第五章柠檬酸发酵工艺

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1、v 几乎所有含淀粉淀粉和可发酵性糖类可发酵性糖类的农副产品，都可作为柠檬酸发酵原料。由于各种原料中非糖类杂质的组分和量的不同，因此需要采用不同的理化方法进行预处理预处理，以适应柠檬酸生产菌的发酵条件。第一节第一节 发酵原料的预处理发酵原料的预处理v所谓预处理预处理，主要是指除杂、粉碎、液化、除杂、粉碎、液化、过滤等处理程序过滤等处理程序。至于采用何种程序和方法则取决于选用的原料品种及其内在质量。例如:薯类和谷类原料的除杂是利用机械或人工除去混入其中的固体杂质，如金属物、土、石、皮、芯、粒、霉变块等杂物。而糖蜜的除杂则是利用化学方法除去溶解于糖蜜中的杂质。又如，粉碎和过滤是根据原料的特性来选择适

2、用的机械设备即可解决。淀粉的液化和糖蜜的除杂则是讨论的重点。一、淀粉质原料的液化（一）液化的基本概念 （二）酶法液化淀粉的方法 （三）柠檬酸工业用的喷射液化工艺（四）液化方法比较 （一）液化的基本概念（一）液化的基本概念 利用化学催化剂或生物催化剂，在具有一定量的水和一定的温度条件下，使淀粉分子断裂而变成较小分子，使淀粉糊的黏度显著下降而成为流动性较好的流体，工业上称为“淀粉液淀粉液化化”。淀粉液化的方法1、酸法：以强酸为催化剂，高温、高压条件下进行，液化程度较难掌握2、酶法：采用-淀粉酶，在中性溶液中，常温、常压条件下进行，液化程度容易掌握。此法适应于柠檬酸工业。3、机械液化机械液化：不使用

3、催化剂，使淀粉浆喷射入一个旋转的蒸汽加热器中，受热淀粉立即糊化，在强烈的机械剪力的作用下，使淀粉分散。不破坏淀粉颗粒表面和结晶结构。v 淀粉的液化实质上是在淀粉颗粒因受热吸水膨胀、糊化破坏了其结晶结构之后进行的，这是因为淀粉颗粒对于酶作用的抵抗力较强，很难直接液化。例如：细菌-淀粉酶水解淀粉和水解糊化淀粉速度比为1：20000，因此淀粉乳糊化是酶法液化的第一个糊化是酶法液化的第一个重要的步骤重要的步骤。 淀粉在常温下不溶于水，但当水温至5353以上，淀粉的物理性能发生明显变化。淀粉在高温下溶胀、分裂形成均匀糊状溶液的特性，称为淀粉的糊化糊化。生淀粉在水中加热至胶束结构全部崩溃，淀粉分子形成单分

4、子，并为水所包围而成为溶液状态。淀粉糊化温度必须达到一定程度，不同淀粉的糊化温度不一样，同一种淀粉，颗粒大小不一样，糊化温度也不一样，颗粒大的先糊化，颗粒小的后糊化。 v淀粉被糊化后，体积膨胀很多，粘度增强、流动性很差、搅拌困难、影响传热，难以糊化均匀。v因此淀粉质的柠檬酸发酵培养基在灭菌前必须先进行液化，使料液的流动性好，有利于料液的输送、灭菌完全、发酵初期的生长、易于糖化、提高产酸率和淀粉的利用率。发酵成熟醪过滤性好、也有利于发酵罐搅拌功率的下降。v-淀粉酶是一种金属酶，Ca2+使-淀粉酶保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性除Ca2+外，其它二价碱金属离子Ba2+、Mg2+等也有维

5、持-淀粉酶活性的作用v但耐高温-淀粉酶在Ca2+浓度很低时，稳定性就很好。在实际使用时，不需添加Ca2+等稳定剂。 （二）酶法液化淀粉的方法（二）酶法液化淀粉的方法按工艺条件工艺条件分类：间歇液化法、半连续液化法 、连续液化法 ；按设备条件设备条件分：罐式、管式、喷射式；按加酶方式加酶方式分：一次、二次、三次加酶多段液化工艺。间歇液化法间歇液化法又称为直接升温液化法直接升温液化法。此法最为简单，但是液化效果最差。具体操作如下：在淀粉浆罐中将物料调成浆乳，调节pH和加钙离子，搅拌升温到50左右，加入需要量的-淀粉酶，继续升温到80-85，恒温保持30-60min，至碘不显蓝色为止，然后升温至沸沸

