《酶蛋白的结构PPT课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶蛋白的结构PPT课件（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三章第三章 酶蛋白的构造酶蛋白的构造 v蛋白质的一级构造蛋白质的一级构造primarystructurev蛋白质的二级构造蛋白质的二级构造secondarystructurev蛋白质的三级构造蛋白质的三级构造tertiarystructurev蛋白质的四级构造蛋白质的四级构造quaternarystructure蛋白质构造和功能的关系蛋白质构造和功能的关系v举例：例：镰刀状刀状细胞胞贫血病血病v镰刀状刀状细胞胞贫血病是最早被血病是最早被认识的一种分子病，流行于非洲的的一种分子病，流行于非洲的一些地域，患者的一些地域，患者的红细胞形状异常，有很多呈新月状或胞形状异常，有很多呈新月状或镰刀状，刀
2、状，在在红细胞脱氧胞脱氧时镰刀状刀状细胞数量添加，胞数量添加，严重重时导致致红细胞破裂、胞破裂、溶血而致命。溶血而致命。v镰刀状刀状红细胞胞产生的生的缘由是患者的血由是患者的血红蛋白异常。血蛋白异常。血红蛋白是蛋白是红细胞内起携胞内起携带氧气功能的一种重要的蛋白氧气功能的一种重要的蛋白质，是一种四聚体，是一种四聚体蛋白蛋白质，由两个，由两个亚基和两个基和两个亚基基组成成22，其中，其中亚基基包含包含141个氨基酸残基，个氨基酸残基，亚基包含基包含146个氨基酸残基。个氨基酸残基。镰刀状刀状细胞胞贫血病患者由于基因突血病患者由于基因突变，其血，其血红蛋白蛋白HbS的的亚基基N末端第末端第6号位的
3、氨基酸由原来正常血号位的氨基酸由原来正常血红蛋白蛋白HbA的高度的高度极性的极性的Glu变成了非极性的成了非极性的Valv这种种改改动导致致血血红蛋蛋白白外外表表电荷荷减减少少，在在脱脱氧氧形形状状下下溶溶解解度度下下降降，发生生不不正正常常聚聚集集，构构成成镰刀刀状状红细胞胞，严重重时呵呵斥斥红细胞胞破破裂裂。血血红蛋蛋白白分分子子共共有有574个个氨氨基基酸酸残残基基组成成，仅仅两两个个亚基基上上各各改改动了了一一个个氨氨基基酸酸残残基基，生生理理功功能能就就发生生了了如如此此大大的的变化，可化，可见蛋白蛋白质的一的一级构造构造对功能的影响之大。功能的影响之大。v牛胰核糖核酸牛胰核糖核酸酶
4、复性复性实验v8个个CysSH构成构成4个二硫个二硫键的的组合方式有合方式有753=105种，因此重新构成正确配种，因此重新构成正确配对的概率的概率仅1/105，第一节第一节 蛋白质一级构造研讨方法蛋白质一级构造研讨方法 v1.蛋白质的分别纯化和相对分子质量的测定蛋白质的分别纯化和相对分子质量的测定v2.确定蛋白质分子中多肽链的数目确定蛋白质分子中多肽链的数目v3.拆分并分别蛋白质分子的多肽链拆分并分别蛋白质分子的多肽链v4.测定每条多肽链的氨基酸组成测定每条多肽链的氨基酸组成v5.多肽链的多肽链的N末端和末端和C末端分析末端分析v6.多肽链的部分断裂和肽段的分别多肽链的部分断裂和肽段的分别v
5、7.测定各个肽段的氨基酸顺序测定各个肽段的氨基酸顺序v8.确定肽段在多肽链中的次序从而陈列出多肽链的氨基酸顺序确定肽段在多肽链中的次序从而陈列出多肽链的氨基酸顺序v9.多肽链中二硫键位置确实定多肽链中二硫键位置确实定v1.蛋白质的分别纯化和相对分子质量的测定蛋白质的分别纯化和相对分子质量的测定v电泳单一带电泳单一带vSDSPAGE测分子量质谱法测分子量质谱法v2.2.确定蛋白质分子中多肽链的数目确定蛋白质分子中多肽链的数目v末端分析法末端分析法v3. 3. 拆分并分别蛋白质分子的多肽链拆分并分别蛋白质分子的多肽链v氧化法氧化法v氧化法的优点在于二硫键一旦拆开，氧化法的优点在于二硫键一旦拆开，不
