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1、实验顺序：先做后讲，因为中间需要等待实验顺序：先做后讲，因为中间需要等待2小时小时分组方案：分组方案： 2噬菌体裂解液噬菌体裂解液 2人涂受体菌平板和点加人涂受体菌平板和点加噬菌体噬菌体1五、实验步骤五、实验步骤 （一）（一） 噬菌体裂解液的制备（制备噬菌体裂解液的制备（制备dgal）5ml5ml供体菌供体菌3000 3000 rpmrpm10 10 minmin（多组）（多组）吸去上清吸去上清4mlPB4mlPB重悬重悬防止污染！防止污染！重悬液重悬液取取2 2mlml打开盖，打开盖，UV 15SUV 15S加加2 2ml ml 2 2LBLB 轻摇混匀轻摇混匀盖上盖，盖上盖，3737避光避
2、光（抑制光修复）（抑制光修复）21-N：张三张三 李四李四 王五王五 赵六赵六1. 按右图在按右图在EMB平板平板上做好标记上做好标记2. 用受体菌涂出两条菌用受体菌涂出两条菌带（带（1-2环菌环菌/条）条）3. 37倒置倒置培养培养1.5小时小时（二）转导（点滴法）的步骤（二）转导（点滴法）的步骤3实验七、细菌的局限性转导实验七、细菌的局限性转导一、实验目的一、实验目的（一）了解转导的基本原理（一）了解转导的基本原理（二）（二） 掌握转导实验的基本方法掌握转导实验的基本方法（三）验证细菌遗传物质可以通过噬菌体转移（三）验证细菌遗传物质可以通过噬菌体转移二、实验原理二、实验原理 ( (一）转导
3、的概念：一）转导的概念：转导转导是以噬菌体为媒介所进行的细是以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质的重组过程。在这一过程中，细菌的一段菌遗传物质的重组过程。在这一过程中，细菌的一段染色体被错误地包装在噬菌体的蛋白质外壳内，并通染色体被错误地包装在噬菌体的蛋白质外壳内，并通过感染而转移到到另一个受体细菌内过感染而转移到到另一个受体细菌内4Joshua Lederberg (1925-2008)1958年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖（二）转导的发现（二）转导的发现 由由Lederberg和和Zinder于于1952年发现年发现5鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的两
4、种营养缺陷型的两种营养缺陷型LA2: phe+trp+tyr+his-LA22: phe-trp-tyr-his+基本培养基基本培养基基本培养基基本培养基单独培养单独培养6基本培养基基本培养基LA22 + LA2混合培养混合培养LA2: phe+trp+tyr+his-LA22: phe-trp-tyr-his+7LA22LA2FA?U U形管培养形管培养LA2: phe+trp+tyr+his-LA22: phe-trp-tyr-his+吹吹/ /吸吸8LA22菌株菌株上清液上清液基本培养基基本培养基+ RNA酶酶+ LA2菌株菌株+ DNA酶酶 + LA2菌株菌株基本培养基基本培养基噬菌体
5、介导的遗传物质转移噬菌体介导的遗传物质转移转导转导菌落裂解？菌落裂解？P22发生机理发生机理“We werent looking for transduction-we bumped into it”. 9( (三）转导的类型三）转导的类型P22噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体1. 普遍性转导普遍性转导可以转导细可以转导细菌染色体组的任何部分，菌染色体组的任何部分，例如例如P22噬菌体介导的转噬菌体介导的转导导2. 局限性转导局限性转导只能转导细只能转导细菌染色体组的特定部分，菌染色体组的特定部分，例如例如噬菌体介导的转导噬菌体介导的转导10ABBB A转导噬菌体转导噬菌体普遍性转导普遍性转导可以转导
6、细菌染色体组的任何部分可以转导细菌染色体组的任何部分（例如：（例如：P22噬菌体）噬菌体）A基因组的基因组的任何部分任何部分都可能通过转导噬菌体进入都可能通过转导噬菌体进入B基因组基因组11细菌染色体细菌染色体 (dgal+) (dbio+)原噬菌体原噬菌体局限性转导局限性转导只能转导细菌染色体组的特定部分只能转导细菌染色体组的特定部分（例如（例如:噬菌体只能插到宿主基因组的噬菌体只能插到宿主基因组的gal和和bio之间，之间，所以只能转移所以只能转移gal或或bio基因）基因）12l噬菌体噬菌体由外壳蛋白和由外壳蛋白和DNA组成组成基因组基因组DNA全长全长48.5kb至少有至少有61个基因
7、个基因头部的头部的包装上限包装上限为为51kb（四）本实验的原理（四）本实验的原理135 GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGA 5 33coscoscos环化环化噬菌体噬菌体DNADNA的环化的环化14ADCB噬菌体噬菌体DNADNA插入大肠杆菌基因组插入大肠杆菌基因组ADCB溶源性溶源性细菌细菌原噬菌体原噬菌体细菌基因组细菌基因组DNADNAgal +15插入宿主菌基因组的插入宿主菌基因组的原噬菌体原噬菌体随宿主菌的分裂而增殖，当随宿主菌的分裂而增殖，当受到紫外线照射或温度改变时可以造成受到紫外线照射或温度改变时可以造成阻遏物阻遏物失活，使裂失活，使裂解相关基因表达，噬菌体解相关
