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1、PFGEPFGE分型技术原理及标准仪器配置分型技术原理及标准仪器配置 山东省疾控细菌所 2013-11-192013-11-19 张华宁目录目录PFGE PFGE 基本原理基本原理参数设置参数设置实验流程实验流程细菌分型原理细菌分型原理PFGEPFGE需配备的相关仪器需配备的相关仪器PFGEPFGE所需耗材清单所需耗材清单基本原理基本原理通常的琼脂糖凝胶电泳利用通常的琼脂糖凝胶电泳利用双链双链DNA 分子在电场作用分子在电场作用下，在凝胶中的迁移率不同下，在凝胶中的迁移率不同而达到分离的目的。而达到分离的目的。当双链当双链DNA 分子超过一定的分子超过一定的大小以后，大小以后，DNA 双螺旋的
2、半双螺旋的半径超过了凝胶的孔径，在琼径超过了凝胶的孔径，在琼脂糖中的电泳速度会达到极脂糖中的电泳速度会达到极限，我们称之为限，我们称之为“极限迁移极限迁移率率”，此时凝胶不能按照分，此时凝胶不能按照分子大小来筛分子大小来筛分 DNA。有实验证明，长度超过40KB的DNA分子不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中分离基本原理基本原理基本原理基本原理与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后可持续 1s 到 5min 左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以将其称之为脉冲式交变电场。目前PFGE装置有垂直脉冲场、电场翻转、旋转、钳位匀强电场（CHEF)等电
3、泳系统。基本原理基本原理 PFGEPFGE方法用来研究细菌的分子流行病学特点，能够对全基因组进行方法用来研究细菌的分子流行病学特点，能够对全基因组进行 分析，最终分析的分析，最终分析的DNADNA超过超过90%90%，可以从整个基因组的角度考虑菌株，可以从整个基因组的角度考虑菌株 间的关系。间的关系。 用稀有位点的限制性内切酶进行酶切可以获得菌种某亚种特有的电泳用稀有位点的限制性内切酶进行酶切可以获得菌种某亚种特有的电泳 图谱，是图谱，是PFGEPFGE技术的显著优势。技术的显著优势。 灵敏、分型能力强：电场是不断改变的，有利于灵敏、分型能力强：电场是不断改变的，有利于DNADNA的迁移的迁移
4、 重复性好、分辨率高、结果稳定、易于标准化。重复性好、分辨率高、结果稳定、易于标准化。“金标准金标准” 相同的操作框架适用于多种菌，只需选择合适内切酶、优化电泳条件相同的操作框架适用于多种菌，只需选择合适内切酶、优化电泳条件 即可。即可。技术特点技术特点参数设置参数设置脉冲时间脉冲时间电场夹角电场夹角电场强度电场强度电泳温度电泳温度缓冲液组成缓冲液组成琼脂糖类型和浓度琼脂糖类型和浓度 脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间。脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间。 脉冲场电泳的核心参数。通常实验中使用的脉冲时间脉冲场电泳的核心参数。通常实验中使用的脉冲时间为一个为一个范围值范围值，如：，如：2 2
5、20S20S。 脉冲时间的变换可以是脉冲时间的变换可以是线性的线性的或者是或者是非线性的非线性的。 与电泳时间作区别，电泳时间通常为与电泳时间作区别，电泳时间通常为20hr20hr左右，其根左右，其根据是标准菌种据是标准菌种H9812H9812的的20Kb20Kb片段距胶的下缘为片段距胶的下缘为1-1.5cm.1-1.5cm.脉冲时间脉冲时间分离不同大小DNA 改变脉冲时间脉冲时间脉冲时间不同脉冲时间对带型的影响不同脉冲时间对带型的影响2.2-54.2s2-30s2-35s2-25s随着脉冲时间上限的缩短大片段DNA的位置越来越靠近上端加样孔，同时小片段也得到了充分的分离。随着电场夹角的减小，