6、腾。使蛋白质凝固，酶完全失活，移后续工段处理。此法与柠檬酸行业常用的罐内液化、灭菌合一的工艺相类似。由于柠檬酸生产没有深入研究液化对糖酸转化率的影响，因而操作更加粗放，但此法对淀粉的液化不均匀完全。半连续液化半连续液化又称高温液化法高温液化法，是针对间歇液化法存在的缺陷而进行改进的工艺。操作是在一只装有中间套筒的锥底液化罐中进行，其目的目的是控制液化料液先进先出，力求淀粉受热和酶作用时间一致。实践证明，虽然液化效果明显优于直接升温法，但仍有液化不均现象。连续液化法连续液化法又称喷射液化法喷射液化法。此法被认为是最好的淀粉液化工艺。喷射液化法可以一次加酶一次喷射，也可以二次加酶二次喷射，主要取决

7、于所用原料性质和要求液化程度。柠檬酸工业用于玉米玉米粉的液化是采用二次加酶二次喷射工粉的液化是采用二次加酶二次喷射工艺。艺。喷射液化是在喷射器中进行瞬间液化，喷射液化器有高压蒸汽喷射器，其结构是根据文丘里管的原理设计的。文丘里管，是新一代差压式流量测量仪表，其截面起初逐渐缩小而后逐渐扩大到原来尺寸的缩放管。以能量守恒定律伯努力方程和流动连续性方程为基础的流量测量方法。喷射液化的过程喷射液化的过程当高压蒸汽通过喷嘴，使喷射器的内腔形成真空，混有-淀粉酶的淀粉乳，在此力的引吸和泵的推动力作用下，呈薄膜状进入喷射器内腔，随即与蒸汽混合形成湍流，料温骤升至100-120，瞬间完成了糊化、液化，淀粉糊粘

8、度迅速下降，形成流体从喷射器下部出料口排至保温系统，恒温90维持30-60分钟，达到需要的液化程度。喷射液化设备流程图喷射液化设备流程图喷射液化的优点：喷射液化的优点：液化均匀完全、已切断的淀粉连不易重新聚合、蛋白质类杂质凝固好，过滤性能佳、设备体积小、可连续化操作。 喷射液化最适合用耐高温-淀粉酶。但这类喷射器，要求在稳定的0.40.6MPa的饱和蒸汽条件下操作。HYW型低压蒸汽喷射液化器，其特点特点是提高料液的输送压力作为推动力，替代了蒸汽压力。因此，可以在较低的蒸汽压力下液化，也可用过热蒸汽液化，因而减少了喷射器的振动和噪声。第一次喷射温度为105，但若用二次喷射液化工艺，则第二次喷射的

9、温度要求达到120-145，因此供气压力不能低于0.5MPa(表压）。（三）柠檬酸工业用的喷射液化工艺（三）柠檬酸工业用的喷射液化工艺玉米浸泡粉碎脱胚原浆调浆PH值6.47.0 一次喷射液化温度为9597 层流罐二次喷射液化温度为140145 闪冷中温液化温度在90左右调节PH 4.85.2 过滤去渣稀石灰水稀石灰水稀稀HCl或或稀稀H2SO4 用玉米发酵柠檬酸，采用HYW喷射液化器，二次加酶液化工艺：具体操作具体操作：用温水将玉米粉调成浆乳，加稀石灰水调整pH至6.4-7.0，加需要酶量的2/3，备用；通蒸汽进喷射器、保温系统，待出口温度达90以上时，打开浆料回流阀，开始将浆料泵入喷射器进行

10、液化，出料口温度达到95-97时，关小回流阀，料液进入层流罐，在90-95条件下，维持30-60分钟；然后进行二次喷射，料温达到140-145，进入维持罐维持3-5分钟后，经闪冷器迅速降温后落入二次液化罐中，加余下的1/3淀粉酶，在90 左右维持30分钟，碘检查无蓝色反应，然后用稀酸调pH至4.8-5.2，趁热过滤去渣。调整好氮源之后，经连消或实消后发酵。玉米粉发酵柠檬酸二次喷射液化工艺流程图玉米粉发酵柠檬酸二次喷射液化工艺流程图 二次加酶二次高温喷射工艺有利于蛋白质类杂质进一步凝固，并可使玉米皮松软，附着其中的淀粉大部分可在二次液化时被利用。喷射液化料液中不溶性淀粉颗粒和过滤性能优于升温法。

