国家基金申请在的问题和对策课件

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1、国家基金申请存在国家基金申请存在的问题和对策的问题和对策 黎黎 明明 涛涛 中山大学中山医学院中山大学中山医学院 中山大学蛋白质组学中心中山大学蛋白质组学中心申请书需回答的问题申请书需回答的问题l为什么为什么立项依据立项依据l做什么做什么研究目标、研究内容研究目标、研究内容l怎么做怎么做研究方案、技术路线研究方案、技术路线l能否做能否做可行性：工作基础、工作条件可行性：工作基础、工作条件标标 题题一个好的标题等于成功一半一个好的标题等于成功一半确切、醒目、新颖、主题明了确切、醒目、新颖、主题明了 围绕围绕“科学问题科学问题” 大小适中，防止大小适中，防止“大题目、小课题大题目、小课题”与与“科

2、学问题科学问题”和和“研究目标研究目标”呼应呼应 神经元凋亡时神经元凋亡时SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控细胞凋亡细胞凋亡时时SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控神经元凋亡时神经元凋亡时BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控神经元凋亡时神经元凋亡时SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的的调控调控SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控SP1对对神经元凋亡的调控作用神经元凋亡的调控作用关键词：关键词：SP1/Bim/基因调控基因调控/信号转导信号转导/神经元凋亡神经元凋亡标题标题摘摘 要要1. 1. 工作基础

3、工作基础 继续和深入继续和深入 发表和未发表发表和未发表 创新创新2. 2. 科学问题科学问题 重要！不能缺！中肯重要！不能缺！中肯 3. 3. 预实验预实验 针对针对“问题问题”的预实验结果的预实验结果4. 4. 工作假设工作假设 思想性、创新性思想性、创新性5. 5. 主要方法主要方法 可靠性第一可靠性第一 先进性第二先进性第二6. 6. 研究目标研究目标 明确、具体明确、具体7. 7. 研究意义研究意义 理论性和应用性理论性和应用性神经元凋亡时神经元凋亡时SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控 我我们们已已经经证证明明了了撤撤钾钾诱诱导导神神经经元元凋凋亡亡时时JN

4、K/c-Jun JNK/c-Jun 和和PI3K/Akt/FKHRL1PI3K/Akt/FKHRL1信信号号通通路路不不参参与与BH3BH3onlyonly蛋蛋白白BimBim的的上上调调。 那那么么，BimBim上上调调的的转转录录机机制制是是什什么么？启启动动子子55末末端端序序列列续续减减分分析析确确立立了了诱诱导导BimBim表表达达的的启启动动子子核核心心区区，进进而而发发现现一一个个典典型型的的转转录录因因子子SP1SP1结结合合序序列列位位于于其其中中。进进一一步步实实验验显显示示：神神经经元元凋凋亡亡时时SP1SP1被被激激活活；负负显显性性SP1SP1和和SP1-DNASP1

5、-DNA结结合合抑抑制制剂剂mithramycinmithramycin A A抑抑制制了了BimBim上上调调和和神神经经元元凋凋亡亡。由由此此，我我们们首首次次提提出出了了BimBim 上上调调的的新新机机制制，即即：神神经经元元凋凋亡亡时时转转录录因因子子SP1SP1被被激激活活，激激活活的的SP1SP1直直接接调调控控BimBim的的诱诱导导表表达达。本本项项目目拟拟进进一一步步采采用用腺腺病病毒毒表表达达技技术术以以及及启启动动子子定定点点突突变变、EMSAEMSA和和CHIPCHIP方方法法，旨旨在在获获得得SP1SP1直直接接调调控控BimBim基基因因的的可可靠靠证证据据。本本

6、项项目目将将阐阐明明SP1SP1对对促促凋凋亡亡蛋蛋白白BimBim的的调调控控作作用用和和机机制制、为为确确立立SP1SP1作作为为神神经经退退行行性性疾疾病病治治疗疗的的新靶点提供更充分的科学依据。新靶点提供更充分的科学依据。CaMKII磷酸化磷酸化GSK-3对去极化介导的神经元存活的调控对去极化介导的神经元存活的调控 GSK-3/GSK-3GSK-3/GSK-3是促神经元凋亡的重要激酶。研究表明去极是促神经元凋亡的重要激酶。研究表明去极化可使化可使GSK-3 Ser21/GSK-3 Ser9GSK-3 Ser21/GSK-3 Ser9发生磷酸化并抑制其活性，发生磷酸化并抑制其活性，从而保

7、护性干预凋亡的发生。但是，去极化时，究竟哪一个激酶从而保护性干预凋亡的发生。但是，去极化时，究竟哪一个激酶介导了介导了GSK-3GSK-3磷酸化尚不清楚。排除了磷酸化尚不清楚。排除了AKTAKT、PKAPKA、p90RSKp90RSK的参与的参与后，通过底物一致序列分析和抑制剂实验，我们提出后，通过底物一致序列分析和抑制剂实验，我们提出CaMKIICaMKII介导介导GSK-3GSK-3磷酸化的可能性。进一步的体外重组激酶反应分析证明，磷酸化的可能性。进一步的体外重组激酶反应分析证明，CaMKIICaMKII可直接磷酸化可直接磷酸化GSK-3 Ser21/GSK-3 Ser9GSK-3 Ser