6、两个大片段DNA分离的更好。但同时小片段也在逐渐的压缩。所以为了兼顾不同大小的片段需要选择一个合适的电场角度。12010010596942.2 Mb1.6 Mb电场夹角电场夹角电场夹角电场夹角使用较小的电场夹角可以分离较大的使用较小的电场夹角可以分离较大的DNADNA片段，反之较大片段，反之较大的电场夹角用来分离较小的片段。当使用较小的电场夹的电场夹角用来分离较小的片段。当使用较小的电场夹角时，小片段会变的相对集中。角时，小片段会变的相对集中。Field AField BReorientation Angle120大部分基于大部分基于CHEFCHEF脉冲场凝脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使胶电泳
7、系统的操作手册使用的电场夹角为用的电场夹角为120120电场强度电场强度A.A.电场强度以电场强度以V/cmV/cm来表示的。来表示的。B.B.大部分基于大部分基于CHEF脉冲场凝胶脉冲场凝胶 电泳系统的操作手册使用的电电泳系统的操作手册使用的电 场强度为场强度为6V/cm。C.C.使用较高的电场强度可以分离使用较高的电场强度可以分离 较大的较大的DNADNA片段，反之亦然。片段，反之亦然。3V/cm6V/cm9V/cm电泳温度电泳温度A.A.通过通过冷凝冷凝以及以及循环系统循环系统实现实现对电泳缓冲液的温度控制。对电泳缓冲液的温度控制。B B. . 较高的温度会造成条带弥散，较高的温度会造成
8、条带弥散，影响分辨率。影响分辨率。C. C. 通常使用的缓冲液的温度为通常使用的缓冲液的温度为12121515。标准化温度定。标准化温度定为为14.14.缓冲液类型缓冲液类型A.A.缓冲液选择：缓冲液的缓冲能缓冲液选择：缓冲液的缓冲能力以及长时间电泳后液体的损力以及长时间电泳后液体的损耗问题。耗问题。B.B.通常缓冲液包括两种通常缓冲液包括两种0.5XTBE0.5XTBE和和1XTAE1XTAE，其中，其中1XTAE1XTAE常用于常用于MBMB级级DNADNA片断的分离（片断的分离（3MB3MB），而），而0.5XTBE0.5XTBE常用于常用于1MB1MB的片断的分的片断的分离。离。 0.
9、5X TBE1.0X TAE琼脂的种类以及琼脂的浓度琼脂的种类以及琼脂的浓度使用的琼脂糖浓度越低，所能分离的使用的琼脂糖浓度越低，所能分离的DNA片段越大。但片段越大。但琼脂浓度低时其机械强度也低，实验操作难度也难免会琼脂浓度低时其机械强度也低，实验操作难度也难免会加大。加大。使用的琼脂糖应当具备以下的特点：使用的琼脂糖应当具备以下的特点：1、机械强度大，利于实验操作、机械强度大，利于实验操作2、纯度高，可提高电泳的分辨率、纯度高，可提高电泳的分辨率3、熔点低，包埋细菌时凝胶的温度不易过高、熔点低，包埋细菌时凝胶的温度不易过高标准化操作中使用标准化操作中使用SeaKem Gold(SKG)琼脂
10、糖琼脂糖方法标准化方法标准化实验流程实验流程细菌培养菌体裂解胶块洗涤DNADNA酶切加样电泳结果处理细菌培养制备胶块第一天第二天第三天2) digest Cellular ProteinProteinase KAgarose1) Embed Cells in AgaroseDNA胶块的制备：用琼脂糖将细胶块的制备：用琼脂糖将细菌包埋，避免染色体菌包埋，避免染色体DNA的的机械性损伤。机械性损伤。实验流程实验流程细菌的裂解：蛋白酶细菌的裂解：蛋白酶K水解水解消化蛋白质，特别是与消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。结合的组蛋白。3) Digest Genomic DNARestriction
