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1、内容提纲内容提纲一、化学发光一、化学发光（一）、化学发光的基本原理（一）、化学发光的基本原理（二）、化学发光的应用（二）、化学发光的应用二、生物发光二、生物发光（一）、生物发光的原理与特点（一）、生物发光的原理与特点（二）、生物发光的分类（二）、生物发光的分类一、化学发光一、化学发光（一）化学发光的基本原理（一）化学发光的基本原理1 1、化学发光的定义、化学发光的定义 某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生的反应产生的化学能化学能而被激发，从激发态返回基态时，而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的发射出一定
2、波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为过程称为化学发光化学发光( (chemiluminescence)chemiluminescence) 。 2、化学发光的过程、化学发光的过程1）、化学发光满足的条件）、化学发光满足的条件a、该化学反应必须提供足够的激发能，使电子能、该化学反应必须提供足够的激发能，使电子能从基态跃迁至激发态。从基态跃迁至激发态。b、化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生、化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。成激发态。c、处于激发态分子必须具有一定的化学发光量子、处于激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子效率释放出光子, 或者能够转移它的能
3、量给另一或者能够转移它的能量给另一个分子使之处于激发态并释放出光子。个分子使之处于激发态并释放出光子。2）化学发光的基本类型）化学发光的基本类型a、直接发光、直接发光 是指被测物质为反应物直接参与化学反是指被测物质为反应物直接参与化学反应，利用自身化学反应释放的能量激发产应，利用自身化学反应释放的能量激发产物分子的光辐射。可用反应式表示为：物分子的光辐射。可用反应式表示为： A+B C*+D， C* C+hv 这类化学发光反应最多和最普遍，多数有这类化学发光反应最多和最普遍，多数有机物分子在液相中的化学反应属于这一类机物分子在液相中的化学反应属于这一类型型 。b、间接发光、间接发光 是指某些化
4、学反应中的由于激发态产是指某些化学反应中的由于激发态产物本身不发光或物本身不发光或发发光十分微弱，但通过加光十分微弱，但通过加入某种入某种能量能量接受体（荧光剂）可导致发光。接受体（荧光剂）可导致发光。反应式为：反应式为： A+B C*+D, F+C* F*+C, F* F+hv C为能量给于体，为能量给于体，F为能量接受体。为能量接受体。一、化学发光一、化学发光（二）化学发光的应用（二）化学发光的应用1 1、化学发光分析、化学发光分析 化学发光化学发光 (ChemiLuminescence (ChemiLuminescence ，简称为，简称为 CLCL) ) 分析法是分析法是分子发光光谱分
5、析法中的一类，它主要是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的物含量的一种痕量分析方法一种痕量分析方法。化学发光与其它发光分析的本质区别是体化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光系产生发光 ( ( 光辐射光辐射 ) ) 所吸收的能量来所吸收的能量来源不同。体系产生化学发光，必须具有一源不同。体系产生化学发光，必须具有一个产生可检信号的