8、21/GSK-3 Ser9。本项目拟采本项目拟采用共免疫沉淀、用共免疫沉淀、siRNAsiRNA和激光共聚焦等方法，旨在获得和激光共聚焦等方法，旨在获得CaMKIICaMKII与与GSK-3GSK-3直接相互作用的可靠证据，评价和证实直接相互作用的可靠证据，评价和证实CaMKIICaMKII磷酸化磷酸化GSK-3GSK-3这一事件在去极化促神经元存活效应中的作用。本项目有望揭示这一事件在去极化促神经元存活效应中的作用。本项目有望揭示去极化调控去极化调控GSK-3GSK-3的新机制，为确立的新机制，为确立GSK-3GSK-3作为神经退行性疾病治作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。

9、疗的新靶点提供更充分的科学依据。 立项依据立项依据1. 1. 值得做吗值得做吗？必要性：？必要性：意义意义 价值价值 思想思想 创新创新 2. 2. 谁来做呢？舍我其谁谁来做呢？舍我其谁 3. 3. 科学问题？中肯科学问题？中肯 明确明确 4. 4. 突出自己的工作突出自己的工作 预实验预实验 图文规范化图文规范化 5. 5. 文献文献 档次档次 时效性时效性 自己的文章自己的文章 规范化规范化6. 主线清楚主线清楚 深入浅出深入浅出 通俗易懂通俗易懂Fig.6MithramycinA,aSP1-DNAbindinginhibitor,attenuatesbimupreguationbyact

10、ivitydeprivationinCGNs.(A)MithramycinAattenuatestheupregulationofBimELinducedbyactivitydeprivationinadosedependentmanner.CGNswereplacedin25Kor5KmediaintheabsenceorpresenceofmithramycinAattheindicatedconcentrationsfor6h.BimELexpressionwasassessedbyWesternblotasdescribedinFig.1(A).Resultsshownarerepre

11、sentativeoffourseparateexperiments.(B)MithramycinAinhibitstheincreaseinbimmRNAlevelinadose-dependentmanner.Neuronsweretreatedasdescribedin(A),bimandactinmRNAsweredeterminedbyRT-PCR,Resultsshownarerepresentativeoffiveseparateexperiments.(C)MithramycinAsuppressestheactivationofbimpromoterinducedbyacti

12、vitydeprivation.Neuronswereco-transfectedwithbim-LucandpEF-RLfor8hr.LuciferaseactivitiesweremeasuredasdescribedinFig.2,Theexperimentswererepeatedthreetimeswithduplicatesforeachtreatment.ThedatarepresentS.E.M.ofthreeexperiments.参参 考考 文文 献献1.LeyuShi,ShoufangGong,ZhongminYuan,ChiMa,YanlingLiu,ChuanfuWa

13、ng,WenmingLi,RongbiaoPi,ShoujianHuang,RuzhuChen,YifanHan,ZixuMao,andMingtaoLi.Activitydeprivation-dependentinductionoftheproapoptoticBH3-onlyproteinBimisindependentofJNK/c-Junactivationduringapoptosisincerebellargranuleneurons.NeurosciLett.2005,375：7-12.2.WenyaWang,LeyuShi,YuanbinXie,ChiMa,WenmingLi

14、,XingwenSu,ShoujianHuang,RuzhuChen,ZhenyuZhu,ZixuMao,YifanHanandMingtaoLi.SP600125,anewJNKinhibitor,protectsdopaminergicneuronsintheMPTPmodelofParkinsonsdisease.NeurosciRes2004；48:195-202研究内容、研究目标与研究内容、研究目标与拟解决的关键问题拟解决的关键问题要求：明确要求：明确具体具体解决学术问题为目的解决学术问题为目的研究目标研究目标题目题目：神经元凋亡时：神经元凋亡时SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bi

15、m的转录调控的转录调控实例：获得实例：获得SP1直接调控直接调控bim基因表达的可基因表达的可靠证据，阐明促凋亡蛋白靠证据，阐明促凋亡蛋白Bim由由SP1转录调转录调控的新机制，为确立控的新机制，为确立SP1作为神经退行性疾作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。研究内容研究内容（围绕研究目标）（围绕研究目标）1.证证明明bim启启动动子子核核心心区区的的SP1结结合合序序列列是是否否介介导导了了bim基基因因的的上上调调为为了了证证实实bim启启动动子子核核心心区区的的SP1结结合合序序列列是是否否介介导导了了bim基基因因的的上上调调，将将其

16、其中中的的SP1结结合合序序列列进进行行点点突突变变，使使其其不不能能结结合合SP1；确确定定这这一一突突变变是是否否能能够够消消除除bim启启动子的撤钾反应。动子的撤钾反应。2.分分析析SP1是是否否能能够够与与bim启启动动子子核核心心区区的的SP1结结合合序序列列结结合合应应用用EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay)技技术术，证证实实bim启启动动子子核核心心区区的的SP1结结合合序序列列是是否否能能够够与与SP1结结合合；进进一一步步采采用用CHIP(Chromatinimmunoprecipitation)方方法法，获得获得SP1与与bim启动

