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1、22.2动物物细胞融合与胞融合与单克隆抗体克隆抗体学习导航学习导航1.掌握掌握动物物细胞融合技胞融合技术2.理解理解单克隆抗体技克隆抗体技术。 重、重、难点点3.了解了解动物物细胞融合和胞融合和单克隆抗体技克隆抗体技术的的应用。用。 重点重点新知初探思维启动新知初探思维启动一、一、动物物细胞融合胞融合概念概念_动物物细胞胞结合形成一合形成一个个细胞的胞的过程，也称程，也称为细胞胞杂交交条件条件需要聚乙二醇需要聚乙二醇(PEG)、_或或电激等激等诱导因素因素原理原理细胞膜的流胞膜的流动性性两个或多个两个或多个灭活的病毒活的病毒结果果形成具有原来两个或多个形成具有原来两个或多个细胞胞遗传信信息的息
2、的单核核细胞，称胞，称为_意意义突破了突破了_方法的局限，使方法的局限，使远缘杂交成交成为可能。成可能。成为研究研究细胞胞遗传、细胞免疫、胞免疫、肿瘤和生物新品种培瘤和生物新品种培育等的重要手段，育等的重要手段，为制制备_开辟了新的途径开辟了新的途径杂交交细胞胞有性有性杂交交单克隆抗体克隆抗体想一想想一想1动物物细胞融合完成的胞融合完成的标志是什么？志是什么？【提示提示】细胞核融合。胞核融合。二、二、单克隆抗体克隆抗体1.制制备原理原理(1)B淋淋巴巴细胞胞特特点点：一一种种B淋淋巴巴细胞胞产生生一一种种特特异异性性抗抗体体，B淋淋巴巴细胞胞在在体体外外_ (能能/不不能能)无限增殖。无限增殖
3、。(2)骨髓瘤骨髓瘤细胞特点：能无限增殖。胞特点：能无限增殖。不能不能(3)杂交瘤交瘤细胞特点：胞特点：B淋巴淋巴细胞与骨髓瘤胞与骨髓瘤细胞融合得到胞融合得到杂交瘤交瘤细胞，既能无限增殖，又胞，既能无限增殖，又能能产生特异性抗体。生特异性抗体。2.制制备过程程3.单克克隆隆抗抗体体优点点：_、并可大量制并可大量制备。4.单克隆抗体的克隆抗体的应用用(1)作作为诊断断试剂，具具有有准准确确、_、简易易、_的的优点。点。(2)用于治用于治疗疾病和疾病和_。特异性特异性强强、灵敏度高、灵敏度高高效高效快速快速运运载药物物想一想想一想2什什么么是是单克克隆隆抗抗体体？鼠鼠的的单克克隆隆抗抗体体能能否否
4、用于人体疾病的治用于人体疾病的治疗？为什么？什么？【提示提示】单克隆抗体是由克隆抗体是由单一一杂交瘤交瘤细胞胞增殖增殖产生的高度生的高度专一的抗体。不能。因一的抗体。不能。因为鼠鼠的的B淋巴淋巴细胞所胞所产生的抗体与人体生的抗体与人体B淋巴淋巴细胞胞产生的抗体是不同的。生的抗体是不同的。要点突破讲练互动要点突破讲练互动要点一要点一动物物细胞融合胞融合1.动物物细胞融合的操作步胞融合的操作步骤2.动物物细胞的融合胞的融合过程程细胞胞膜膜融融合合细胞胞质融融合合细胞胞核核融融合合(标志着志着细胞融合的完成胞融合的完成)。3.重重组细胞的特点胞的特点融合形成的融合形成的杂交瘤交瘤细胞具有两个胞具有两
