高效液相色谱法B课件

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1、第三节第三节 高效液相色谱高效液相色谱法法的主要的主要类型及其分离原理类型及其分离原理高效液相色谱法BPPT课件一一、液液色谱法（或称液液分配色谱、液液色谱法（或称液液分配色谱法）法） 分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异( (一一) )固定相固定相 载体载体+ +固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：缺点：系统内部压力大，易流失，不实用系统内部压力大，易流失，不实用高效液相色谱法BPPT课件常用的几类载体常用的几类载体 ：（1 1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体） 由由直直径径为为303040 40

2、 m m的的实实心心玻玻璃璃球球和和厚厚度度约约为为1 12 2 m m 的多孔性外层所组成的多孔性外层所组成 （2 2）全全多多孔孔型型载载体体：由由硅硅胶胶、硅硅藻藻土土等等材材料料制制成，直径成，直径30 30 50 50 m m 的多孔型颗粒的多孔型颗粒 （3 3）全全多多孔孔型型微微粒粒载载体体：由由nmnm级级的的硅硅胶胶微微粒粒堆堆积积而而成成，又又称称堆堆积积硅硅珠珠。这这种种载载体体粒粒度度为为5 5 10 10 m m 高效液相色谱法BPPT课件 固定液固定液 由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。 液相色谱中，只需几种

3、不同极性的固定液即可。如,氧二丙腈（ODPNODPN），聚乙二醇（PEGPEG），十八烷（ODSODS）和角鲨烷固定液等。高效液相色谱法BPPT课件( (二二) )流动相流动相 要要求求流流动动相相对对固固定定相相的的溶溶解解度度尽尽可可能能小小，因因此此固固定定液液和和流流动动相相的的性性质质往往往往处处于于两两个极端个极端高效液相色谱法BPPT课件 正相色谱正相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分 反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性大的组分

4、先出柱，极性小的组分后出柱极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分适于分离非极性组分高效液相色谱法BPPT课件二、化学键合相色谱法二、化学键合相色谱法 （一）原理（一）原理 化学键合相：利用化学反应，通过共价键将化学键合相：利用化学反应，通过共价键将有机基团键合在载体（硅胶）表面，形成均有机基团键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相一、牢固的单分子薄层而构成的固定相 分离机制：分配分离机制：分配 + 吸附（以吸附（以LLC为基础）为基础） 特点：特点： 不易流失；不易流失； 热稳定性好热稳定性好 化学性能好；化学性能好； 载样量大载样量大 适于梯度洗

5、脱适于梯度洗脱 高效液相色谱法BPPT课件（二）固定相（二）固定相 载体：几乎都用载体：几乎都用硅胶硅胶。一般可分三类：一般可分三类：（1 1）疏疏水水基基团团 如如不不同同链链长长的的烷烷烃烃（C C8 8和和C C1818。）和苯基等和苯基等（2 2）极性基团）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3 3）离离子子交交换换基基团团 如如作作为为阴阴离离子子交交换换基基团团的的胺胺基，季镀盐；作为阳离子交换基，季镀盐；作为阳离子交换 基团的磺酸等基团的磺酸等. .高效液相色谱法BPPT课件键合固定相的制备键合固定相的制备（l l）硅氧碳键型（硅酸酯型）（Si-O

6、-C Si-O-C ）键合相 最最先先用用于于液液相相色色谱谱的的健健合合固固定定相相, ,用用醇醇与与硅硅醇醇基基发生酯化反应。发生酯化反应。 由由于于这这类类键键合合固固定定相相的的有有机机表表面面是是一一些些单单体体，具具有有良良好好的的传传质质特特性性, ,但但这这些些酯酯化化过过的的硅硅胶胶填填料料易易水水解解且且受受热热不不稳稳定定，因因此此仅仅适适用用于于不不含含水水或或醇醇的流动相的流动相高效液相色谱法BPPT课件（2 2）硅氮型（Si-N Si-N ）键合相 将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极

7、性基因的键合各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相（3 3）硅碳型（ Si-CSi-C）键合相 将硅胶表面氯化后，使Si-ClSi-Cl键转化为Si-CSi-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。 缺点：缺点： 该反应不方便；当使用水溶液时，必须限该反应不方便；当使用水溶液时，必须限制制pH在在48范围内范围内.高效液相色谱法BPPT课件（4 4）硅烷化（）硅烷化（SiOSiOSiSiC C）键合固定相）键合固定相 将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最