11、喷射和升温液化法过滤性质比较喷射和升温液化法过滤性质比较项目项目喷射液化喷射液化升温液化升温液化滤液葡萄糖值/%97.196.9滤液比旋光度D2056.757.2滤饼不容物含量/%0.72.67过滤速度/(m2h)630183（四）各种液化方法比较（四）各种液化方法比较液化方法液化方法基本条件基本条件优点优点缺点缺点酸法液化淀粉乳浓度30%，pH 1.82.0，液化温度135。10min液化DE值1518%适合任何精制淀粉，所得的糖化液过滤性能好有副反应生成有色物及复合糖类，淀粉转化率低，糖液质量差，糖化液中含有微量醇和不溶性糊精酶法液化1、间歇液化法（直接升温液化法）淀粉乳浓度30%，pH6

12、.5，Ca2+ 0.01 mol /L,液化温度85 90，3060min液化DE值1518%设备要求低，操作容易液化效果一般，经糖化后的糖化液过滤性差，糖浓度低2、半连续液化法（高温液化法）3、连续液化法（喷射液化法）淀粉乳浓度30%，pH 1.82.0，液化温度90。3060min液化DE值1518%淀粉乳浓度30%，pH6.5，液化温度95140，10 120min液化DE值1517%设备要求低，操作容易，效果比直接升温好液化效果好，液化液清亮、透明，质量好，葡萄糖的收率高料液容易溅出，操作安全性差，蒸汽用量大，液化温度未达到高温酶的最适温度，液化效果一般，糖化液过滤性能差机械法旋转蒸汽

13、加热器，喷射温度大于160，糊精的聚合度200 300液化液较有利于糖化酶结合，糖化后的糖化液DE值可达99%，适合于各类淀粉工艺过程有待于进一步完善二、糖蜜原料的预处理1 1黄血盐法黄血盐法 2 2离子交换法离子交换法 3 3其他处理方法其他处理方法（一）黄血盐法（一）黄血盐法黄血盐性质黄血盐性质 黄血盐化学名称为亚铁氰化钾K4Fe(CN)6，浅黄色，片状八面晶体。黄血盐作用黄血盐作用（1）与Fe3+反应形成普鲁士蓝沉淀，可除去糖蜜中的Fe3+等离子。 黄血盐还可与其他金属离子如Cu2+、Zn2+、Mn2+等形成沉淀而除去之。故用黄血盐处理过的糖蜜中的灰分及磷的含量均有明显的降低。这是黄血盐

14、处理糖蜜所起的主要作用黄血盐处理糖蜜所起的主要作用。（2）黄血盐在弱酸性培养基中能与蛋白质形成不容性化合物。 故黄血盐也能除去少量蛋白质，但此反应是在弱酸性条件下进行的，如果酸性太强，特别是受热后黄血盐会分解。（3）黄血盐在水中可能发生部分水解，使溶液呈碱性。（4）在中性和碱性条件下，有氧存在时，黄血盐的水解产物Fe(CN)64-会形成Fe(OH)3沉淀。 因此，用黄血盐处理糖蜜时，必须注意控制pH，一般认为在6.5-6.8微酸性条件下，更有利于除去糖蜜中对柠檬酸发酵有害成分。v关于黄血盐处理糖蜜后能促进柠檬酸的产酸问题，过去认为Fe2+是黑曲霉三羧酸循环中乌头酸酶的激活剂，乌头酸酶活力高不利

15、于柠檬酸积累，因此要除去Fe2+，故黄血盐能促进产酸。v现在看来其作用机理并非如此简单，在有些不受Fe2+影响的菌株，黄血盐也同样有利于柠檬酸积累，所以在柠檬酸发酵过程中，黄血盐对糖蜜所起的作用可能是多方面的。（二）离子交换法（二）离子交换法 离子交换树脂可以除去糖蜜中对柠檬酸发酵有害的金属离子。稀释后的糖蜜可通过强酸性阳离子交换树脂强酸性阳离子交换树脂处理，使糖蜜中含铁量下降。其他金属离子也会被除去。必要时也可再经过一次阴离子交换树脂阴离子交换树脂处理。离子交换法处理过的糖蜜，在配制发酵培养基时应添加黑曲霉生长所必需的无机盐类。通过阳离子交换树脂处理的糖蜜PH偏酸性，需加碱调整。（三）其他处