8、基因表达，噬菌体DNA环出、复制、转录、翻译、环出、复制、转录、翻译、包装，细菌裂解，释放出数百个新噬菌体包装，细菌裂解，释放出数百个新噬菌体环出、复制、转录、环出、复制、转录、翻译、包装翻译、包装裂解裂解释放子代噬菌体释放子代噬菌体16在环出、复制、包装过程中偶尔会发生错误而产生在环出、复制、包装过程中偶尔会发生错误而产生转导噬菌体转导噬菌体（频率（频率10-6)转导噬菌体转导噬菌体能感染宿主菌，但由于能感染宿主菌，但由于DNA缺失，不能缺失，不能独立完成复制、包装等过程，所以是缺陷噬菌体独立完成复制、包装等过程，所以是缺陷噬菌体溶菌控制晚期控制DNA合成控制阻遏早期控制重重组组删删除除与与
9、整整合合尾部合成头部合成噬菌体基因组噬菌体基因组DNADNA各部分的功能各部分的功能17 (dgal+)E. coli K12S galE. coli K12S gal受体菌受体菌受体菌受体菌半乳糖半乳糖EMBEMB培养基培养基通过转导噬菌体获得通过转导噬菌体获得gal+基因的受体菌称为基因的受体菌称为转导子转导子转导子转导子因能利用半乳糖而产生大量的酸，在因能利用半乳糖而产生大量的酸，在EMBEMB培养基培养基上显示为上显示为紫色紫色, ,并带有金属光泽并带有金属光泽gal+转导子转导子gal -非转导子非转导子非转导子非转导子因不能利用半乳糖而不产生大量酸，在因不能利用半乳糖而不产生大量酸
10、，在EMBEMB培养培养基上显示为基上显示为白色白色18E. coli K12() gal+是一种是一种双重溶源菌双重溶源菌(dgal+)裂解液中裂解液中 (dgal+) (转导噬菌体转导噬菌体)占占50%l(正常噬菌体正常噬菌体)占占50%宿主菌染色体宿主菌染色体本实验所用的供体菌本实验所用的供体菌19三、实验材料三、实验材料 供体菌供体菌：E. coli K12()gal+ 受体菌受体菌：E. coli K12S gal-四、实验器具和药品四、实验器具和药品 1. 器具：培养皿，试管，离心管，接种棒，移液器器具：培养皿，试管，离心管，接种棒，移液器 2. 培养基：培养基：LB液体培养基，液
11、体培养基，2LB液体培养基，半乳糖液体培养基，半乳糖EMB培养基。（配制方法见遗传学实验指导）培养基。（配制方法见遗传学实验指导） 3、试剂：磷酸缓冲液（、试剂：磷酸缓冲液（PB）、）、氯仿氯仿 20五、实验步骤五、实验步骤 （一）（一） 噬菌体裂解液的制备（制备噬菌体裂解液的制备（制备dgal）3737过夜过夜取取1 1mlml100 ml LB5ml5ml供体菌供体菌37 37 3 hr3000 3000 rpmrpm10 10 minmin（多组）（多组）E. coli K12()gal+吸去上清吸去上清4mlPB4mlPB重悬重悬防止污染！防止污染！213000 3000 rpmrpm
12、10 10 minmin（多组）（多组）噬菌体噬菌体裂解液裂解液细胞碎片细胞碎片重悬液重悬液取取2 2mlml噬菌体噬菌体裂解液裂解液取取1ml1ml打开盖，打开盖，UV 15SUV 15S（诱发（诱发SOSSOS反应）反应）加加0.20.2mlml氯仿氯仿剧烈震荡剧烈震荡30秒秒（促进裂解）（促进裂解）2 2hrhr后移入后移入离心管离心管盖上盖，盖上盖，3737避光避光（抑制光修复）（抑制光修复）加加2 2ml ml 2 2LBLB 轻摇混匀轻摇混匀221-N：张三张三 李四李四 王五王五 赵六赵六1. 按右图在按右图在EMB平板平板上做好标记上做好标记2. 用受体菌涂出两条菌用受体菌涂出
13、两条菌带（带（1-2环菌环菌/条）条）3. 37倒置倒置培养培养1.5小时小时4. 在两个圆圈中各接种在两个圆圈中各接种一环一环噬菌体噬菌体5. 在四个方格中各接种一环在四个方格中各接种一环噬菌体噬菌体 (防止污染）防止污染）6. 37倒置倒置培养培养48-72小时后观察结果小时后观察结果（二）转导（点滴法）的步骤（二）转导（点滴法）的步骤23实验材料实验材料 供体菌供体菌（gal，用于制裂解液，分发，用于制裂解液，分发，1 1管管/ /组组） 半乳糖半乳糖EMB平板平板（超净台内，（超净台内，2 2块块/ /组组） 灭菌空培养皿灭菌空培养皿（超净台内，（超净台内，1 1个个/ /组组） 灭菌
14、离心管灭菌离心管（超净台内，（超净台内，2 2支支/ /组组） 受体菌受体菌（gal，用于涂用于涂EMBEMB平板，超净台内，公用平板，超净台内，公用） PB（磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，超净台内，公用超净台内，公用） 2LB （超净台内，公用超净台内，公用） 氯仿氯仿（超净台内，公用超净台内，公用）仪器设备仪器设备 离心机离心机（201201室右侧，公用）室右侧，公用） 培养箱培养箱（206206室右侧，公用）室右侧，公用）24本实验的结果讨论本实验的结果讨论张三张三 李四李四 王五王五 赵六赵六日期日期25作业：作业：完成实验报告完成实验报告图示图示噬菌体转移噬菌体转移半乳糖发酵基因的半乳糖发酵基因的过程过程在点滴法细菌转导试验中，设置裂解在点滴法细菌转导试验中，设置裂解液对照圈的意义是什么？液对照圈的意义是什么？26E. coli K12S galE. coli K12S gal2728