8、为广泛的键合相。 固定相在 pH pH = = 2 28.5 8.5 范围内对水稳定，有机分子与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。例：例：十八烷基硅烷键合相（简称十八烷基硅烷键合相（简称ODSODS或或C C1818）：）： 是最是最常用的非极性键合相。它们用于反相色谱法，在常用的非极性键合相。它们用于反相色谱法，在7070以下和以下和 pH 2pH 28 8范围内可正常工作范围内可正常工作高效液相色谱法BPPT课件（三）流动相（三）流动相 1 1、正相键合相色谱法 流动相极性小于固定相极性。常用非极性溶剂如烷烃类溶剂，样品组分的保留值可用加入适当的有机溶剂（调节剂）的办法调节洗脱强度

9、。常用溶剂有：氯仿、二氯甲烷、乙腈、醇类等。 适用于分离中等极性化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药高效液相色谱法BPPT课件2 2、反相键合相色谱法 流动相极性大于固定相极性，多以水或无机盐缓冲液为主体，再加入一种能与水相混溶的有机溶剂（ 如甲醇、乙睛、四氢呋喃等）为调节。 固定相一般为C C1818、 C C8 8 应用最广泛 高效液相色谱法BPPT课件正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱的差别：正相色谱和反相色谱的差别：正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱固定相极性固定相极性大大小小流动相极性流动相极性小至中等小至中等中至大中至大组分流出顺序组分流出顺序极性小的组分先

10、流出极性小的组分先流出极性大的组分先流出极性大的组分先流出流动相极性增大流动相极性增大保留时间变小保留时间变小保留时间变大保留时间变大分离组分分离组分油溶性或水溶性的极性油溶性或水溶性的极性和强极性化合物和强极性化合物非极性、极性或离子型非极性、极性或离子型化合物化合物高效液相色谱法BPPT课件三、三、液固色谱法（或称吸附色谱法）液固色谱法（或称吸附色谱法）流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂（一）原理（一）原理1、分离机制：利用溶质分子占据固定相表面、分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能

11、力的差异吸附活性中心能力的差异 分离前提：分离前提：K K不等或不等或k k不等不等高效液相色谱法BPPT课件2、固定相：与、固定相：与LC比，固定相粒径不同（比，固定相粒径不同（17% 17% 分配色谱分配色谱 硅胶失活硅胶失活载体载体 吸附的水吸附的水固定液固定液高效液相色谱法BPPT课件四、离子交换色谱法（四、离子交换色谱法（IEC IEC ）（一）原理（一）原理 利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中溶液中阳离子和阴离子阳离子和阴离子的一种分离分析方法。利用的一种分离分析方法。利用不同不同待测离子对固定相亲和力的差别待测离子对固定相亲

12、和力的差别来实现分离来实现分离 适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广此，应用范围较广高效液相色谱法BPPT课件阴离子交换：阴离子交换： 一般形式：一般形式： R一一AB RBA阳离子交换：阳离子交换：待待测测离离子子与与离离子子交交换换树树脂脂固固定定相相上上带带电电荷荷基基团团或或游游离离的的离离子子发发生生可可逆逆交换反应交换反应高效液相色谱法BPPT课件（二）固定相（二）固定相 种类种类阳离子交换树脂阳离子交换树脂强酸性强酸性弱酸性弱

13、酸性阴离子交换树脂阴离子交换树脂强碱性强碱性弱碱性弱碱性高效液相色谱法BPPT课件（三）流动相 通常是盐类的缓冲溶液 改变 流动相的 pHpH 缓冲剂（平衡离子）的类型 离子强度 加入有机溶剂、配位剂等 常用的缓冲剂有：常用的缓冲剂有：磷酸盐、乙酸盐、柠磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、氨水等檬酸盐、甲酸盐、氨水等 高效液相色谱法BPPT课件五、五、离子对色谱法离子对色谱法 离离子子对对色色谱谱法法是是将将一一种种（或或数数种种）与与溶溶质质离离子子电电荷荷相相反反的的离离子子（称称对对离离子子或或反反离离子子）加加到到流流动动相相或或固固定定相相中中，使使其其与与溶溶质质离离子子结结合合形形

14、成成离离子子对对，从从而而控控制制溶溶质质离离子保留行为的一种色谱法。子保留行为的一种色谱法。高效液相色谱法BPPT课件离子对形成机理离子对形成机理 把把和和被被测测物物离离子子A A电电荷荷相相反反的的离离子子B B（对对离离子子或或反反离离子子）加加入入到到流流动动相相中中，使使待待测测离离子子A A与与反反离离子子B B形形成成中中性性离离子子对对ABAB，该该ABAB离离子子对对的的性性质质与与A A离离子子或或B B离离子子的的性性质质不不同同，即即间间接接改改变变了了待待测测离离子子的的保留特性。保留特性。高效液相色谱法BPPT课件离子对试剂离子对试剂 用于阴离子分离的对离子： 烷