6、会重新构成衔接，但在氧化过程中不会重新构成衔接，但在氧化过程中伴随着一些副反响，伴随着一些副反响，MetMet侧链被氧化侧链被氧化生成亚砜，生成亚砜，TrpTrp侧链被破坏。侧链被破坏。 v复原法复原法v为了防止游离巯基重新氧化，还需参为了防止游离巯基重新氧化，还需参与烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取与烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取代反响而不会重新被氧化代反响而不会重新被氧化 4.测定每条多定每条多肽链的氨基酸的氨基酸组成成蛋白蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸氨基酸1酸水解：酸水解：作水解程度作水解程度时间图确定最正确确定最正确时间110mg蛋白蛋白样品品
7、加加HCl抽真空抽真空封封锁烘箱烘箱特点：特点：aTrp完全破坏，生成不溶性物完全破坏，生成不溶性物质bSer、Thr、Tyr部分破坏，部分破坏，Ser破坏破坏1015%，Thr、Tyr破坏破坏510%，应予以校予以校正正cAsnAspGluGlnd胱氨酸胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸e大部分氨基酸不破坏大部分氨基酸不破坏v2碱水解：碱水解：v特点：特点：a)Trp不破坏不破坏b大部分氨基酸破坏大部分氨基酸破坏v分分别别检检测测：1纸纸层层；2薄薄层层；3离离交交；4氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪5.多肽链的多肽链的N末端和末端和C末端分析末端分析目的：有几条肽链；目的：有几条肽链；N、C末端是何氨
8、基酸末端是何氨基酸测不出末端的几种缘由：蛋白质分子为环肽；测不出末端的几种缘由：蛋白质分子为环肽；末端被维护试剂维护；末端是末端被维护试剂维护；末端是Pro51N端测定引见原理、分别检测方法和端测定引见原理、分别检测方法和优缺陷优缺陷1FDNB法法Sanger法；法；2.4二硝基氟苯法二硝基氟苯法a原理：原理：vb)分分别检测：乙乙醚萃萃取取，DNPAa溶溶于于乙乙醚而而Aa不溶不溶v规范范Aa+DNP反响反响纸层喷茚三三酮v未知未知DNPAa纸层喷茚三三酮v比比较即即得得结果果，假假设结果果是是两两点点以以上上那那么么证明明是有几条是有几条肽链组成成vc优点：反响条件温暖，末端点：反响条件温
9、暖，末端产物易分物易分别v缺陷：缺陷：N端是端是Pro测不出；不能不出；不能进展展N端端测序序vLys的的另另一一氨氨基基生生成成eDNPLys，由由于于它它不不溶溶于于乙乙醚故不影响故不影响测定定结果果v2) 2) 丹磺酰氯法丹磺酰氯法DNSDNS法法 va) a) 原理：原理：vb分分别检测：DNSAa溶于乙酸乙溶于乙酸乙酯，Aa不溶不溶v规范范Aa+DNS反响反响纸层荧光光显色色v未知未知DNSAa纸层荧光光显色色v比比较即即得得结果果，假假设结果果是是两两点点以以上上那那么么证明明是是有有几条几条肽链组成成vc优点点：灵灵敏敏度度高高；是是前前种种方方法法的的100倍倍；用用量量少少，
10、样品量品量为0.12ngv缺缺陷陷：DNSPro、DNSTry被被破破坏坏；N端端是是Pro、Try测不出；不能不出；不能进展展N端端测序序v3) Edman3) Edman降解法降解法 苯异硫氰酸酯法苯异硫氰酸酯法PITCPITC法法)va) a) 原理：原理：v a a分别检测：分别检测：PTH-AaPTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，AaAa不溶不溶vc c优点：优点：N N端是端是ProPro可测；能进展可测；能进展N N端测序端测序 v 缺陷：灵敏度稍差缺陷：灵敏度稍差 v4DansyClEdman法法v既可检测既可检测N端序列又有较高灵敏度端序列又有较高灵敏