5、个细胞的胞的遗传信息，通信息，通过动物物细胞培养，胞培养，杂交瘤交瘤细胞表胞表现出两个出两个亲本的特点。本的特点。4.植物体植物体细胞胞杂交和交和动物物细胞融合的区胞融合的区别植物体植物体细胞胞杂交交动物物细胞融合胞融合原理原理细胞膜流胞膜流动性和植性和植物物细胞全能性胞全能性细胞膜流胞膜流动性性步步骤酶酶解法去掉解法去掉细胞壁胞壁后后,诱导原生原生质体融体融合合,形成形成杂种体种体细胞胞,再再经过植物植物组织培培养形成养形成杂种植株种植株分散成分散成单个个细胞胞后后诱导细胞融合胞融合诱导方法方法物理方法、化学方物理方法、化学方法法物理方法、化学物理方法、化学方法、方法、灭活病毒活病毒结果果形
6、成形成杂种植株种植株形成形成杂种种细胞胞特特别提醒提醒二者的区二者的区别除表中所列外，除表中所列外，还有有培养基的培养基的类型和成分，所用的型和成分，所用的酶酶等的不同，等的不同，但二者均需在无菌条件下但二者均需在无菌条件下进行。行。 (2012太原五中高二太原五中高二检测)运用运用动物体物体细胞胞杂交技交技术可可实现基因定位。研究基因定位。研究发现：用人的用人的细胞与小鼠体胞与小鼠体细胞胞进行行杂交得到的交得到的杂种种细胞含有双方的染色体。胞含有双方的染色体。杂种种细胞在持胞在持续分裂分裂过程中程中仅保留鼠的染色体而人保留鼠的染色体而人类染色体染色体逐逐渐丢失，只剩一条或几条。如失，只剩一条
7、或几条。如图是人的缺是人的缺乏乏HGPRT酶酶突突变细胞株胞株(HGPRT)和小鼠的和小鼠的缺乏缺乏TK酶酶细胞株胞株(TK)融合后并在融合后并在HAT培养培养例例1液中培养的液中培养的过程，程，结果表明最果表明最终人的染色体人的染色体在融合在融合细胞中胞中仅有有3号染色体或号染色体或17号染色体号染色体或两者都有。已知只有同或两者都有。已知只有同时具有具有HGPRT酶酶和和TK酶酶的融合的融合细胞才可在胞才可在HAT培养液中培养液中长期存活与繁殖。期存活与繁殖。(1)体体细胞胞杂交交突突破破了了_，过程程常用的生物方法是常用的生物方法是_。(2)过程程中中，为了了防防止止细菌菌的的污染染，所
8、所用用培培养养液液应该添添加加一一定定量量的的_。此此外外还要要定定期期用用_处理理细胞胞，使使贴壁壁生生长的的细胞脱落形成胞脱落形成细胞胞悬液。液。(3)从培养从培养过程看，程看，HAT培养液不培养液不仅能提供养能提供养料，料，还起起_作用。作用。(4)从从图示示结果看，可以确定人的果看，可以确定人的_基因位于基因位于_号染色号染色体；体；该方法可以方法可以对鼠基因定位鼠基因定位吗？_。【解析解析】(1)体体细胞胞杂交具有突破有性交具有突破有性杂交交方法局限的方法局限的优点点,过程程是是细胞融合的胞融合的过程程,对于于动物物细胞常采用胞常采用灭活的病毒活的病毒诱导融合。融合。(2)为防止防止
9、杂菌菌污染，在培养液中可加入一定染，在培养液中可加入一定量的抗生素；使量的抗生素；使贴壁壁细胞脱落形成胞脱落形成细胞胞悬液液的方法是用胰蛋白的方法是用胰蛋白酶酶定期定期处理。理。(3)图中中过程程是一个是一个筛选的的过程，程，HAT培养液不培养液不仅能提能提供养料供养料,还起特殊的起特殊的选择作用，即只有同作用，即只有同时具具有有HGPRT酶酶和和TK酶酶的融合的融合细胞才能存活。胞才能存活。(4)该方法不能方法不能对鼠基因鼠基因进行定位，因行定位，因为运用运用此方法定位基因有一个前提，即要保此方法定位基因有一个前提，即要保证杂种种细胞在持胞在持续分裂分裂过程中程中仅保留鼠的染色体而保留鼠的染
