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1、细胞培养相关技术讲座石春薇2011年12月21日细胞培养Cellculture转染Transfection免疫荧光染色 Immunofluorescencestaining体外培养细胞的特性n培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长，如各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，如各种造血系统肿瘤细胞。细胞培养：模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。基本概念n原代培养原代培养 动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞经体外培养后可贴壁或悬浮生长，在传代之前称为原代培养。n传代传代细胞在培养器
2、皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。细胞系cellline原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（finitecellline）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（infinitecellline）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。细胞株cellstrain从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。通常将具有特殊性质或标志物的细胞群称为细胞株。n美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细
3、胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等nATCC不仅是美国，也是世界最大的细胞库，是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心nATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系，接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费）n武汉大学细胞典藏物中心细胞典藏物中心每代贴附生长细胞的生长过程n游离期n贴壁期n潜伏期n对数生长期n停止期（平台期）游离期：n细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。n10分钟一4小时贴壁期：n细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。n底物：胶原、
4、玻璃、塑料、其它细胞等n血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期n此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。n细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期：n细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：n细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n机制：接触抑制、密度依赖性细胞培养方式n群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层n克隆培养（c
5、lonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。群体培养（左）和克隆培养（右）培养细胞生长的条件n无污染环境:生物安全柜，超净工作台n基质:玻璃，塑料n营养需要:氨基酸，碳水化合物，无机盐，缓冲系统，维生素(商业化合成培养基) npH:7.2-7.4n温度:37，细胞培养箱n气体环境O2CO2:5%CO2+H2OH2CO3H+HCO3-实验准备实验用品：实验用品：n超超净净工工作作台台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸，紫外灯，
6、甲醛熏蒸器nCO2培养箱培养箱n倒置显微镜倒置显微镜n酶标仪、微孔板震荡器n液氮罐n自动双重纯水蒸馏器，纯水仪纯水仪n耗材：培养瓶，吸管，电动移液器，培养板，冻存管n。CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37，5CO2。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14h或者紫外杀菌)。箱内置4-6L蒸馏水，加入100ml饱和硫酸铜溶液，以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发，并抑制真菌污染。实验物品准备常用玻璃器皿清洗n浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（24小时）、小时）、n
7、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干烘干清洁液的配制细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml消化液n胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。n胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。n胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。n胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。n用
8、含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基n培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。n合成培养基：合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。n人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：n多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）n多种金属离子n激素n促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等n各种生长因子n转移蛋白n不明成分n一般说来，含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长
9、一般需加10血清。n常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。n血清的灭活（消除补体活性）：56，30分钟n血清的消毒：过滤除菌抗生素的使用n在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。n通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。n庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定完全培养基的组成n基础培养基80一95n血清5一20n碳酸氢钠2.0g/Ln青、链霉素各100单位毫升细胞培养基本方法（无菌原则）n无菌工作台用75%
10、酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上。n清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用75%酒精擦拭。n操作时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，严格注意无菌操作。细胞传代方法根据细胞生长的特点，传代方法有3种。n悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。n半悬浮生长细胞传代此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。n贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法n吸光培养瓶中的培养液n适量PBS洗净残留培养液n加入