11、Enzyme16hr 4) Load Plug into Agarose Gel and Separate(Side view of agarose gel)实验流程实验流程胶块中胶块中DNA的酶切：的酶切：寡切点酶片段少而大寡切点酶片段少而大片段数目（片段数目（ 10， 2530）酶切片段的电泳酶切片段的电泳5) Stain Gel and Visualize Band Patterns6) Band Patterns are Digitized and added to a database for analysis实验流程实验流程图像的获取：图像的获取：DNA指纹图谱指纹图谱EtBr或或
12、GelRed染色染色BioNumerics 软件作聚类分析软件作聚类分析在使用细菌分型的结果进行暴发研究时是基于以下几个假设的：1. 属于一次暴发的分离株来源于同一个祖先2. 这些菌株应该具有相同的基因型3. 流行病学无关的菌株应该有不同的基因型别细菌分型原理细菌分型原理菌株分型的目的是为了提供实验室角度的证据。这一证据支持那些分离自一次暴发中分离的流行相关（epidemiologically relatedepidemiologically related）菌株，同时也是遗传相关的（genetically relatedgenetically related）菌株，从而证明这些菌株是同样的菌
13、株。基因事件与条带变化基因事件与条带变化75 kb 100 kb200 kb400 kb500 kb获得 失去 插入 缺失无法区分无法区分：分离株有相同的带型，包括条带的数目和位置。这些分离株为同 一菌株。高度相关高度相关：如果PFGEPFGE带型仅有因一次基因事件引起的带型变化，这些菌株 就被定义为高度相关菌株。这些仅有两到三个条带变化的情况常 见于反复传代以及从同一病人中多次分离的菌株。可能相关可能相关：PFGEPFGE带型与暴发菌株带型变化有两个独立的基因事件引起的条 带变化（通常是4到6个条带的变化）。这些分离株可能是遗传 上相关的，但是并不是紧密相关的，其流行病学关系也并不紧密。 这
14、样的突变常见于分离自较长的时间段（大于等于6个月）或者 是大规模延伸暴发的病人中。无无 关关：三个独立的基因事件引起的条带变化（7个或者是以上的条带变化）。TENOVERTENOVER原则TENOVERTENOVER原则的聚类方法原则的聚类方法首先，检查所有的带型，确定能否发现一个暴发带型或者代表带型。如果没有发现代表带型，那么这些分离株很可能是流行病学无关菌株。（流行相关的菌株中没有代表带型的情况是小概率事件）。其次，以暴发带型为基础和其他分离株的带型进行比较。应该确定每个带型与暴发带型的关系。带型差异超过50%的分离株可以认为是暴发无关分离株。而那些与暴发带型只有2到3个条带差异的分离株被
15、认为是暴发带型的衍生。聚类分析聚类分析只有带型相似性在只有带型相似性在100%的菌株才可能是的菌株才可能是暴发菌株。暴发菌株。 菌株分型研究不能代替流行病学研究，要将流行病学资料分析研究应作为基础。 两项工作虽分别进行，但是要综合在一起进行分析才能确定是否真正存在着暴发。 PFGE作为暴发菌株的鉴定是一种有效的方法，然而一旦收集菌株的时间跨度超过三到六个月，分型研究就转化为种群研究。 另外一些技术，如MLSTMLST，主要用于监测微生物种群随时间变化的特点。管家基因的突变是中性突变，不受环境选择压力的影响。近来，这两种方法经常被结合起来用于细菌的分型研究，有助于我们弄清楚暴发菌株是如何扩散的，以及各细菌种群是如何随时间变化的。聚类分析聚类分析PFGE是一个操作步骤复杂的实验是一个操作步骤复杂的实验过程，除了操作人员的仔细认真和过程，除了操作人员的仔细认真和实验程序的标准化，还需要保证相实验程序的标准化，还需要保证相关仪器和耗材的质量！关仪器和耗材的质量！PFGEPFGE需配备相关仪器需配备相关仪器PFGEPFGE实验耗材实验耗材