10、色体而人人类染色体逐染色体逐渐丢失，或只剩一条或几条。失，或只剩一条或几条。鼠的染色体是全部的，即使知道存在某基因鼠的染色体是全部的，即使知道存在某基因,也无法也无法认定定该基因位于哪条染色体上。基因位于哪条染色体上。【答答案案】(1)有有性性杂交交方方法法的的局局限限灭活活的的病毒病毒诱导(2)抗生素胰蛋白抗生素胰蛋白酶酶(3)选择(4)TK酶酶17不能不能互互动动探究探究(1)本本题中中细胞胞融融合合手手段段不不同同于于植植物物体体细胞胞杂交的是什么？交的是什么？(2)本本题中中培培养养液液中中融融合合处理理后后的的细胞胞类型型最最多有几种？分多有几种？分别是什么是什么细胞？胞？【提提示示
11、】(1)动物物细胞胞融融合合的的手手段段与与植植物物体体细胞胞杂交交的的区区别是是前前者者通通常常采采用用灭活活的的病病毒毒作作为诱导剂。(2)细胞胞类型通常有型通常有5种，即鼠种，即鼠鼠、人鼠、人人、人、人人鼠、人、鼠鼠、人、鼠单独的独的细胞。胞。【易易误警警示示】(1)常常用用的的病病毒毒诱导剂有有仙仙台台病病毒毒、新新城城鸡瘟瘟病病毒毒、疱疱疹疹病病毒毒等等，其其中中仙仙台病毒最常用。台病毒最常用。(2)用做用做诱导剂的病毒必的病毒必须事先事先灭活，使病毒活，使病毒的感染活性、增殖能力的感染活性、增殖能力丧失但不破坏病毒的失但不破坏病毒的抗原抗原结构。构。要点二要点二单克隆抗体的制克隆抗
12、体的制备1.单克隆抗体制克隆抗体制备的关的关键思路及操作依据思路及操作依据(1)关关键思路：思路：克隆克隆单一的一的B淋巴淋巴细胞，形成胞，形成细胞群；胞群；将将B淋巴淋巴细胞与骨髓瘤胞与骨髓瘤细胞融合，胞融合，获得得杂交交瘤瘤细胞。胞。(2)用用B淋巴淋巴细胞与骨髓瘤胞与骨髓瘤细胞融合的原因：胞融合的原因：每每一一个个B淋淋巴巴细胞胞只只能能分分泌泌一一种种特特异异性性抗抗体；不同种体；不同种类的的B淋巴淋巴细胞分泌的抗体不同胞分泌的抗体不同;B淋巴淋巴细胞在体外培养胞在体外培养时不能无限增殖；不能无限增殖；骨髓瘤骨髓瘤细胞能胞能够无限增殖。无限增殖。2.单克隆抗体制克隆抗体制备过程中的程中
13、的筛选及原因及原因(1)第一次第一次筛选是在是在B淋巴淋巴细胞与骨髓瘤胞与骨髓瘤细胞胞融合之后，因融合之后，因为有三种融合情况：有三种融合情况：B淋巴淋巴细胞与胞与B淋巴淋巴细胞融合、骨髓瘤胞融合、骨髓瘤细胞与骨髓瘤胞与骨髓瘤细胞融合、胞融合、B淋巴淋巴细胞与骨髓瘤胞与骨髓瘤细胞融合，胞融合，而只有而只有B淋巴淋巴细胞与骨髓瘤胞与骨髓瘤细胞的融合胞的融合细胞胞才是需要的才是需要的杂种种细胞。胞。(2)第二次第二次筛选需先在多孔培养皿上培养，在需先在多孔培养皿上培养，在每个孔只有一个每个孔只有一个杂交瘤交瘤细胞的情况下开始培胞的情况下开始培养，然后再养，然后再筛选出能出能产生所需特异性抗体的生所
14、需特异性抗体的细胞群。由于胞群。由于该细胞群是由胞群是由单个个杂交瘤交瘤细胞胞克隆来的，所以克隆来的，所以产生的抗体一定是化学性生的抗体一定是化学性质单一、特异性一、特异性强强的的单克隆抗体。克隆抗体。 (2012北京四中高二北京四中高二质检)1975年科学年科学家首次利用家首次利用B淋巴淋巴细胞胞杂交瘤技交瘤技术制制备出出单克克隆抗体。隆抗体。请根据下根据下图回答回答问题：例例2(1)病病原原体体注注入入小小鼠鼠体体内内后后，要要经过_细胞胞处理理后后形形成成抗抗原原MHC复复合合体体，才才能能被被免疫免疫细胞胞识别。(2)制制备单克克隆隆抗抗体体所所用用的的B淋淋巴巴细胞胞一一般般从从脾脾