6、光辐射反应和一个可一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。步骤的化学反应。第一类物质是化学发光反应中的的反应物；第一类物质是化学发光反应中的的反应物；第二类物质是化学发光反应中的催化剂，增第二类物质是化学发光反应中的催化剂，增敏剂或抑制剂敏剂或抑制剂; ;第三类是偶合反应中反应物，催化剂，增敏第三类是偶合反应中反应物，催化剂，增敏剂等。剂等。化学发光分析测定的物质对象可分为三类化学发光分析测定的物质对象可分为三类：u鲁米诺化学发光体系鲁米诺化学发光体系u 吖啶酯类化学发光体系吖啶酯类化学发光体系u过氧化草酸酯
7、类化学发光体系过氧化草酸酯类化学发光体系u无机物化学发光体系无机物化学发光体系 碱性高碘酸钾碱性高碘酸钾酸性高锰酸钾酸性高锰酸钾酸性硫酸铈酸性硫酸铈稀土配合物稀土配合物( (中性中性) )u 其他化学发光体系其他化学发光体系 主要的化学发光体系主要的化学发光体系 2 2、常见的一些化学发光体系、常见的一些化学发光体系1 1）、鲁米诺）、鲁米诺 ( (luminol)luminol)化学发光体系化学发光体系鲁米诺鲁米诺（ 3- 3-氨基苯二甲酰肼氨基苯二甲酰肼）其结）其结构是为构是为氧化剂氧化剂: H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 催化剂催化剂: 过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(
8、Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+ etc.)OXIDANTBASEluminol*3-Aminophthalate+ h3-APA鲁米诺的发光机理是鲁米诺的发光机理是2 2 2 2）、高碘酸钾（高碘酸钾（高碘酸钾（高碘酸钾（KIO4KIO4KIO4KIO4）发光体系）发光体系）发光体系）发光体系q 氧分子对的发射：氧分子对的发射： 490 500 nmq CO2双分子发射：双分子发射： 430 450 nm多酚类物质对该体系的化学发光有增强作用多酚类物质对该体系的化学发光有增强作用化学发光原理活性氧中间体型化学发光原理活性氧中
9、间体型化学发光原理活性氧中间体型化学发光原理活性氧中间体型3 3）、高锰酸钾（高锰酸钾（KMnO4KMnO4）发光体系）发光体系 KMnOKMnO4 4 还原剂还原剂 CLCL体系体系KMnO4 + Red Intermediate (激发态激发态) 直接直接CL Fluorophore Fluorophore (激发态激发态) 间接间接CL还原剂还原剂：氨基酸、SO2、碘、药物、毒品等具有还原性的物质量子产率不高，可以加入强还原量子产率不高，可以加入强还原性物质增强体系灵敏度性物质增强体系灵敏度可以测定化学需氧量 4 4）、铈（铈（CeCe）发光体系）发光体系高价铈高价铈 Ce (IV) C
10、e (IV)的发光体系的发光体系 CeCe（）是一种）是一种强的氧化剂强的氧化剂，CeCe（）在氧化亚硫酸盐）在氧化亚硫酸盐等还原性物质可产等还原性物质可产生生微弱的化学发光微弱的化学发光，因此可以利用此体系直，因此可以利用此体系直接测定相关的化合物。一般认为接测定相关的化合物。一般认为CeCe（）被）被还原时，产生激发态的还原时，产生激发态的CeCe（）* *，这个激，这个激发态同样的既可以跃迁到基态而发光，也可发态同样的既可以跃迁到基态而发光，也可以将能量转移给共存荧光而发光以将能量转移给共存荧光而发光。荧光物质荧光物质（如罗丹明（如罗丹明B B、罗丹明、罗丹明6G6G、喹啉等）、表面、喹