11、度v5) 5) 亮氨酸氨肽酶法亮氨酸氨肽酶法 v此酶专注水解此酶专注水解N N端羧基构成的肽键，可测端羧基构成的肽键，可测N N端序端序列，但不能测列，但不能测N N端为端为Pro.Pro.v52C末端分析末端分析vC末端分析方法也有很多，但至今还不能令人末端分析方法也有很多，但至今还不能令人称心，常用的有肼解法、复原法、羧肽酶法等。称心，常用的有肼解法、复原法、羧肽酶法等。v1肼解法肼解法v原理：原理：vb分分别检测：v苯甲苯甲醛+酰肼沉淀沉淀离心离心v上清液中含游离基酸上清液中含游离基酸v2)复原法复原法v用用复复原原剂如如硼硼氢化化锂处置置肽链，那那么么C末末端端残残基基的的羧基基被被复
12、复原原成成醇醇，将将肽链完完全全水水解解后后，分分析析水水解解产物物，其其中中的的氨氨基基醇醇对应的的即即为C末端氨基酸。末端氨基酸。v3)羧肽酶法羧肽酶法v羧羧肽肽酶酶是是一一种种专专注注从从多多肽肽链链的的C末末端端开开场场逐逐个个水水解解氨氨基基酸酸残残基基的的蛋蛋白白水水解解酶酶。由由于于该该酶酶的的专专注注性性，当当它它作作用用于于多多肽肽链链时时，C末末端端残残基基首首先先被被水水解解下下来来，然然后后是是C末末端端第第二二个个氨氨基基酸酸残残基基，依依此此类类推推。根根据据氨氨基基酸酸释释放放的的动动力力学学曲曲线线，可可以以确确定定C末末端端氨氨基基酸酸以以及及接接近近C末末端
13、端的的几几个个氨氨基基酸酸的的陈陈列列顺顺序序。不不过过这这是是理理想想的的情情况况，实实践践测测定定中中经经常常有有多多种种要要素素干干扰扰，很很难难确确定定C末末端端多多个氨基酸的陈列顺序。个氨基酸的陈列顺序。v羧肽酶羧肽酶A：aLys、His、Arg在在C末端不能水解末端不能水解vbC末端是末端是Pro不能水解不能水解vcC末末端端第第二二个个是是Pro，无无论论第第一一个个是是何何氨氨基基酸酸都都不不能水解能水解v羧肽酶羧肽酶B：a水解水解C末端为末端为Lys、His、Arg的的vbC末末端端第第二二个个是是Pro，无无论论第第一一个个是是何何氨氨基基酸酸都都不不能水解能水解v6.6.
14、多肽链的部分断裂和肽段的分别多肽链的部分断裂和肽段的分别v在氨基酸顺序测定时，只需从肽链某一在氨基酸顺序测定时，只需从肽链某一末端通常是末端通常是N-N-末端起逐个将氨基酸末端起逐个将氨基酸残基断裂下来，并对游离出来的氨基酸残基断裂下来，并对游离出来的氨基酸或其衍生物进展鉴定，就可以确定氨基或其衍生物进展鉴定，就可以确定氨基酸序列。但是实践操作时，由于每次末酸序列。但是实践操作时，由于每次末端氨基酸残基发生断裂的效率不能到达端氨基酸残基发生断裂的效率不能到达100%100%，或者说，在大多数肽段在断裂第，或者说，在大多数肽段在断裂第二个氨基酸残基时，少数肽段能够由于二个氨基酸残基时，少数肽段能
15、够由于上一轮未发生反响而正在断裂第一个氨上一轮未发生反响而正在断裂第一个氨基酸残基，这样势必给测定带来干扰。基酸残基，这样势必给测定带来干扰。假设肽链很短，这样的干扰不会对测定假设肽链很短，这样的干扰不会对测定产生艰苦影响；但蛋白质肽链的长度都产生艰苦影响；但蛋白质肽链的长度都超出这一范围，这样测定将无法进展下超出这一范围，这样测定将无法进展下去。所以人们首先需将肽链进展适当的去。所以人们首先需将肽链进展适当的分解，将其断裂成假设干长度适宜的肽分解，将其断裂成假设干长度适宜的肽段，再分别测定这些肽段的氨基酸顺序。段，再分别测定这些肽段的氨基酸顺序。1 1溴化溴化氰裂解法：裂解法：BrCNBrC