16、理法先用含盐酸的磷酸三钙处理，再用葡聚糖处理甘蔗糖蜜，能获得很好的效果。用酸（硫酸或磷酸）和碱（石灰乳）交替处理，可以除去糖蜜中可沉淀物质。 这些方法都有利于提高柠檬酸的产酸水平。第二节第二节 柠檬酸深层发酵工艺柠檬酸深层发酵工艺v一、黑曲霉柠檬酸发酵条件控制1 1营养要求营养要求 2 2温度控制温度控制 3 3PHPH控制控制4 4接种量和方式接种量和方式5 5溶氧量的控制溶氧量的控制(一)营养要求 黑曲霉柠檬酸生产菌是化能异养微生物，只能利用有机碳源； 要使黑曲霉柠檬酸产生菌大量生成和积累柠檬酸，必须控制营养物质的供给，使菌体生长受限制，处于半“饥饿”和代谢失调状态。 依据柠檬酸发酵机制，

17、黑曲霉大量生成和积累柠檬酸的基本条件，是提供高浓度的提供高浓度的葡萄糖和充足的氧葡萄糖和充足的氧。 碳源碳源 碳源除了合成细胞物质和提供维持生命活动的能量外，主要用于合成代谢产物。 从柠檬酸生产角度看，葡萄糖、蔗糖、糊精是良好的碳源，高糖浓度是柠檬酸发酵的高糖浓度是柠檬酸发酵的一大特征一大特征。工业上为降低生产成本，多采用廉价的甘薯、玉米、小麦及其淀粉、糖蜜等。氮源氮源 氮源的作用是合成细胞物质和代谢调节，这是因为细胞中铵离子浓度的升高，能解除ATP和柠檬酸对关键酶磷酸果糖激酶的反馈抑制，使EMP代谢流增强，有利于柠檬酸生成与积累。 一般柠檬酸发酵采用的氮源有：（1）生理酸性氮生理酸性氮：（N

18、H4)2SO4、（NH4)3PO4、NH4Cl、（NH4)2CO3等；（2）生理碱性氮生理碱性氮：Ca（NO3）2、Mg（NO3）2、 NaNO3、KNO3等； （3）两性氮两性氮：NH4NO3; (4)有机氮有机氮：麸皮、米糠、蛋白胨、氨基酸、尿素等。当有机氮和无机氮同时存在时，黑曲霉首先利用无机氮；在无机氮中，黑曲霉偏好生理黑曲霉偏好生理酸性无机氮酸性无机氮，这是因为生理酸性氮中的铵离子被利用后，使培养基变酸，可以使发酵中的黑曲霉生长阶段结束，进入产酸阶段，PH下降到较低水平有利于柠檬酸的积累；所以铵盐既可以调节代谢，也可以控制pH。如果原料中有机氮含量过分丰富，菌生长代谢加快，对缩短发酵

19、周期有利。但是不利于柠檬酸积累、产酸率不高。这就是不能利用含蛋白质丰富的粗玉米粉直接发酵的原因。无机盐无机盐 无机盐是构成微生物生命活动不可缺少的物质。在柠檬酸发酵中，有的构成菌体，有的促进代谢，有的促进产酸等，因此对黑曲霉的生长和柠檬酸发酵具有重要的作用。 无机盐对柠檬酸发酵影响是十分复杂的，它因菌种、原料、生产方式不同而不同。(二)温度控制 黑曲霉属嗜热微生物，最适生长温度为3337。 一般认为，深层液体发酵中，温度低于28，导致长菌和产酸缓慢；高于37，导致菌体和杂酸形成过量，呼吸作用加强，影响糖酸转化率。(三)PH控制 黑曲霉柠檬酸生产菌生长发育适宜pH37。 一般认为，菌种生长期pH

20、维持在4.5；产酸期的最适pH为2.03.0。pH3.0以上容易产生草酸，5.0容易生成葡萄糖酸，3.0以下是柠檬酸积累的条件。(四)接种量和接种方式接种量接种量：接种量大小直接决定于进入培养系统的孢子数量。在一定范围内，孢子接种量与产酸数量成正比，随着孢子接种量的增加，柠檬酸产率也提高。接种方式接种方式：孢子直接接种和菌丝体（种子罐）接种。 发酵罐试验中用同样数量的孢子进行孢子接种和二级培养后的菌丝接种，所得结果证明：孢子接种虽然初期产酸缓慢，但发酵24h后，生酸速率明显提高，而且有后劲，最终产酸率高于菌丝种子。菌丝种子接种时，在同样接种量的条件下，产酸水平随着营养成分加高而提高。 另外，菌

