱的扫描，确定最佳的激发光波长1。3.激发光波长1和2的选择3.2 3.2 荧光荧光荧光荧光( (磷光磷光磷光磷光) )分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计一一一一. . 主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能主要组成及部
13、件的功能主要组成及部件的功能光源光源光源光源氙氙氙氙灯灯灯灯激发单色器激发单色器激发单色器激发单色器样品池样品池样品池样品池光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器发射单色器发射单色器发射单色器发射单色器激发光源(lightsource)样品池(吸收池)(absorptioncell)单色器(monochromator)检测器
14、(detecor)记录及数据处理器(display)仪器的主要部件 能够在紫外-可见光区连续发光，用卤钨灯、氙灯、高压汞灯或激光光源.激发光源卤钨灯卤钨灯高压汞灯高压汞灯高压氙灯高压氙灯样品池紫外紫外紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计 ( (吸收池吸收池吸收池吸收池) )I0It荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计样品池样品池样品池样品池I0ItIF,p滤光片、棱镜、光栅单色器第一单色器选择激发光波长1（250nm的紫外光），称为激发单色器。第二单色器选择(测量)发射光（荧光）波长2,与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。检测器光电池或光
15、电倍增管,光电二极管阵列式检测器问问问问题题题题：荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计与与与与紫紫紫紫外外外外- -可可可可见见见见分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计有有有有何何何何异异异异同点？同点？同点？同点？紫外紫外紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计: :光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制荧光荧光荧光荧光( (磷光磷光磷光磷光) )分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计: :光源光源光源光源样品池样品池样品池
16、样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器 特点：（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高24个数量级；检测下限：0.10.1g/cm-33.3荧光分析方法与应用u荧光辐射的波长比激发光波长长，测量到的荧光频率与入射光的频率不同；u荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光成直角的方向上检测；u荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关，测量用的样品量很少，且测量方法简便。选择性好 凡是会发生荧光的物质首先必须会吸收一定
17、频率的光，但会吸收光的物质却不定会产生荧光。对于某一给定波长的激发光，产生荧光的物质发出的荧光波长也不相同，只要控制荧光分光光度计中激发光和荧光单色器的波长便可得到选择性良好的方法应用范围小能够引起荧光的化学物质较少大多数物质本身不会产生荧光, 一些物质在加入某种试剂后能够产生荧光。一、定性分析 荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标准品对照，看是否一致。FF0cFx F0cx二、定量分析 1.1.标准曲线法：标准曲线法：2. 2. 直接比较法直接比较法 如果荧光物质的标准曲线过零点，且线性良好，如果荧光物质的标准曲线
18、过零点，且线性良好，可用直接比较法测定。可用直接比较法测定。在线性范围内，测定标样和在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，进行比较：试样的荧光强度，进行比较：三、荧光分析法的应用（1、 有机物的荧光分析有机物的荧光分析 u无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近70种。u荧光试剂是具有两个或以上与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。2、 无机元素的荧光分析 OH NSO3NaN=NOH HOON8-8-羟基喹啉羟基喹啉石榴石榴茜素茜素R Ru铍、铝、硼、
19、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；u氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；u铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；u铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；u铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。u荧光成像CellCell标记抗体的荧光纳米颗粒 被识别的目标细胞 目标细胞 3、在生命科学中的应用分子信标具有单碱基错配识别能力的分子信标探针，可以用于检测单细胞内基因的表达、突变等知识拓展知识拓展新型荧光材料新型荧光材料 荧光量子点、荧光纳米簇、荧光聚合物点1.下列说法哪个是错误的？()(1)荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应(2)最长的荧光波长与最长的激发光波长相对应(3)荧光
20、光谱与激发光波长无关(4)荧光波长永远长于激发光波长21.分子荧光过程是()(1)光致发光(2)能量源激光发光(3)化学发光(4)电致发光32. 在荧光光谱中,测量时,通常检测系统与入射光的夹角呈()(1)180(2)120(3)90(4)4542. 荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计的主要区别在于 ( )(1) 光路(2) 光源(3) 单色器(4) 光电倍增管75. 在分子荧光分析法中，以下说法正确的是（ ） （1）分子中电子共轭程度越大，荧光越易发生，且向短波方向移动 （2）只要物质具有与激发光相同的频率的吸收结构，就会产生荧光 （3）分子中电子共轭程度越大，荧光越易发生，且向长波方向移动 （4）非刚性分子的荧光强于刚性分子6. 6. 荧荧光是光致光是光致发发光光现现象。象。荧荧光分光光度光分光光度计计是在与入射光束成直角的方向是在与入射光束成直角的方向测测定定荧荧光，光，这这是是为为了了_ _ 。荧荧光分光光度光分光光度计计通常通常备备有两个有两个单单色器，其色器，其中一个是中一个是_单单色器，其作用是色器，其作用是 _，另一个是，另一个是 _ _ 单单色器，色器，其作用是其作用是 _ _ 。化学分子荧光光谱法