11、1-2ml0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）n静置2-10min（显微镜下动态监测）n加入培养液，终止胰酶消化作用n用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液n吸取1/3细胞悬液，接种于新的培养瓶内n加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内n将后者放入培养箱中培养细胞冻存和复苏n细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。n如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大
12、的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。n复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序n标准程序：当温度在-25以上时，12/min当温度达-25以下时，510/min当温度达-100时，可迅速放入液氮中细胞冻存器n简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。低温保护剂的应用n在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。n常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，
13、降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法n预先配制冻存液：含20%血清培养基n10%DMSOn取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（11065106细胞/ml)n加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期细胞复苏方法n从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化（1分钟左右）。n5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。n低速离心10分钟。n去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细胞计数n血细胞计数板n计数仪Counter血球计数盘一般有二个cha
14、mbers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。培养细胞活力测定n台盼蓝法，trypanblue，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力nMTT法转染(Transfection)n将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能n常特指将质粒或以它们为
15、载体构建的重组子导入真核细胞的过程。转染和转化的区别n转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。瞬时转染和稳定转染n瞬时转染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天。一般来说，在转染后24-96小时内检测和分析结果。n稳定转染，也称永久转染，外源DNA整合到宿主染色体中。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过选择性标记筛选，如抗生素筛选APH（新霉素抗性基因），HPH（潮霉素），TK（胸苷激酶）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。影
16、响转染效率的因素n细胞培养物v健康的细胞v低的细胞代数（50）能确保基因型不变v一定的细胞密度v推荐在转染前24小时内分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能n血清v血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。v有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。nDNA质量v一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂
17、盒，能达到两倍2xCsCl梯度离心以上的纯度效果，使DNA质量得到保证。v对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。6孔板转染实验步骤n转染前18至24小时内接种2105细胞至每孔内（细胞浓度1105/ml，每孔接种2ml，全培养基培养，无抗生素），转染前4小时更换培养基n对每孔细胞，稀释2ugDNA于250ulOptiMEMn对每孔细胞，稀释4ulLipofectamine2000于250ulOptiMEM，室温孵育5minn将步骤2和步骤3中的DNA悬液和Lipofe
18、ctamine2000悬液均匀混匀，室温孵育20min以使DNA-Lipofectamine2000复合物形成n将DNA-Lipofectamine2000complexes(500ul)直接轻柔的滴加到每孔细胞中，轻柔摇匀免疫荧光染色IFn免疫荧光组织（细胞）化学技术，是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质。n直接法：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光
19、染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。n间接法：特异性的一抗和荧光素标记的二抗F-actin直接染色n中文名称：中文名称：鬼笔环肽n英文名称：英文名称：phalloidinn定义：定义：由鬼笔鹅膏真菌（Amanitaphalloides）产生的一种环肽。可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定F肌动蛋白的重要试剂。 GFP TRITC-phalloidin DAPI 07.23.1058,60,6162,64,6580,81,82间接免疫荧光染色n制片n细胞接种n固定n破膜n封闭n染色n封片和荧光显微镜观察制片nChamberslide：腔室玻
20、璃系统nCoverslip：盖玻片（酒精，紫外照射灭菌）n玻片包被：胶原，纤维蛋白fibronectin，整合素intergrin，vitronectin*有些基质蛋白是与细胞内某些信号通路相关的Chamberslide细胞接种n根据不同的研究内容和实验目的，选择不同细胞密度进行接种和生长时间n染色前用温热的PBS洗去培养基（含Ca2+、Mg2+或者不含Ca2+、Mg2+的PBS的选择）固定n根据需要选择适当的固定剂固定细胞，如4%多聚甲醛固定15分钟n多聚甲醛宜现用现配，或配好后分装-20冻存，用之前37复温n固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4保存3个月nPBS洗涤35min破膜或通
21、透n在检测细胞内抗原表位的时候需要对细胞进行通透处理，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白n如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透n如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。n常用的通透剂是去垢剂，如Triton，NP-40，以及Tween20，Saponin，Digitonin和Leucoperm等。nTriton和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。TritonX-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于
22、细胞膜相关抗原。n后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。封闭nPBST+1%BSA，室温，1h抗体孵育n为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。n二抗是荧光抗体，因此孵育时注意避光n一抗室温孵育1h，PBST洗涤35mimn二抗室温孵育1h，PBST洗涤35mimn核染：可在PBST第二次洗涤时在PBST中加入核染料如DAPI（储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.51g/ml）封片及荧光观察n为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片（mounting）处理n常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂n商业化的Mountingbuffer有的已含有DAPI，染核在封片时即完成抗体选择nGFP+TRITC-目标蛋白+DAPInFITC-目标蛋白1+TRITC-目标蛋白2+DAPI，应注意目标蛋白1和2的荧光标记偶联2抗的匹配GFPMouse-cateninDAPIMouse-cateninRabbitECSM2DAPI