21、丝接种时，如果接入发酵罐的种子内存在杂菌，这些杂菌从受到低pH抑制的种子培养基环境，恢复到自然pH环境的发酵液中，正好适宜多数杂菌繁殖。若生产菌株不能迅速产酸以降低pH，染菌几率则增大。事实证明采用孢子接种能收到良好的效果。(五五)溶解氧的控制溶解氧的控制v黑曲霉柠檬酸生产菌是严格的好氧微生物，不管生长、繁殖、还是产酸均需要氧。v黑曲霉生长、繁殖所需的能量是通过呼吸作用获得的，即葡萄糖彻底氧化为二氧碳和，产生大量的ATP(约38个），此过程需要大量的氧；乙酰CoA和草酰乙酸缩合生成柠檬酸过程中要引入一个氧原子，显然氧也是柠檬酸合成所必需的底物之一。v 黑曲霉的产酸速率几乎与溶氧分压成正比。低溶

22、氧下产酸能力会降低甚至丧失，而且很少能重新恢复。v因此柠檬酸发酵中，必须供给充足的氧。黑曲霉生长期溶氧分压不得低于1.8KPa，产酸期溶氧分压不得低于3.2KPa。 0204060800.40.81.21.6氧氧气气消消耗耗速速率率发酵时间发酵时间由图所知，菌体生长过程呼吸作用消耗大量氧气，当菌体生长接近对数生长期时（2024h），需要氧达到最高峰，随后菌体生长缓慢，进入产酸期（2430h），氧的消耗率降低，并持续到发酵终了。v根据这个原理，目前国内采用的二级通风量有不足之处，一是菌体生长后期风量不足，影响菌体充分生长；二是产酸后期通风往往超过需要，造成动力浪费。v同时过量的通风还可能降低发酵

23、液中的二氧化碳的浓度，影响二氧化碳固定化反应，造成碳源的损失，从而降低糖-酸的转化率。二、柠檬酸深层发酵工艺流程二、柠檬酸深层发酵工艺流程原料原料粉碎粉碎培养基培养基 配制配制实罐液化实罐液化原始菌种原始菌种环境空气环境空气预处理预处理 连消连消实罐灭菌实罐灭菌试管斜面试管斜面过滤过滤麸曲菌种麸曲菌种空压机空压机种子罐种子罐空气净化空气净化 系统系统发酵发酵无菌空气无菌空气成熟发酵醪成熟发酵醪去柠檬酸提取工段去柠檬酸提取工段三、薯干原料发酵工艺三、薯干原料发酵工艺（一）生产菌种 当前生产上使用的具有代表性菌种是：当前生产上使用的具有代表性菌种是：Co827、-130、-144-130等。等。（

24、二）生产工艺条件（二）生产工艺条件1、碳氮比 薯类原料由于产地等客观条件不同，其组织中各种物质含量各异，尤其蛋白质含量差异较大。一般甘薯干蛋白质含量在6%7%，用于现有生产菌种，不需要调节含氮量。 木薯干含蛋白质仅1.7%2.6%，则需要用玉米粉、米糠、麸皮等有机氮源和适量的无机氮源来补充。2、温度、温度 黑曲霉发酵柠檬酸温度控制在2830时，柠檬酸产率最高，发酵速率也最快。 为了节约降温能耗，我国在选育薯干发酵菌种时，有意地提高驯育温度，故可在37条件下发酵。 在正常情况下发酵过程中的柠檬酸、糖、pH、草酸的消长如下图所示：薯干原料正常发酵过程中各参数变化情况薯干原料正常发酵过程中各参数变化

25、情况3、pH 发酵的最适pH，分为起始和过程中的pH，实验证明：薯干发酵培养基灭菌前将pH降到4.0，灭菌后pH为5.0时，发酵效果最好。4、控制生物量、控制生物量 正常发酵液中生物量应控制在1220g/L，过多的生物量会影响氧的溶解，增加发酵罐搅拌功率，且消耗了大量的葡萄糖。5、严防缺氧、严防缺氧 柠檬酸发酵是典型的好氧发酵，对氧十分敏感。当发酵进入产酸期时只要有几分钟的缺氧时间，就会对发酵造成严重影响。 缺氧、供氧不足、溶氧不良都会使菌体发生异状变化，产酸大幅度下降，有时发酵液会产生黄色荧光色素，非正常与正常发酵过程的情况对比，如下图所示：6、孢子接种数与菌球体的特征、孢子接种数与菌球体的