15、基铵类，如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲基铵等 用用于于阳阳离离子子分分离离的的对对离离子子：烷烷基基磺磺酸酸类类，如己烷磺酸钠如己烷磺酸钠 固定相和流动相固定相和流动相 性性质质同同键键合合相相色色谱谱，选选择择不不同同的的离离子子对对试试剂剂可可以以分分离离酸酸、碱碱和和离离子子、非非离离子子的的混合物混合物 高效液相色谱法BPPT课件六、六、离子色谱法离子色谱法 以离子交换树脂为固定相以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为电解质溶液为流动相流动相，通常以电导检测器为通用检测器通常以电导检测器为通用检测器。 对离子型化合物的分析，离子色谱法是目前唯一能获得快速、灵敏、准确和多组分效果的方

16、法，检测手段已扩展到电导检测器之外的其它类型的检测器，如电化学检测器，紫外光度检测器。可分析的离子从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用离子色谱法进行分析。高效液相色谱法BPPT课件七、七、空间排阻色谱法空间排阻色谱法（一）分离原理凝胶内具有一定大凝胶内具有一定大小的孔穴小的孔穴小分子可完全渗透入内，最小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱后洗出色谱柱中等体积的分中等体积的分子部分渗透子部分渗透体积大的分子不能渗透到孔穴中去体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来而被排阻，较早地被淋洗出来 固定相为化学惰性多孔物质固定相为化学惰性多孔物质凝胶凝胶, ,

17、类似于分子筛，类似于分子筛，但孔径比分子筛大。这样，样品分子基本上按其分子大但孔径比分子筛大。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。小，排阻先后由柱中流出。高效液相色谱法BPPT课件（二）固定相凝胶 凝胶是含有大量液体（一般为水）的柔软而富于弹性的物质，是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。 软质凝胶分类 半硬质凝胶 硬质凝胶高效液相色谱法BPPT课件1 1、软质凝胶、软质凝胶种种类类：如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶都都具具有有较较小小的的交联结构交联结构特点：特点： 微微孔孔能能吸吸入入大大量量的的溶溶剂剂，并并能能溶溶涨涨到到它它干干体的许多倍体的许多倍

18、 适适用用于于水水溶溶性性溶溶剂剂作作流流动动相相，一一般般用用于于小小分分子子质质量量物物质质的的分分析析，不不适适宜宜在在高高效效液液相相色色谱谱中。中。高效液相色谱法BPPT课件2 2、半硬质凝胶（有机凝胶）种类：如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶特点：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。缺点：在有机溶剂中有轻度膨胀。 高效液相色谱法BPPT课件3 3、硬质凝胶（无机凝胶） 是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等 凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。高效液相色谱法BPPT课件（三）

19、流动相（三）流动相选择依据（从样品的溶解性考虑） 流动相应与凝胶本身有相似性 黏度低 与样品的折光率相差大 能润湿凝胶，防止吸附作用 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N N，N-N-二甲基甲酸胺、三氯甲烷（凝胶渗透色谱）；水（凝胶过滤色谱）等。高效液相色谱法BPPT课件第四节第四节 液相色谱法流动相液相色谱法流动相一、流动相选择的一般要求一、流动相选择的一般要求 1 1、流动相的纯度、流动相的纯度 2 2、流动相与固定相不互溶，不发生化学反应、流动相与固定相不互溶，不发生化学反应 3 3、对试样要有适宜的溶解度、对试样要有适宜的溶解度 4 4、必须与检测器匹配、必须与检测器匹配 5 5、溶剂的粘

20、度要小，可以降低色谱柱的阻力、溶剂的粘度要小，可以降低色谱柱的阻力 高效液相色谱法BPPT课件二、常用溶剂的极性 常用溶剂的极性顺序为： 水（极性最大）水（极性最大）、甲酰胺、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃、醋酸乙酯、乙醚、丙醇、丙酮、四氢呋喃、醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、环己烷、己烷、二氯甲烷、氯仿、环己烷、己烷、 高效液相色谱法BPPT课件三、流动相的选择 根据流动相所起的作用，可以把溶剂分为底剂和洗脱剂两种 底剂决定基本的色谱分离情况 洗脱剂则是为了调节试样组分的滞留并对某几个组分具有选择性的分离作用 高效液相色谱法BPPT课件1 1、键合相色谱法正相色谱：正相

21、色谱：底剂采用低极性溶剂，如正己烷、苯、氯仿等；洗脱剂则根据试样的性质，有针对性地选择极性较强的溶剂如醚、酯、酮、醇和酸等；反相色谱中：反相色谱中： 以水为流动相的主体，以加入不同配比的有机溶剂作调节剂。常用的有机溶剂是甲醇、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等高效液相色谱法BPPT课件2 2、离子交换色谱法、离子交换色谱法 离子交换色谱法在含水介质中进行离子交换色谱法在含水介质中进行 组组分分的的保保留留值值可可用用流流动动相相中中盐盐的的浓浓度度（或或离离子子强强度度）和和pHpH来来控控制制，增增加加盐盐的浓度导致保留值降低。的浓度导致保留值降低。高效液相色谱法BPPT课件3 3、排阻色谱法、排阻