17、子核心区在细胞内结合的证据。启动子核心区在细胞内结合的证据。3.从从bim的的mRNA和和蛋蛋白白质质水水平平，观观察察负负显显性性SP1是是否否能能够够抑抑制制撤撤钾钾诱诱导导的的bim基基因因的的上上调调质质粒粒转转染染CGNs的的转转染染率率只只能能达达到到0.1-1.0%，腺腺病病毒毒的的感感染染率率可可达达7080%1。因因此此，构构建建dnSP1的的腺腺病病毒毒载载体体Ad-dnSP1，感感染染CGNs才才能能达达到到可靠分析可靠分析bim的的mRNA和蛋白质表达水平改变的目的。和蛋白质表达水平改变的目的。 4. 4. 分析分析SP1诱导诱导Bim这一机制对神经元凋亡的调控作用这一

18、机制对神经元凋亡的调控作用确立确立SP1转录转录激活激活bim这一机制后，进一步分析这一机制对神经元凋亡的调控作用。这一机制后，进一步分析这一机制对神经元凋亡的调控作用。l项目需求为前提项目需求为前提l可靠性第一，先进性第二可靠性第一，先进性第二l参考文献参考文献l突出关键技术的描述突出关键技术的描述l不主张使用流程图，建议开头：不主张使用流程图，建议开头：“有关方法、有关方法、技术路线、实验手段、关键技术综述如下技术路线、实验手段、关键技术综述如下” 研究方案研究方案基本方法基本方法 大鼠小脑颗粒神经元培养、大鼠小脑颗粒神经元培养、Westernblot、RTPCR、钙磷沉淀法转染基因、转基

19、因神钙磷沉淀法转染基因、转基因神经元的凋亡分析、报道基因表达分析、免疫沉经元的凋亡分析、报道基因表达分析、免疫沉淀等基本方法均按我们报道淀等基本方法均按我们报道1,2,3,4,5,6的进行。的进行。负显性负显性SP1腺病毒腺病毒(Ad-dnSP1)载体载体的构建、扩增、纯化和保存的构建、扩增、纯化和保存 为了达到在mRNA和蛋白质水平（而不仅仅是人工的报道基因水平）观察dnSP1是否能够抑制撤钾诱导bim基因的上调的目的，必须保证dnSP1导入CGNs有较高的导入率。现有质粒转染CGNs方法的转染率只能达到0.1-1.0%，而在方法得当的情况下（见后）腺病毒的感染率可达7080%1。因此，dn

20、SP1的腺病毒载体Ad-dnSP1的构建是采用RTPCR和Westernblot分析bim的mRNA和蛋白质的前提。 腺病毒的扩增和纯化按本人报道的进行1。腺病毒的活性高低是决定能否对CGNs达到7080感染率的关键，而正确的腺病毒保存条件又是其活性高低的决定因素。我们曾经研究过储存条件对腺病毒感染CGNs的影响，并制定了腺病毒的最佳储存条件，即小量分装后置于20C/20%甘油或80C/50%甘油，一月内可保证感染率在70-80%。申请者简历申请者简历申请者和项目组主要成员申请者和项目组主要成员 l学历学历l研究简历研究简历l文章目录文章目录l学术奖励学术奖励l承担的任务承担的任务黎明涛黎明涛

21、(LiMingtao)项目负责人，中山大学中山医学院药理教研室教授，博士生导师，中项目负责人，中山大学中山医学院药理教研室教授，博士生导师，中山医学院蛋白质组学实验室主任。山医学院蛋白质组学实验室主任。1996年获得博士学位，在美国科罗拉多年获得博士学位，在美国科罗拉多大学从事大学从事2年博士后工作。学科专业为分子神经生物学与蛋白质组学，主年博士后工作。学科专业为分子神经生物学与蛋白质组学，主要研究领域是神经元凋亡的信号转导、基因调控和蛋白质组学。近年来发要研究领域是神经元凋亡的信号转导、基因调控和蛋白质组学。近年来发表表SCI文章文章36篇，其中作为第一作者或通讯作者在篇，其中作为第一作者或

22、通讯作者在JBiolChem,MolCellBiol,JNeurosci,Neuropharmacology和和Neuroscience等杂志上发表了等杂志上发表了12篇篇论文，并在论文，并在DrugNewsPerspect上发表了相关专题综述。上发表了相关专题综述。近五年来，作为第一主持人获得了近五年来，作为第一主持人获得了2项国家自然科学基金面上项目，已项国家自然科学基金面上项目，已结题结题1项；项；1项国家自然科学基金广东省自然科学联合基金。在研项目进项国家自然科学基金广东省自然科学联合基金。在研项目进行顺利。行顺利。发表的相关论文发表的相关论文1.MaC,YingC,YuanZ,Son