26、特征 柠檬酸发酵液中的菌球体，是由一个或数个孢子在生长过程中物理作用而形成的。 一般来说，菌球体越小、越多，产酸就越高，菌球体越小、越多，产酸就越高，发酵周期也短发酵周期也短。接种孢子数与菌球体量（个/mL)成正比，与菌球体直径成反比。孢子数不足，菌球体大或大小不匀。 薯干原料深层发酵大罐菌球体直径1000个/mL，而且表面毛糙的菌球体为佳。7 7、通风量、通风量 柠檬酸发酵通风量相对来说并不大。通风量不是一个固定值，应根据培养基的质量、菌种生长需要、发酵罐的结构及其搅拌浆叶的型式和周线速度以及罐压而定。 一般规律是发酵罐容积越大、培养液层越厚、发酵罐容积越大、培养液层越厚、搅拌转速越快则通风

27、量越小搅拌转速越快则通风量越小。通风量过大菌体过早进入衰老期，也不利于CO2固定，且动力浪费过多。氧的溶解与搅拌转速、罐压成正比关系；与温度和培养基粘度成反比关系。 在同等条件下，一般通风量：机械搅拌式发酵罐喷环式搅拌发酵罐3.0的时间延长，有利淀粉的充分糖化，后期产酸较快，后劲较足，则残糖较低；减少一次接种操作也就减少一次染菌机会，同时节约了相应设备的投资及能耗。孢子直接接种的缺点孢子直接接种的缺点孢子萌发期较长，相对延长了发酵周期，易污染，同时增加了孢子在发酵罐生长期的搅拌功率消耗，增加了生产成本；孢子接种量大，因为孢子接种量大，则发酵液中菌体成球数量多，菌球直径小，发酵速度快，产酸水平高

28、，发酵周期相对缩短；发酵前期，容易染菌，一旦发现染菌，或菌种出现质量问题，则培养基必须重新灭菌；（b）菌丝体（种子罐）接种）菌丝体（种子罐）接种 黑曲霉孢子先经种子罐培养后得到产酸型液体菌丝体，然后再接入发酵罐的接种方式。 种子罐接种的优点种子罐接种的优点：缩短生产罐的发酵时间，从而提高了设备利用率。虽然增加了种子罐，但种子罐总容量小，总投资少；种子培养质量容易控制，如果直接接种孢子到生产罐中，相当于在生产罐中进行种子培养，由于受发酵条件制约，生产罐中的营养物不能过多，往往不能满足孢子发芽和生长的需要，因此种子发育缓慢。而在种子罐中可以添加适量营养物以促进种子快速发育，并可提高其产酸能力；总能

29、耗降低，因为种子罐单独培养时，种子罐小，通气、搅拌的动力消耗远低于生产罐培养；有利于防止杂菌污染。独立的种子培养车间比发酵车间小得多，环境卫生容易控制。在种子罐中单独培养时，接入孢子的密度约是直接接入生产罐的10倍，加上种子发育快，受感染的可能性大大降低。而且，生产罐接入菌丝体以后，很快进入产酸阶段，受感染的可能性也大为减少。如果种子培养发生问题（菌种退化或染菌）在种子罐中发现，损失比主发酵罐中发现小得多。种子罐接种的缺点种子罐接种的缺点：菌丝接种产酸低于孢子直接接种；菌丝接种时，如果接入发酵罐的种子内存在杂菌，这些杂菌从受到低pH抑制的种子培养基环境，恢复到自然pH环境的发酵液中，正好适宜多

30、数杂菌繁殖。若生产菌株不能迅速产酸以降低pH，染菌几率则增大。9、斜面培养基与菌种、斜面培养基与菌种传代的关系代的关系 斜面培养基浓度过高或营养过剩则斜面下端不生孢子或孢子生的细小、菌膜增厚出现皱纹。反之则菌膜变薄、孢子细小。这种斜面菌种属不良菌种。 薯干发酵菌种，用薯干粉察氏斜面培养基代替麦芽汁斜面培养基效果较好。10、麸曲三角瓶菌种的培养工、麸曲三角瓶菌种的培养工艺 我国仍沿用三角瓶麸曲培养生产菌种孢子的工艺，这是我们发酵方面落后于国外用干孢子培养器培养干孢子的关键工艺。 麸曲培养基需用大片的白麸皮，质轻、蓬松、含淀粉量少，有利于孢子繁殖。11粘度粘度 在柠檬酸深层发酵过程中，粘度过高，会