11、啉等）、表面活性剂（如吐温活性剂（如吐温2020、吐温、吐温8080等）来增敏等）来增敏CeCe（）的化学发光。）的化学发光。3 3、化学发光分析仪、化学发光分析仪IFFM-EIFFM-E型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）。限公司）。图图1 1 柠檬酸三钠柠檬酸三钠CeCe（）- -吐温吐温8080流动注射化学发光体系流程流动注射化学发光体系流程4 4、化学发光分析的特点、化学发光分析的特点局局限限性性：方方法法选选择择性性较较差差、发发光光体体系系相相对对较较少少、仪仪器器商品化不够商品化不够 优势性：优势性：不需要外部光源：不需
12、要外部光源：消除了入射光的干扰消除了入射光的干扰( (瑞利散射和拉曼散射瑞利散射和拉曼散射) )。克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降低克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降低了噪声，提高了信噪比。了噪声，提高了信噪比。 灵敏度高灵敏度高( (通常可达通常可达ngng级或级或pgpg级级) )。线性范围宽线性范围宽( (通常可达三个数量级通常可达三个数量级) )。设备简单、分析快速、易实现自动化。设备简单、分析快速、易实现自动化。5 5、化学发光法的应用、化学发光法的应用1 1）无机化合物化学发光分析）无机化合物化学发光分析a a、金属离子分析金属离子分析b b、其他无机化合物的分析、其他无
13、机化合物的分析2 2）有机化合物化学发光分析）有机化合物化学发光分析a a、有机酸、有机酸b b、有机碱、有机碱c c、氨基酸、氨基酸d d、糖类、糖类e e、类固醇类脂、类固醇类脂f f、药物、药物3 3）化学发光在生物领域的应用）化学发光在生物领域的应用l 血浆和血清的化学发光血浆和血清的化学发光 l血浆脂蛋白的化学发光血浆脂蛋白的化学发光 l 尿液的化学发光尿液的化学发光 l红细胞的化学发光红细胞的化学发光二、生物发光二、生物发光（一）生物发光的原理与特点（一）生物发光的原理与特点1 1、生物发光的定义、生物发光的定义 生物发光生物发光 是指生物体发出的光辐射，是生物是指生物体发出的光辐
14、射，是生物体释放能量的一种形式，这种发光现象广泛地分散在体释放能量的一种形式，这种发光现象广泛地分散在生物界中。它不依赖于有机体对光的吸收，而是生物界中。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种一种特殊类型的化学发光特殊类型的化学发光，也是氧化发光的一种，也是氧化发光的一种。2 2、生物发光的特点、生物发光的特点 生物发光的一般机制是：生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。 生物发光的颜色范围很宽，可从红光到深蓝光； 氧是几乎所有生物发光系统中必须的因素； 生物发光是由“荧光素酶”与“荧
15、光素”的化学反应所引起的； 所有的生物发光反应似乎都是酶-底物类型的反应，但复杂程度不同，某些生物发光反应涉及3 种或4种底物，而另一些生物发光反应甚至需要3个或4个酶的体系。二、生物发光二、生物发光（二）生物发光的分类（二）生物发光的分类1 1、据发光的机理不同将生物发光分为：据发光的机理不同将生物发光分为：u受激荧光受激荧光u发光生物发光发光生物发光u化学发光化学发光u超微弱发光超微弱发光a、受激荧光受激荧光受激荧光是指生物体在受到外界光辐射的受激荧光是指生物体在受到外界光辐射的作用时，体内固有的荧光物质或吸收的荧作用时，体内固有的荧光物质或吸收的荧光标记物发光的现象。光标记物发光的现象。
16、在生物学领域中，由于分析物质荧光的方在生物学领域中，由于分析物质荧光的方法敏感性极高，而且几乎所有的有机分子法敏感性极高，而且几乎所有的有机分子都能够直接或经过适当的化学处理后发生都能够直接或经过适当的化学处理后发生荧光，故很早就受到重视，并逐渐发展成荧光，故很早就受到重视，并逐渐发展成为生物学和医学中的荧光分析。为生物学和医学中的荧光分析。b b、发光生物发光发光生物发光 发光生物发光生物是指是指自身具有发光器官、细胞自身具有发光器官、细胞( (包括发包括发光的共生细菌光的共生细菌) )，或具有能分泌发光物体腺体的海洋，或具有能分泌发光物体腺体的海洋生物的统称。生物的统称。 在生物世界里说到