23、gB,LiD,LiuY,LaiB,LiW,ChenR,ChingYP,LiM.dp5/HRK is a c-Jun target gene and required for apoptosis induced by potassiumdeprivationincerebellargranuleneurons.JBiolChem.2007;282(42):30901-30909.2.MeiY,YuanZ,SongB,LiD,MaC,HuC,ChingYP,LiM.Activatingtranscriptionfactor 3 up-regulated by c-Jun NH(2)-termina

24、l kinase/c-Jun contributes to apoptosisinduced by potassium deprivation in cerebellar granule neurons. Neuroscience.2008;151(3):771-779.3.WangW,YangY,YingC,LiW,RuanH,ZhuX,YouY,HanY,ChenR,WangY,LiM.Inhibitionofglycogensynthasekinase-3betaprotectsdopaminergicneuronsfromMPTPtoxicity.Neuropharmacology.2

25、007;52(8):1678-1684.4皮荣标皮荣标(PiRongbiao)33岁岁，博博士士学学位位，讲讲师师。2002年年毕毕业业于于中中山山大大学学，获获神神经经药药理理学学博博士士。同同年年赴赴香香港港科科技技大大学学生生物物化化学学系系从从事事博博士士后后研研究究，现现在在中中山山大大学学药药学学院院任任讲讲师师。主主要要研研究究兴兴趣趣涉涉及及神神经经保保护护药药物物的的作作用用及及其其机机制制的的研研究究。曾曾负负责责或或参参加加包包括括国国家家自自然然科科学学基基金金等等多多项项研研究究。已已发发表表或或待待发发表表论论著著近近20篇篇，其其中中SCI论文论文5篇。篇。皮皮博

26、博士士与与本本人人合合作作达达11年年，有有共共同同的的研研究究趣趣向向，作作为为共共同同作作者者发发表表多多篇篇SCI论论文文。他他掌掌握握了了本本项项目目涉涉及及的的大大部部分分实实验验方方法法和和技技术术，尤尤其其在在腺腺病病毒毒载体构建方面积累了经验（见文章）。主要负责腺病毒载体构建等工作。载体构建方面积累了经验（见文章）。主要负责腺病毒载体构建等工作。发表的相关论文发表的相关论文1.RongbiaoPi,WenmingLi,NelsonT.K.Lee,HughH.N.Chan,YongmeiPu,LingNgaChan,NikolausJ.Sucher,DoanldC.Chang,M

27、ingtaoLiandYifanHan.Minocyclinepreventsglutamate-inducedapoptosisofcerebellargranuleneuronsbydifferentialregulationofp38andAktpathways.JNeurochem.2004,91:1212-1230.2.3.项目组主要成员项目组主要成员经费申请表经费申请表申请项目同行评议意见反馈信黎明涛先生：黎明涛先生：您好！您申请的项目经专家投票表决，同意资助您好！您申请的项目经专家投票表决，同意资助。关于你的项目的同行关于你的项目的同行评议意见如下：评议意见如下：1.本项目在小脑

28、颗粒细胞撤钾的离体凋亡模型中，发现了一种直接调节本项目在小脑颗粒细胞撤钾的离体凋亡模型中，发现了一种直接调节Bim的新转录因子的新转录因子SP1，申请人试图采用腺病毒转染技术、基因突变以及分子生物申请人试图采用腺病毒转染技术、基因突变以及分子生物学方法进一步论证学方法进一步论证SP1是直接调控是直接调控bim基因的这一假说。立项具有前言性，申基因的这一假说。立项具有前言性，申请人工作基础好，并与美国请人工作基础好，并与美国Emory大学、香港大学有长期的合作条件，完全大学、香港大学有长期的合作条件，完全能够完成本项课题。建议优先资助。能够完成本项课题。建议优先资助。2.本项课题的立项依据较为充

29、分，具有一定的学术创新及科学意义。研究本项课题的立项依据较为充分，具有一定的学术创新及科学意义。研究内容明确、技术路线清晰、研究方法和方案可行。申请者有较高的学术水平，内容明确、技术路线清晰、研究方法和方案可行。申请者有较高的学术水平，以及多次主持国家自然科学基金课题的经验。同时，申请者所在单位又有比以及多次主持国家自然科学基金课题的经验。同时，申请者所在单位又有比较好的实验室及条件。建议给予资助。较好的实验室及条件。建议给予资助。3.课题研究具有较好的工作基础，研究具有较高的学术价值，建议资助。课题研究具有较好的工作基础，研究具有较高的学术价值，建议资助。4.同意资助。理由：该项目立论依据充

30、分，其重要的意义表现在澄清撤钾同意资助。理由：该项目立论依据充分，其重要的意义表现在澄清撤钾诱导神经元凋亡时，诱导神经元凋亡时，Bim上调的细胞内信号转导机制。申请者有较好的研究基上调的细胞内信号转导机制。申请者有较好的研究基础和研究能力，项目的内容设置合适，重点突出，总体方案合理，技术路线础和研究能力，项目的内容设置合适，重点突出，总体方案合理，技术路线可行，可资助。可行，可资助。5.Thisisanicelywritenproposalwithaclearaimandpracticalapproaches.Further,thegrouphaspublishedresultsrelated