31、导致发酵液的传热性下降，溶氧效率降低，液体流动性差，搅拌动力消耗增加等不利影响，营养物质的运输也会受阻，甚至发酵不能进行。影响粘度因素有：1、溶质的量，多数溶质会使粘度升高；2、气体（O2、CO2等）含量，气体使粘度降低；3、菌体浓度、性质及形态，菌体浓度高和扩散性生长使粘度升高，但菌体其他性质（如表面电荷、表面吸附物）也会影响到粘度；4、温度，温度上升一般会使粘度下降。12、促、促进发酵的其他因素酵的其他因素v种子罐培养基种子罐培养基配方：薯干粉浓度高比浓度低好，最高可到22%；添加0.5%硫酸铵、0.3%尿素或0.3%硝酸铵较好；v发酵培养基酵培养基：发酵培养基中不需要添加促进剂和微量金属

32、离子。氮量要控制适当，过多的氮源则导致菌体“疯长”而产酸下降。四、玉米原料发酵工艺四、玉米原料发酵工艺（一）工艺路线 目前我国玉米发酵柠檬酸基本上有4条工艺路线，但应用最多的是玉米干磨去渣发酵工艺。（二）工艺中的几个关键问题 1、菌种驯化 采用薯干原料的菌种比较粗放，用玉米粉培养基将现有菌株驯化，不难得到优良菌株。2、玉米粉的液化 已知谷类淀粉比薯类淀粉较难液化，谷物直接液化难度更大。因此，要用耐高温-淀粉酶，二次喷射液化。3、控制好碳、氮比 发酵培养基中蛋白质含量控制在0.2%0.4%之间，目前除玉米深加工工艺外，其他均以添加玉米滤渣，或留出部分不过滤的液化液来平衡碳氮比，一般在10%20%

33、之间。（三）其他问题 玉米液化液发酵的其他操作和注意事项与薯干粉发酵基本相似。由于培养基含渣少，可采用“连消”工艺，对生产更有利。 玉米发酵液颜色浅，杂质含量比薯干少，容易净化，产品洁白而光亮。（四）玉米粉直接发酵 新菌种ASP.HZ528具有适应高氮源发酵的性能，对金属离子不敏感，直接玉米粉发酵产酸比Co827高。第三节第三节 柠檬酸表面发酵工艺柠檬酸表面发酵工艺工艺简介工艺简介 表面发酵工艺设备投资表面发酵工艺设备投资少，动力消耗低，原料粗放、少，动力消耗低，原料粗放、廉价，生产易控制，全部自廉价，生产易控制，全部自动化操作。动化操作。一、表面发酵柠檬酸生产用的微生物一、表面发酵柠檬酸生产

34、用的微生物（一）生产菌种 在工业生产上应用的菌种，均为黑曲霉。如黑曲霉UV-6、黑曲霉3939和黑曲霉川柠12号。 表面发酵工艺国内外普遍采用干孢子接种，这是保证发酵稳定的重要技术措施。（二）干孢子的制备（二）干孢子的制备1.1.干孢子制备工艺流程：干孢子制备工艺流程：菌种菌种沙土保藏沙土保藏试管斜面培养试管斜面培养（30）培养器液体培养培养器液体培养（ 3235 ）干燥干燥（ 4050无菌空气无菌空气 ）干孢子收集干孢子收集质量鉴定质量鉴定合格成合格成品保藏品保藏使用前质量检查使用前质量检查合格合格作为表面发作为表面发酵用种子。酵用种子。2、制、制备干干孢子的培养基子的培养基 干孢子质量和产

35、量与培养基的组分有很大关系。孢子培养基对产酸能力影响不明显，但对孢子生成量有较大区别。要获得优质高产的干孢子需要对不同菌种进行最适孢子培养基的研究。 国内一些工厂黑曲霉UV-6菌的培养基采用糖蜜为碳源，成本低，干孢子收集量较多。但要注意糖蜜质量的变化，一般糖厂生产期后期的糖蜜不用于干孢子制备。3、干孢子制备的主要设备（a）可拆卸式铝制培养盘 铝盘可为椭圆形或长方形，面积可随干燥柜大小而定，高度约0.12m，在离底部3cm高出平放一筛板。液层高度5cm，孢子先接种于大三角瓶，在无菌条件下移入培养盘，置3235培养至孢子成熟，一般培养56d。 （b）孢子收集器 基本上按吸尘原理自行加工孢子收集器。