15、中采集，然后以中采集，然后以_作作诱导剂，使使B淋淋巴巴细胞胞和和骨骨髓髓瘤瘤细胞胞融融合合。通通过筛选和和克克隆隆培培养养，获得得的的杂交交瘤瘤细胞胞具具有有_的特点。的特点。(3)单克隆抗体的特点是克隆抗体的特点是_。根根据据上上图写写出出应用用杂交交瘤瘤技技术获得得单克克隆隆抗抗体的两种主要方法体的两种主要方法_。解析：解析：灭活的仙台病毒和聚乙二醇均可活的仙台病毒和聚乙二醇均可诱导动物物细胞融合。胞融合。杂交瘤交瘤细胞同胞同时具有两个具有两个亲代代细胞的胞的遗传特性。可以在体外也可以在体特性。可以在体外也可以在体内培养内培养杂交瘤交瘤细胞胞获得得单克隆抗体。克隆抗体。答案：答案：(1)
16、吞噬吞噬(或巨噬或巨噬)(2)灭活活的的仙仙台台病病毒毒或或聚聚乙乙二二醇醇既既能能产生生特特异性抗体，又能无限增殖异性抗体，又能无限增殖(3)特异性特异性强强，纯度高度高(或：或：专一性一性强强、灵敏度、灵敏度高高)体外培养法和体外培养法和动物体内培养法物体内培养法变式训练变式训练(2012西宁五中高二西宁五中高二检测)根据根据单克隆抗体制克隆抗体制备流程示意流程示意图判断以下判断以下选项中正确的是中正确的是()A单克隆抗体技术的原理包括细胞增殖、细单克隆抗体技术的原理包括细胞增殖、细胞膜的流动性、细胞的全能性等胞膜的流动性、细胞的全能性等B根据培养基的物理性质分类，图中根据培养基的物理性质
17、分类，图中HAT培培养基属于选择培养基养基属于选择培养基C在制备单克隆抗体的过程中有两次选择，在制备单克隆抗体的过程中有两次选择，第一次是选择杂交瘤细胞，第二次是选择能够第一次是选择杂交瘤细胞，第二次是选择能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞产生特异性抗体的杂交瘤细胞D老鼠骨髓瘤细胞染色体数是老鼠骨髓瘤细胞染色体数是40，效应，效应B细细胞的染色体数为胞的染色体数为46，融合后形成的杂交瘤细，融合后形成的杂交瘤细胞胞DNA分子数为分子数为86解析：解析：选C。单克隆抗体的制克隆抗体的制备过程中，程中，杂交瘤交瘤细胞不能培育成个体，未体胞不能培育成个体，未体现细胞的全胞的全能性，能性，A错；培养基根据
18、物理性；培养基根据物理性质可分可分为固固体培养基和液体培养基等，按用途分体培养基和液体培养基等，按用途分为选择培养基、培养基、鉴别培养基等，培养基等，B错；融合后；融合后杂交交瘤瘤细胞染色体数是胞染色体数是86，DNA数要考数要考虑细胞胞质中的中的DNA，多于，多于86，D错；C项描述正确。描述正确。要点三植物体要点三植物体细胞胞杂交和交和动物物细胞融合的比胞融合的比较比比较项目目植物体植物体细胞胞杂交交动物物细胞融合胞融合(单克隆抗克隆抗体制体制备)融合前融合前处理理纤维素素酶酶、果胶、果胶酶酶除去除去细胞壁胞壁注射特定抗原免疫注射特定抗原免疫处理理正常小鼠正常小鼠促融促融物理法：离心、物理