31、tothecurrentproposal,indicatingtheabilityofthegrouptoperformtheexperiments.申请项目同行评议意见反馈信黎明涛先生：黎明涛先生：您好。您申请的项目经专家投票表决，同意资助。您好。您申请的项目经专家投票表决，同意资助。关于你的项目的关于你的项目的同行评议意见如下：同行评议意见如下：1.在神经退行性疾病的病理过程中，在神经退行性疾病的病理过程中，GSK-3是介导神经元凋亡的关键性激是介导神经元凋亡的关键性激酶之一，阐明其信号传导机制将有助于今后临床药物的开发，可以通过酶之一，阐明其信号传导机制将有助于今后临床药物的开发，可以通

32、过药物干扰其上游激酶的活性而改变药物干扰其上游激酶的活性而改变GSK-3活性，从而抑制疾病过程中特异活性，从而抑制疾病过程中特异神经元的凋亡。具有重要的科学意义。项目组的研究能力强，研究方案神经元的凋亡。具有重要的科学意义。项目组的研究能力强，研究方案合理，重点突出，建议优先资助。合理，重点突出，建议优先资助。2.GSK-3是一个重要的粗神经元凋亡的激酶。在神经退行病的病理发生是一个重要的粗神经元凋亡的激酶。在神经退行病的病理发生中可能起重要作用。申请人采用该酶抑制剂进行了神经保护及其机制的中可能起重要作用。申请人采用该酶抑制剂进行了神经保护及其机制的分析，并深入提出本项目的研究。立题依据较充

33、分，研究内容和设计较分析，并深入提出本项目的研究。立题依据较充分，研究内容和设计较合理，结合本人的工作基础，和上一项目完成的情况，建议考虑资助。合理，结合本人的工作基础，和上一项目完成的情况，建议考虑资助。3.GSK-3/GSK-3是促神经元凋亡的重要激酶，去极化可使其磷酸化并抑制其活性，是促神经元凋亡的重要激酶，去极化可使其磷酸化并抑制其活性，从而抑制凋亡的发生。但目前对从而抑制凋亡的发生。但目前对GSK-3磷酸化的上游激酶尚不清楚。该课题组的前磷酸化的上游激酶尚不清楚。该课题组的前期研究提示期研究提示CaMKII可能介导了可能介导了GSK-3的磷酸化。该项目拟进一步证实的磷酸化。该项目拟进

34、一步证实CaMKII与与GSK-3的直接相互作用及在去极化促神经元存活效应中的作用，有望揭示去极化调的直接相互作用及在去极化促神经元存活效应中的作用，有望揭示去极化调控控GSK-3的新机制，为确立的新机制，为确立GSK-3作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。立题新颖，研究内容合适，研究方案可行。申请人及课题组人员研究的科学依据。立题新颖，研究内容合适，研究方案可行。申请人及课题组人员研究能力强，工作基础好。能力强，工作基础好。4.神经元凋亡是神经退行性疾病等神经系统疾患的重要原因，该申请拟研究神经元凋亡是神经退行性疾病等神经系统疾患的重要

35、原因，该申请拟研究CaMKII磷酸化磷酸化GSK3对去极化介导的神经元存活的调控作用及其机制，具有重要对去极化介导的神经元存活的调控作用及其机制，具有重要科学意义与研究价值。项目在科学意义与研究价值。项目在GSK3神经元凋亡中作用的原有发现基础上，提出神经元凋亡中作用的原有发现基础上，提出的的GSK3磷酸化及其具体信号通路的工作假设具有很强的创新性与系统性。研究磷酸化及其具体信号通路的工作假设具有很强的创新性与系统性。研究目标明确，研究内容恰当，关键科学问题把握准确。展示的预实验结果，显示了申目标明确，研究内容恰当，关键科学问题把握准确。展示的预实验结果，显示了申请者在请者在GSK3信号转导通

36、路方面扎实的工作基础与研究方案的合理可行。申请者信号转导通路方面扎实的工作基础与研究方案的合理可行。申请者曾经主持并很好完成国家自然科学基金，在国际重要学术刊物发表多篇学术论文，曾经主持并很好完成国家自然科学基金，在国际重要学术刊物发表多篇学术论文，体现了突出的研究实力。建议优先资助。体现了突出的研究实力。建议优先资助。5.该项目旨在探讨去极化时该项目旨在探讨去极化时GSK3的磷酸化及其相关激酶信号通路与神经元存活关的磷酸化及其相关激酶信号通路与神经元存活关联性，申请人拟运用生物化学、细胞生物学手段进行研究。选题创新性强，研究内联性，申请人拟运用生物化学、细胞生物学手段进行研究。选题创新性强，

37、研究内容较系统，研究重点突出，所选择的关键问题准确。总体研究方案合理，研究方法容较系统，研究重点突出，所选择的关键问题准确。总体研究方案合理，研究方法和手段先进，技术路线可行。项目有相关的工作基础，研究队伍结构合理，具备相和手段先进，技术路线可行。项目有相关的工作基础，研究队伍结构合理，具备相应研究的工作条件。经费预算合理，建议优先资助。应研究的工作条件。经费预算合理，建议优先资助。获得资助的决定因素获得资助的决定因素l科学问题，创新性科学问题，创新性l工作基础、工作基础、SCISCI文章文章l依据充分依据充分l目标明确目标明确l研究内容具体研究内容具体l技术路线清晰技术路线清晰l重点突出、方