17、发光，人们首先会想到萤火在生物世界里说到发光，人们首先会想到萤火虫，但除了这种昆虫外还有许多生物也能发光，如虫，但除了这种昆虫外还有许多生物也能发光，如一些生活在深海里的鱼类，光是一种谋生的手段。一些生活在深海里的鱼类，光是一种谋生的手段。夜晚常在近海作业的渔民甚至是长住海边的人经常夜晚常在近海作业的渔民甚至是长住海边的人经常能看到海面上有光带，这是一些藻类发出的，当它能看到海面上有光带，这是一些藻类发出的，当它们受到惊扰时或者是在大量繁殖时，似乎海洋都开们受到惊扰时或者是在大量繁殖时，似乎海洋都开始燃烧了起来。晚上在海滩上戏耍的孩子们能从海始燃烧了起来。晚上在海滩上戏耍的孩子们能从海滩上找到
18、沙蚕，这也是一种能发光的动物，除此之滩上找到沙蚕，这也是一种能发光的动物，除此之外，能发光的还有水母、珊瑚、某些贝类和蠕虫等。外，能发光的还有水母、珊瑚、某些贝类和蠕虫等。c c、化学发光化学发光生物发光是一种特殊的化学发光，它是一生物发光是一种特殊的化学发光，它是一类与生命过程有光的化学发光，类与生命过程有光的化学发光，是在化学是在化学反应过程中反应过程中(主要为氧化还原反应主要为氧化还原反应)发出可发出可见光的现象。见光的现象。由两个关键步骤组成：由两个关键步骤组成：激发和发射激发和发射。许多化学反应进行时能释放足够的自由能许多化学反应进行时能释放足够的自由能而把参加反应的物质之一激发到能
19、发射光而把参加反应的物质之一激发到能发射光的电子激发态，生成一种激发态产物，在的电子激发态，生成一种激发态产物，在它回到基态时，剩余能量转变成光子能量它回到基态时，剩余能量转变成光子能量产生发光现象。产生发光现象。将化学发光与免疫反应结合起来建立的化学发光免疫测将化学发光与免疫反应结合起来建立的化学发光免疫测定法定法。化学发光标记是继荧光标记，放射性核素标记，酶标记化学发光标记是继荧光标记，放射性核素标记，酶标记三大标记技术之后，发展起来的最新检测技术。三大标记技术之后，发展起来的最新检测技术。全自动电化学发光免疫分析仪全自动电化学发光免疫分析仪 d d、超微弱发光超微弱发光超微弱发光分析：超
20、微弱发光分析： 任何有生命的物质人、任何有生命的物质人、动物、植物和微生物等都有一种超微弱发光，动物、植物和微生物等都有一种超微弱发光，这是生命体本身所固有的一种属性：这种发这是生命体本身所固有的一种属性：这种发光可以通过对生物分子、细胞、亚细胞组份光可以通过对生物分子、细胞、亚细胞组份(线桓体、微粒体、脂质体线桓体、微粒体、脂质体)或生物活体或生物活体(小鼠、小鼠、树叶、水果、小过树叶、水果、小过)、器官及体液、器官及体液(血、尿血、尿)的的测贡探测出来。测贡探测出来。这些有关生物超微弱发光这些有关生物超微弱发光(ultra-weak (ultra-weak bioluminescence)
21、bioluminescence)的研究课题，构成了当前的研究课题，构成了当前生命科学发展前沿中的一个极其重要的研究生命科学发展前沿中的一个极其重要的研究领域领域生命系统的超微弱光子辐射生命系统的超微弱光子辐射(ultra-(ultra-weak photon emission from living weak photon emission from living system)system)。 萤火虫发光细胞中含有萤火虫发光细胞中含有荧荧光素、荧光素酶光素、荧光素酶两种发光物两种发光物质。它们与质。它们与ATPATP（三磷酸腺苷）（三磷酸腺苷）及氧一起反应，在氧与荧光及氧一起反应，在氧与荧光