36、干孢子液体培养成熟后，将铝盘微微倾斜，把盘内培养液除去，然后置培养盘于干燥柜中，两端与无菌空气进出管道相连，通入40 无菌空气，干燥34h,在无菌条件下使用孢子收集器进行孢子收集。2.2.制备干孢子的培养基制备干孢子的培养基3.3.干孢子制备的主要设备干孢子制备的主要设备干干 孢孢 子子 培培 养养 和和 收收 集集 装装 置置1 1斜面培养斜面培养 2 2三角瓶培养三角瓶培养 3 3培养盘培养盘 4 4无菌空气无菌空气 5 5培养柜培养柜 6 6接种箱接种箱7 7真空胶管真空胶管 8 8干孢子收集器干孢子收集器 9 9一级截留器一级截留器 1010二级截留器二级截留器 1111真空泵真空泵（

37、三）干孢子质量鉴定（三）干孢子质量鉴定产酸率产酸率 根据生产所用原料及发酵工艺条件进行三角瓶培养，求得产酸率，将产酸率在50%以上的干孢子混合成5g左右的样品，再进行发酵试验，所求得的产酸率为该批干孢子的产酸标准。出芽率出芽率 经加热干燥收集的干孢子，进行圆滴培养，在镜检下计算出芽的孢子占总孢子的百分比，一般出芽率在90%以上者为合格。纯度率纯度率 所得干孢子分别在霉菌培养基和酵母培养基上进行平板分离，检查是否有其他菌落生长，纯的菌落应占总菌落数的99%以上为合格。 二、表面发酵工艺二、表面发酵工艺（一）表面发酵设备1、发酵盘 发酵盘有不锈钢盘、高纯度铝盘或木盘涂大漆。铝盘对柠檬酸发酵有促进作

38、用，但高纯度的铝材料来源缺少；木盘成本低，对产酸无甚影响，但木材的干燥程度和木盘的加工质量不易保证；木盘和铁盘涂料容易脱落。 因此，在资金允许的情况下，以不锈钢为宜。2、发酵室 发酵室要具有良好的通风设备，保证温度、湿度和风量能满足不同阶段的发酵要求，并且保证无菌，一般要求达到：（a）墙面和地面用瓷砖衬里，保证室内清洁，易于清扫，不长霉；（b）房屋采用保温建筑结构，屋顶装有排风扇，防止长霉。地面略向中部倾斜，为避免积水，污水由水封孔排入下水道。v 每个发酵室装有两排发酵架，每架放10个发酵盘，两盘架间距1.5m，离墙0.8m，盘层间距0.250.3m，底层盘距地面不小于0.5m，顶层盘距天花板

39、约0.4m。 v 每个盘架一端装有通风管道，并在每个盘上有有通风口，供干孢子接种和发酵通风用，另有一条通风管在发酵室底部，慢速进风，以调节室内空气。3、通风系统 浅盘发酵的通风系统，除要求供给无菌空气外，还需保证可自由调整温度和湿度，其流程如下所示： 室外新鲜空气 混合室 油过滤器 蒸汽加热器 喷淋室 鼓风机 二次电加热 空气过滤器 发酵室 排风 回风回风回风（三）发酵工艺（三）发酵工艺 表面发酵工艺总的趋向是采用高液层。1一般发酵 根据菌种的产酸能力，液层一般可在812cm，一次性发酵直至终了。2、置换法 一次发酵终了，将酸液从菌膜下排走，然后在菌膜下通入无菌水，静置1h，待菌膜中酸液渗入水

40、中，排放洗水至贮酸桶。再通入置换液，液层视菌种生产能力而定，一般在68cm。3、添加法 有两种方法：一是发酵分菌膜生长期和产酸期，生长期的液层3cm左右，待菌膜形成，防去菌膜下的生长液，通入产酸培养基，液层在1012cm，一直发酵终了。 另一种添加工艺是在液层为68cm的一段发酵基础上，待产酸进入高峰期时通入34cm产酸培养基，总液层达912cm，发酵至终了。四、表面发酵工艺优缺点四、表面发酵工艺优缺点优点：优点：1、设备简单、投资少、见效快；2、操作简便，关键要装配能严格控制温度、湿度和风量的无菌通风系统和采用干孢子质量预测规程，发酵稳定，不会产生杂菌大面积污染问题3、能耗低；4、发酵液和菌体分离容易。缺点缺点： 设备占地面积大，发酵时间长，生产能力低，发酵室清洗劳动强度大。 The The endend