38、案合理重点突出、方案合理l国际合作国际合作可行性分析可行性分析 从从学学术思想角度提出思想角度提出1.工作基础工作基础（学术思想）（学术思想）2.科研梯队科研梯队3.实验条件实验条件4.实验技术实验技术5.交流与合作（国内、国外）交流与合作（国内、国外）申请人观察到内源性大麻素（申请人观察到内源性大麻素（Endocannabinoids,eCBs,如如2AG）可抑制）可抑制COX-2的表达，并根据的表达，并根据eCBs保护神经元这保护神经元这一事实（已有报道），推测或假设一事实（已有报道），推测或假设eCBs可能是通过抑制可能是通过抑制COX-2发挥其保护神经元的作用。项目不仅想证实这一假发挥

39、其保护神经元的作用。项目不仅想证实这一假设，而且想进一步阐明设，而且想进一步阐明eCBs抑制抑制COX-2的分子机制。但是，的分子机制。但是，不知申请人是否已有不知申请人是否已有COX-2介导神经元损伤的证据？这一介导神经元损伤的证据？这一资料的缺失使得立项依据不很充分。另外，申请人没有明资料的缺失使得立项依据不很充分。另外，申请人没有明确、具体的指出研究确、具体的指出研究eCBs抑制抑制COX-2机制的切入点。最近，机制的切入点。最近，已有报道，已有报道，eCBs通过通过PI3K/Akt通路保护神经元（通路保护神经元（SelectiveCB2receptoragonismprotectsce

40、ntralneuronsfromremoteaxotomy-inducedapoptosisthroughthePI3K/Aktpathway.JNeurosci.2009，29:4564-70）。申请人是否要）。申请人是否要避免思维定势形成，改变些思路？考虑到申请人作为第一避免思维定势形成，改变些思路？考虑到申请人作为第一作者发表了作者发表了5篇篇SCI文章，且刚从美国回来，急需基金支持，文章，且刚从美国回来，急需基金支持，建议资助。建议资助。项目创新性不明显，研究目标或科学问题不明确，项目创新性不明显，研究目标或科学问题不明确，申请书撰写非常凌乱，没有条理。项目涉及到腺病申请书撰写非常凌乱

41、，没有条理。项目涉及到腺病毒技术、毒技术、ChIP方法、质粒构建、方法、质粒构建、RT-PCR、报道基、报道基因分析和蛋白蛋白作用等分子生物学手段，但从因分析和蛋白蛋白作用等分子生物学手段，但从简历或以前文章的发表记录看，申请人没有这方面简历或以前文章的发表记录看，申请人没有这方面的经验，其分子生物学基础十分薄弱。因此，可行的经验，其分子生物学基础十分薄弱。因此，可行性极差。此外，申请人获得题为性极差。此外，申请人获得题为“MRTF-A与与ERK相互作用对脑缺血相互作用对脑缺血.”的面上项目，在研。我的面上项目，在研。我甚至担心这个在研的项目都不能完成。最后，申请甚至担心这个在研的项目都不能完

42、成。最后，申请人没有在主流人没有在主流SCI期刊上发表过文章。不予资助。期刊上发表过文章。不予资助。交流与合作交流与合作我们与国际同行建立了良好的交流渠道， 与毛子旭(ZixuMao,AssociateProfessor，BrownUniversity， 现在EmoryUniversity)、韩怡凡(YifanHan,AssociateProfessor，HongKongUniversityofScienceandTechnology)一直保持密切合作关系，我们已经共同发表了多篇SCI论文（见工作基础中的参考文献），在人员、信息、试剂和载体等多方面真正做到了互通和互惠。本人将此视为完成本项目的

43、宝贵条件之一。 创新是灵魂，是评议和能否批准的关键创新是灵魂，是评议和能否批准的关键 创新：学术创新，思想创新创新：学术创新，思想创新 新的理论新的理论 新的方法新的方法 新的体系新的体系 新的规律新的规律 源头创新：原始性源头创新：原始性 唯一性唯一性 源头：有进一步发展的前景源头：有进一步发展的前景创创 新新 性性本项目的特色与创新本项目的特色与创新 申申请请人人首首次次报报道道了了神神经经元元凋凋亡亡时时促促凋凋亡亡蛋蛋白白BimBim上上调调是是不不依依赖赖于于JNK/c-JunJNK/c-Jun通通路路( (LeyuLeyu Shi,et Shi,et al, al, Neurosc

44、iNeurosci LettLett. . 2005)2005)一一观观察察之之后后，又又以以可可靠靠的的实实验验结结果果证证明明PI3K/Akt/FKHRL1PI3K/Akt/FKHRL1信信号号通通路路也也不不参参与与bimbim的上调（见立项依据）。的上调（见立项依据）。 bimbim上上调调的的转转录录机机制制是是什什么么？我我们们率率先先对对bimbim启启动动子子进进行行了了5 5末末端端序序列列续续减减分分析析，确确立立了了诱诱导导bimbim表表达达的的启启动动子子核核心心区区， 进进而而发发现现一一个个典典型型的的转转录录因因子子SP1SP1结结合合序序列列位位于于其其中中。