22、素结合时发生电子转移同时素结合时发生电子转移同时发生能量的变化释放出荧光发生能量的变化释放出荧光光子而发光。光子而发光。a a、萤火虫类萤火虫类的的发光发光2 2、据发光的据发光的生物生物不同将生物发光分为：不同将生物发光分为：萤火虫萤火虫这类发光过程包括加氧、这类发光过程包括加氧、激发与转移，如海萤的发光：激发与转移，如海萤的发光：它在自身分开的腺体中分别合它在自身分开的腺体中分别合成荧光素和荧光素酶，当把两成荧光素和荧光素酶，当把两者同时喷进水里时就会在水中者同时喷进水里时就会在水中反应而发光反应而发光，波长波长460460纳米，纳米，光色为蓝色。光色为蓝色。 海萤海萤2 2、节足动物及鱼
23、类的生物发光、节足动物及鱼类的生物发光鱼鱼类类包括刺丝胞亚门和栉水母亚门。这种类型包括刺丝胞亚门和栉水母亚门。这种类型发光具有各种不同的活化反应。亚门和纲不同，发光具有各种不同的活化反应。亚门和纲不同，活化反应与激发特性也不同。此类发光还可以活化反应与激发特性也不同。此类发光还可以从一个发光种传递激发态能量给另一个发光种，从一个发光种传递激发态能量给另一个发光种，即有敏化生物发光现象。这种发光可发出不同即有敏化生物发光现象。这种发光可发出不同颜色的光，较多地偏向红色，波长颜色的光，较多地偏向红色，波长480480490490纳纳米。米。 3 3、腔肠动物的生物发光、腔肠动物的生物发光 栉水母栉
24、水母 栉水母是一种发光海洋生栉水母是一种发光海洋生物，它们可以发出一种另物，它们可以发出一种另类的类的防护光防护光。这种防护光。这种防护光通常被称为通常被称为“牺牲标签牺牲标签”。当栉水母被捕食者吞到腹当栉水母被捕食者吞到腹中后，会引起某些半透明中后，会引起某些半透明捕食者身体发出光芒，这捕食者身体发出光芒，这种光芒对于捕食者来说是种光芒对于捕食者来说是非常危险，它们因此也成非常危险，它们因此也成为更上层捕食者的猎物。为更上层捕食者的猎物。所以，栉水母的防护光也所以，栉水母的防护光也被称为被称为“牺牲标签牺牲标签”。 它的反应机制与前三种不同。底物在催它的反应机制与前三种不同。底物在催化循环中
25、会形成还原型核黄素磷酸盐和醛化化循环中会形成还原型核黄素磷酸盐和醛化合物，当遇到荧光素酶和氧时，就会形成一合物，当遇到荧光素酶和氧时，就会形成一种激发的络合物。络合物断裂时生成氧化核种激发的络合物。络合物断裂时生成氧化核黄素磷酸盐、酸、水及一个光子，波长黄素磷酸盐、酸、水及一个光子，波长470470505505纳米，光为蓝绿色。纳米，光为蓝绿色。4 4、细菌发光、细菌发光发光细菌发光细菌用用发发光光细细菌菌做做“生生物物灯灯”包括海笋属、蚯蚓属及柱头虫属包括海笋属、蚯蚓属及柱头虫属等。这类发光包括两个过程，等。这类发光包括两个过程，虫荧光虫荧光素素与与氧或过氧化物氧或过氧化物单独或两者作用后单
26、独或两者作用后先生成超氧阴离子（自由基），然后先生成超氧阴离子（自由基），然后再激发再激发。 5 5、过氧化氢体系的生物发光、过氧化氢体系的生物发光发光蚯蚓发光蚯蚓6 6、其他发光生物其他发光生物发发光光蘑蘑菇菇 腰鞭毛虫腰鞭毛虫当岸边海水中如果聚集大当岸边海水中如果聚集大量的腰鞭毛虫的话，那么量的腰鞭毛虫的话，那么它们就会让海水呈现出红它们就会让海水呈现出红褐色，也就是所谓的红潮。褐色，也就是所谓的红潮。而某些腰鞭毛虫物种却可而某些腰鞭毛虫物种却可以发出铁蓝色的光芒。当以发出铁蓝色的光芒。当夜幕降临时，大量聚集的夜幕降临时，大量聚集的腰鞭毛虫在海岸边形成一腰鞭毛虫在海岸边形成一道亮丽、壮观的蓝色潮汐道亮丽、壮观的蓝色潮汐。如右图如右图 ：右图是一种饥饿的新西兰发光虫，它们从洞穴顶部垂下一根根“渔线”，“渔线”上挂满了分布均匀的粘性发光液滴，当有昆虫经过时，就会被它们捕获。 新西兰发光虫新西兰发光虫 下图显示的是，在新西兰北岛的一个洞穴，大量的发光虫聚集在一起，发出点点蓝色荧光，非常好看。其他发光生物其他发光生物萤火虫的萤火虫的 生物发光生物发光 画面画面谢谢谢谢! !