19、法：离心、振振动、电激激化学法：聚乙二化学法：聚乙二醇醇物理法：离心、振物理法：离心、振动、电激激化学法：聚乙二醇化学法：聚乙二醇生物法：生物法：灭活的病毒活的病毒理理论基基础细胞的全能性、胞的全能性、细胞膜的流胞膜的流动性性细胞膜的流胞膜的流动性、性、细胞胞增殖增殖比比较项目目植物体植物体细胞胞杂交交动物物细胞融合胞融合(单克隆抗体制克隆抗体制备)过程程原生原生质体体的制的制备原生原生质体体的融合的融合杂种种细胞胞的的筛选与与培养培养杂种植株种植株诱导与与鉴定定比比较项目目植物体植物体细胞胞杂交交动物物细胞融合胞融合(单克隆抗克隆抗体制体制备)意意义和用和用途途克服克服远缘杂交交不不亲和的障
20、碍，和的障碍，大大大大扩展展杂交的交的亲本本组合范合范围应用：如白菜用：如白菜甘甘蓝杂种植株种植株制制备单克隆抗体克隆抗体诊断、治断、治疗、预防疾防疾病。例如：病。例如：a.肿瘤定位瘤定位诊断，放射性抗体断，放射性抗体肿瘤瘤b.生物生物导弹治治疗，抗体，抗体抗癌抗癌药物物肿瘤瘤 有性生殖的生物有性生殖的生物产生后代需生后代需进行受行受精作用，植物体精作用，植物体细胞胞杂交要交要进行原生行原生质体的体的融合，融合，单克隆抗体的制克隆抗体的制备需需进行行动物物细胞融胞融合，可合，可见细胞的融合技胞的融合技术有着广泛的有着广泛的应用。用。下列下列为细胞融合的胞融合的简略略过程，据程，据图回答相关回答
21、相关问题：例例3(1)若若a、b分分别是是基基因因型型为Hhrr、hhRr两两个个烟烟草草品品种种的的花花粉粉，且且这两两对基基因因分分别位位于于两两对同同源源染染色色体体上上。由由于于一一对隐性性纯合合基基因因(rr或或hh)的的作作用用，在在光光照照强强度度大大于于800 lx时都都不不能能生生长。要要想想从从融融合合细胞胞的的培培养养液液中中分分离离出出基基因因型型为HhRr的的杂种种细胞胞，较为简便便的的筛选方方法法是是_。(2)若若a、b表表示示两两种种植植物物体体细胞胞，则由由d细胞胞形形成成杂种植株的原理是种植株的原理是_。这种育种方法的种育种方法的优点是点是_。(3)若若a、b
22、分分别为骨骨髓髓瘤瘤细胞胞和和B淋淋巴巴细胞胞，则d细胞的特点是胞的特点是_。由由d细胞胞产生生的的抗抗体体与与普普通通血血清清抗抗体体相相比比较，具具有有_的的特特点点。一一般般不不能能通通过直直接接培培养养B淋淋巴巴细胞胞的的方方法法生生产单克隆抗体的主要原因是克隆抗体的主要原因是_。【解析解析】(1)a是基因型是基因型为Hhrr的烟草的花粉的烟草的花粉,故其基因型故其基因型为Hr、hr；b是基因型是基因型为hhRr的烟的烟草的花粉，故其基因型草的花粉，故其基因型为hR、hr,因此因此经细胞胞融合可能形成的融合融合可能形成的融合细胞有：胞有：HHrr、hhrr、hhRR、Hhrr、hhRr
23、、HhRr，共，共6种，分析种，分析这6种种细胞除胞除HhRr之外均有一之外均有一对隐性性纯合基因合基因(rr或或hh)，即在光照，即在光照强强度大于度大于800 lx时都不能生都不能生长,因此因此获取基因型取基因型为HhRr的的杂种种细胞，胞，较为简便的便的筛选方法是方法是给予大于予大于800 lx的光照。的光照。(2)a、b表示两种植物体表示两种植物体细胞，胞，则通通过细胞融胞融合形成合形成d细胞可借助植物体胞可借助植物体细胞胞杂交技交技术，杂交交细胞能形成胞能形成杂种植株是由于植物种植株是由于植物细胞具胞具有全能性，有全能性，这种育种方法的最大种育种方法的最大优点是克服点是克服了了远缘杂