45、进进一一步步实实验验显显示示：神神经经元元凋凋亡亡时时SP1SP1被被激激活活；负负显显性性SP1SP1突突变变体体和和SP1-DNASP1-DNA结结合合抑抑制制剂剂mithramycinmithramycin A A可可抑抑制制bimbim的的上上调调。根根据据以以上上生生物物信信息息学学分分析析和和实实验验观观察察，我我们们首首次次提提出出了了SP1SP1介介导导bimbim上上调调这这一一新新的的bimbim转转录录机机制制：神神经经元元凋凋亡亡时时转转录录因因子子SP1SP1被被激激活活，激激活活的的SP1SP1与与bimbim启启动动子子核核心心区区的的SP1SP1结合序列结合，从

46、而转录激活结合序列结合，从而转录激活bimbim的表达。的表达。 本项目拟进一步采用负显性本项目拟进一步采用负显性SP1SP1突变体的腺病毒表达技术以及突变体的腺病毒表达技术以及启动子点突变、启动子点突变、EMSAEMSA和和CHIPCHIP方法，旨在获得方法，旨在获得SP1SP1直接调控直接调控bimbim基因的基因的可靠证据，为阐明可靠证据，为阐明SP1SP1对促凋亡蛋白对促凋亡蛋白BimBim的调控作用和机制并进一步的调控作用和机制并进一步确立确立SP1SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。 研究基础与工作条件研究基

47、础与工作条件 突出与项目相关的工作积累突出与项目相关的工作积累1.1.研究基础研究基础 已取得的研究工作成绩及与本项目已取得的研究工作成绩及与本项目有关的研究工作积累有关的研究工作积累( (对于自由申请项目，着重对于自由申请项目，着重填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累和近五年的主要研究业绩和近五年的主要研究业绩) )2.2.工作条件工作条件 已具备的实验条件，尚缺少的实验已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径条件和拟解决的途径( (包括利用国家

48、重点实验室包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况和部门开放实验室的计划与落实情况) )研究基础研究基础 申请人近年有如下工作积累和成绩申请人近年有如下工作积累和成绩：1.申请人多年的研究兴趣主要集中在神经元凋亡的信号转导与基因调控、申请人多年的研究兴趣主要集中在神经元凋亡的信号转导与基因调控、帕金森病的研究方面，发表了帕金森病的研究方面，发表了36篇与神经元凋亡的信号转导和基因调篇与神经元凋亡的信号转导和基因调控有关的控有关的SCI论文，其中作为第一作者的有论文，其中作为第一作者的有2篇，作为通讯作者的有篇，作为通讯作者的有10篇，作为共同作者的篇，作为共同作者的有有24篇。篇

49、。2.申请人在申请人在GSK-3促神经元凋亡研究方面有着厚实的工作基础。申请促神经元凋亡研究方面有着厚实的工作基础。申请人曾发现人曾发现PKA可以直接使可以直接使GSK-3的的Ser9磷酸化并抑制其活性，并进磷酸化并抑制其活性，并进而阐明了而阐明了cAMP/PKA通过磷酸化并抑制通过磷酸化并抑制GSK-3发挥其促神经元存活发挥其促神经元存活的作用的作用(MolCellBiol,2000)。此外，申请人还证明了此外，申请人还证明了GSK-3的抑制的抑制剂可以保护黑质多巴胺神经元，并对剂可以保护黑质多巴胺神经元，并对MPTP诱导的帕金森动物模型有诱导的帕金森动物模型有很好的治疗效果很好的治疗效果(

50、Neuropharmocolgy,2007)。研究基础研究基础 3.申请人已经排除了申请人已经排除了AKT、PKA、p90RSK参与去极化时参与去极化时GSK-3磷酸化，磷酸化，经一致序列分析和抑制剂实验，提出经一致序列分析和抑制剂实验，提出CaMKII介导介导GSK-3磷酸化的可能磷酸化的可能性，进一步的体外重组激酶反应分析证明，性，进一步的体外重组激酶反应分析证明，CaMKII可直接磷酸可直接磷酸化化GSK-3Ser21/GSK-3Ser9。此外，申请人还用可靠的实验结果证明了此外，申请人还用可靠的实验结果证明了CaMKII促神经元存活作用。这些宝贵的研究资料是本项目重要的工作促神经元存活

51、作用。这些宝贵的研究资料是本项目重要的工作基础之一。基础之一。4.申请人一直进行神经元凋亡中一条重要信号转导通路申请人一直进行神经元凋亡中一条重要信号转导通路JNK/c-Jun通通路的靶基因及其对神经元凋亡调控的研究。在路的靶基因及其对神经元凋亡调控的研究。在c-Jun促凋亡靶基因的研究促凋亡靶基因的研究方面取得一定成绩：首次证实方面取得一定成绩：首次证实bim不是不是c-Jun的靶基因的靶基因(NeurosciLett,2005)，并从源头并从源头寻寻找和确立了若干介导凋亡的新的找和确立了若干介导凋亡的新的c-Jun靶基因。其中，靶基因。其中，已经完成了已经完成了c-Jun直接调控促凋亡的直