22、色谱法 排排阻阻色色谱谱法法所所用用的的溶溶剂剂必必须须与与凝凝胶胶本本身身非非常常相似，这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。相似，这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。 对对分分离离高高分分子子有有机机化化合合物物，采采用用的的溶溶剂剂主主要要是是四四氢氢呋呋喃喃、甲甲苯苯、间间甲甲苯苯酚酚、N,N-N,N-二二甲甲基基甲甲酰胺等酰胺等 生生物物物物质质的的分分离离主主要要用用水水、缓缓冲冲盐盐溶溶液液、乙乙醇醇及丙酮等及丙酮等 高效液相色谱法BPPT课件 第五节第五节 色谱分离条件选择色谱分离条件选择高效液相色谱法BPPT课件一、一、 减小柱内展宽，提高柱效减小柱内展宽，提高柱效l l、固定相、固定

23、相 选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱高效液相色谱法BPPT课件2 2、流动相、流动相 选用低粘度的流动相，有利于增大组选用低粘度的流动相，有利于增大组分在溶剂中的扩散系数分在溶剂中的扩散系数DmDm，减少传质阻力，减少传质阻力 例：甲醇、乙腈等例：甲醇、乙腈等3 3、 流速流速 约约1ml/min1ml/min4 4、柱温的选择：、柱温的选择： 选室温选室温25250 0C C左右左右高效液相色谱法BPPT课件二、减少柱外展宽二、减少柱外展宽1 1、柱前展宽：、柱前展宽： 主要由进样引起，减小进样器的死体积主

24、要由进样引起，减小进样器的死体积 2 2、柱后展宽：、柱后展宽： 主主要要由由接接管管、检检测测器器流流通通池池体体积积及及检检测测器器响响应时间等因素所引起应时间等因素所引起高效液相色谱法BPPT课件高效液相色谱法BPPT课件三、分离类型的选择三、分离类型的选择1 1、分析的目的是什么 2 2、分析对象性质及其结构是什么？3 3、分析样品的复杂程度，大概有多少种组分4 4、样品量、样品的形态5 5、要求的检测限、测定限、灵敏度、分析时间6 6、有无分析实例和标准样品以及相关分析资料7 7、实验设备情况高效液相色谱法BPPT课件液相色谱分离类型选择参考表液相色谱分离类型选择参考表高效液相色谱法

25、BPPT课件第六节第六节 高效液相色谱法的应用高效液相色谱法的应用高效液相色谱法BPPT课件一、在食品分析中的应用一、在食品分析中的应用1 1、食食品品营营养养成成分分分分析析：蛋蛋白白质质、氨氨基基酸酸、糖糖类类、色色素素、维维生生素素、香香料料、有有机机酸酸（邻邻苯苯二二甲甲酸酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；2 2、食食品品添添加加剂剂分分析析：甜甜味味剂剂、防防腐腐剂剂、着着色色剂剂（合合成成色色素素如如柠柠檬檬黄黄、苋苋菜菜红红、靛靛蓝蓝、胭胭脂脂红红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；3 3、食食品品污污染染物

26、物分分析析：霉霉菌菌毒毒素素（黄黄曲曲霉霉毒毒素素、黄黄杆杆菌菌毒毒素素、大大肠肠杆杆菌菌毒毒素素等等）、微微量量元元素素、多环芳烃等。多环芳烃等。 高效液相色谱法BPPT课件二、在环境分析中的应用 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等。三、在生命科学中的应用1 1、低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。2 2、高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。 高效液相色谱法BPPT课件例例1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶

27、(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。 高效液相色谱法BPPT课件例例2. 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器高效液相色谱法BPPT课件四、在医学检验中的应用 1 1、合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等）、黄胺类药等。 2 2、天然药物生

28、物碱（吲哚碱、颠茄碱、鸦片碱、强心甙）等五、在无机分析中的应用 阳离子、阴离子的分析等。 高效液相色谱法BPPT课件五、制备型液相色谱五、制备型液相色谱 （preparative liquid chromatography）获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度1530cm），一次制备量.11mg；1. 色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低降低10%为宜。为宜。高效液相色谱法BPPT课件2. 液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法 收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。 高效液相色谱法BPPT课件3. 制备型液相色谱制备型液相色谱制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、 进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱制备柱：内径2050mm，柱长50cm。高效液相色谱法BPPT课件