24、交不交不亲和的障碍。和的障碍。(3)a、b分分别为骨髓瘤骨髓瘤细胞和胞和B淋巴淋巴细胞，胞，则d细胞胞为杂交瘤交瘤细胞胞,其特点是既能无限繁殖，其特点是既能无限繁殖，又能又能产生特定的抗体。生特定的抗体。产生的抗体生的抗体为单克隆克隆抗体，同血清抗体相比，它具有特异性抗体，同血清抗体相比，它具有特异性强强、灵敏度高、可大量制灵敏度高、可大量制备等特点。生等特点。生产上一般上一般不能通不能通过直接培养直接培养B淋巴淋巴细胞来制胞来制备单克隆抗克隆抗体是因体是因为B淋巴淋巴细胞高度分化胞高度分化,不能增殖。不能增殖。【答案答案】(1)给予大于予大于800 lx的光照的光照(2)植植物物细胞胞的的全
25、全能能性性克克服服了了远缘杂交交的的障障碍碍(3)既能无限增殖，又能既能无限增殖，又能产生特定的抗体特生特定的抗体特异性异性强强、灵敏度高、可大量制、灵敏度高、可大量制备B淋巴淋巴细胞高度分化，不能增殖胞高度分化，不能增殖【探探规寻律律】杂交交细胞的胞的筛选方法方法(1)细胞胞工工程程中中运运用用特特定定的的选择培培养养基基可可将将人人们所所需需的的细胞胞筛选出出来来。利利用用细胞胞的的某某些些代代谢特特点点，在在培培养养基基中中加加入入特特定定的的化化学学物物质，使使细胞胞代代谢进行行或或不不能能进行行下下去去而而得得以以保保留留或淘汰，如或淘汰，如单克隆抗体的克隆抗体的筛选。(2)动物物细
26、胞融合与植物体胞融合与植物体细胞胞杂交的交的筛选方方法不同：前者可用免疫法，后者可用机械方法不同：前者可用免疫法，后者可用机械方法、生理学或法、生理学或遗传学方法。学方法。变式式训练下列关于下列关于细胞工程的叙述，胞工程的叙述，错误的是的是()A电刺刺激激可可诱导植植物物原原生生质体体融融合合或或动物物细胞融合胞融合B去去除除植植物物细胞胞的的细胞胞壁壁和和将将动物物组织分分散散成成单个个细胞均需胞均需酶酶处理理C小小鼠鼠骨骨髓髓瘤瘤细胞胞和和经抗抗原原免免疫疫小小鼠鼠的的B淋淋巴巴细胞融合可制胞融合可制备单克隆抗体克隆抗体D某种植物甲乙两品种的体某种植物甲乙两品种的体细胞胞杂种与甲乙种与甲乙
27、两品种两品种杂交后代的染色体数目相同交后代的染色体数目相同解析：解析：选D。在植物体。在植物体细胞胞杂交和交和动物体物体细胞融合胞融合时，均可采用离心、，均可采用离心、电刺激、振刺激、振动等等物理方法或化学促融物理方法或化学促融剂如聚乙二醇等方法；如聚乙二醇等方法；植物植物细胞的外面因有胞的外面因有细胞壁会影响胞壁会影响细胞的融胞的融合，故合，故应在在实验前用前用纤维素素酶酶或果胶或果胶酶酶除去除去细胞壁，而胞壁，而动物物细胞培养胞培养过程中存在着接触程中存在着接触性抑制效性抑制效应，故需要用胰蛋白，故需要用胰蛋白酶酶进行行处理；理；单克隆抗体的制克隆抗体的制备就是利用就是利用经抗原免疫抗原免疫过的的小鼠小鼠B淋巴淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合再胞融合再经筛选而成的；甲、乙两个品种的植物体而成的；甲、乙两个品种的植物体细胞胞杂交相当于形成了异源四倍体，而常交相当于形成了异源四倍体，而常规的的杂交形成的是二倍体。交形成的是二倍体。