52、接调控促凋亡的BH3-only蛋白蛋白dp5的研究的研究(JBiolChem,2007)，随后又证实了随后又证实了ATF3是是c-Jun的促凋亡靶基因的促凋亡靶基因(Neuroscience,2008)。工作条件工作条件2001年年回回国国，获获得得211基基金金180万万元元，组组建建了了一一流流的的分分子子、细细胞胞生生物物学学实实验验室室。2002年年，作作为为负负责责人人获获得得一一期期985学学科科建建设设经经费费700万万元元，筹筹建建了了一一流流的的蛋蛋白白质质组组学学实实验验室室并并正正在在主主持持开开展展蛋蛋白白质质科科学学的的前前沿沿性性工工作作。近近三三年年，培培养养和和

53、汇汇聚聚了了一一支支从从事事分分子子神神经经生生物物学学和和蛋蛋白白质质组组学学研研究究的的科科研研队队伍伍。这这些些建建设设性性工工作作为为解解决决细细胞胞信信号号转转导导、基基因因调调控控以以及及本本项项目目的的核核心心问问题题奠奠定定了了扎实的基础。扎实的基础。项目负责人黎明涛所在单位项目负责人黎明涛所在单位中山大学中山医学院药理中山大学中山医学院药理教研室是教研室是211项目资助学科和国家重点学科。人才济济，科研装项目资助学科和国家重点学科。人才济济，科研装备精良。近三年，药理教研室获得学科建设资金备精良。近三年，药理教研室获得学科建设资金3000万元，已万元，已购置大型仪器如质谱仪、

54、激光共聚焦显微镜、超速离心机、流购置大型仪器如质谱仪、激光共聚焦显微镜、超速离心机、流式细胞仪、高效液相和蛋白质分离纯化系统等。这是申请者视式细胞仪、高效液相和蛋白质分离纯化系统等。这是申请者视为非常可贵的研究工作环境。为非常可贵的研究工作环境。写好申请书是申请成功的关键写好申请书是申请成功的关键 l评审实际上只评申请书评审实际上只评申请书 l学术水平高不等于成功学术水平高不等于成功 l基金评审相对公正基金评审相对公正撰写前的准备撰写前的准备l好好心情、好身体心情、好身体想好再写想好再写3h/天天l读指南、读通知读指南、读通知注意截止期注意截止期l熟知申请过程、有关规定熟知申请过程、有关规定l

55、读标书、读高手、读同行、读自己读标书、读高手、读同行、读自己l选题选题卖点：创新性卖点：创新性工作基础工作基础l沟通沟通科研科、医科处科研科、医科处 工作基础工作基础工作基础工作基础 ：本项目是在原工作基础上的继续和深入。近五年，本人本项目是在原工作基础上的继续和深入。近五年，本人共发表了共发表了1212篇篇SCISCI论文，其中作为第一作者两篇；通讯作者论文，其中作为第一作者两篇；通讯作者四篇（见工作基础）。研究方向主要集中在神经元凋亡的信四篇（见工作基础）。研究方向主要集中在神经元凋亡的信号转导和基因调控。本课题组在研究号转导和基因调控。本课题组在研究JNK/c-JunJNK/c-Jun通

56、路靶基因通路靶基因时时, ,发现发现“促凋亡蛋白促凋亡蛋白bimbim上调不依赖上调不依赖JNK/c-Jun”JNK/c-Jun”。我们首我们首次报道了神经元凋亡时次报道了神经元凋亡时JNK/c-JunJNK/c-Jun不参与不参与bimbim的上调的上调11，随，随后，我们又以可靠的证据揭示了后，我们又以可靠的证据揭示了PI3K/Akt/ FKHRL1PI3K/Akt/ FKHRL1也不介导也不介导bimbim的上调的上调( (未发表资料未发表资料) )。最近，对。最近，对bimbim的调控研究又取得了的调控研究又取得了突突 破性的进展，即发现破性的进展，即发现了了SP1SP1调控调控bim

57、bim的转录机制的转录机制( (见立项依见立项依据据) )。这些研究工作改变了以往的观点。这些研究工作改变了以往的观点, ,也是本项目重要的立也是本项目重要的立项依据之一。项依据之一。因此，我们具有完成本项目的切实可行的、扎因此，我们具有完成本项目的切实可行的、扎实的前期工作基础。实的前期工作基础。拟解决的关键问题拟解决的关键问题获得获得SP1SP1直接调控直接调控bimbim基因表达的可靠依据。基因表达的可靠依据。什么是关键问题？什么是关键问题？研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究内容或因素。研究内容或因素。为达到预期目标所必须掌握的关键技术或研究为达到预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。手段。撰写要求：找出关键问题，问题清晰，分析透彻，撰写要求：找出关键问题，问题清晰，分析透彻，合理的解决方法。合理的解决方法。谢谢谢！谢！