16、N：专注水解注水解MetMet羧基构成的基构成的键优点：点：专注性注性强，切点少，切点少，产率高率高85%85% * * 弱酸、弱碱也可使弱酸、弱碱也可使肽链水解但水解但专注性不好注性不好2 2酶解法：解法：胰胰酶：水解碱性氨基酸：水解碱性氨基酸羧基所构成的基所构成的键LysLys，ArgArg* * 碱性氨基酸的碱性氨基酸的羧基基衔接的是接的是ProPro那么不能水解。那么不能水解。糜蛋白糜蛋白酶胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶：专注性水解芳香族氨基酸注性水解芳香族氨基酸羧基所构基所构成的成的键PhePhe，TryTry，TyrTyr。* * 假假设芳香族氨基酸的芳香族氨基酸的羧基基衔接的是接的是Pr
17、oPro那么不能水解。那么不能水解。 分分别肽链可用：分子可用：分子筛；离子交；离子交换；等点聚焦；等点聚焦电泳法泳法7.测定各个定各个肽段的氨基酸段的氨基酸顺序序测定定肽段的氨基酸段的氨基酸顺序的方法有：序的方法有：Edman降解法、降解法、酶解法、气相色解法、气相色谱质谱联用法用法等，其中最常运用的是等，其中最常运用的是Edman降解法。降解法。Edman降解法的原理是利用前述苯异硫降解法的原理是利用前述苯异硫氰酸酸酯PITC，又称，又称Edman试剂与与N末末端氨基酸残基的端氨基酸残基的氨基之氨基之间的特异性反响，的特异性反响，每每轮反响后反响后N末端氨基酸零落，并生成末端氨基酸零落，并
18、生成PTH氨基酸。氨基酸。经过层析等方法析等方法鉴定定PTH氨基酸的种氨基酸的种类，就可以确定，就可以确定肽链中中对应位位置的氨基酸。置的氨基酸。经过n轮反响，即可确定由反响，即可确定由肽段中段中N末端起末端起n个氨基酸的个氨基酸的顺序。序。8.8.确定肽段在多肽链中的次序从而陈列出多确定肽段在多肽链中的次序从而陈列出多肽链的氨基酸顺序肽链的氨基酸顺序至此，曾经得出了多肽链被断裂成的各个肽至此，曾经得出了多肽链被断裂成的各个肽段的氨基酸顺序，但由于没有这些肽段在段的氨基酸顺序，但由于没有这些肽段在多肽链中次序的信息，还是无法排出整个多肽链中次序的信息，还是无法排出整个多肽链的氨基酸顺序。为此，
19、必需用两种多肽链的氨基酸顺序。为此，必需用两种或者两种以上的方法来断裂多肽链，比如或者两种以上的方法来断裂多肽链，比如用两种蛋白酶分别水解多肽链，将得到两用两种蛋白酶分别水解多肽链，将得到两套断裂位点不同的肽段，分别确定这两套套断裂位点不同的肽段，分别确定这两套肽段的氨基酸顺序，然后利用这两套肽段肽段的氨基酸顺序，然后利用这两套肽段的氨基酸顺序彼此之间有交错重叠，可以的氨基酸顺序彼此之间有交错重叠，可以确定整条多肽链的氨基酸顺序。确定整条多肽链的氨基酸顺序。v经经过过末末端端分分析析得得到到：N末末端端残残基基为为I，C末末端端残残基为基为Lv用用胰胰蛋蛋白白酶酶水水解解得得到到第第一一套套肽
20、肽段段，测测定定出出氨氨基基酸顺序分别为：酸顺序分别为：vMTYAGKISREALCAFRDALKv用用胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶水水解解得得到到第第二二套套肽肽段段，测测定定出出氨基酸顺序分别为：氨基酸顺序分别为：vTYREALAGKDALISRMKCAFv由由于于N末末端端残残基基为为I，ISR和和ISRM是是N末末端端肽肽段段；又又由由于于C末末端端残残基基为为L，EAL和和REAL是是C末末端端肽肽段段。利利用用两两套套肽肽段段的的氨氨基基酸酸顺顺序序彼彼此此之之间间的的重重叠叠关关系系，得得出：出：v第第一一套套肽肽段段：N末末端端ISRMTYAGKDALKCAFREALC末端末端v第
21、第二二套套肽肽段段：N末末端端ISRMTYAGKDALKCAFREALC末端末端v推出完好肽链顺序：推出完好肽链顺序：vISRMTYAGKDALKCAFREALv在在上上例例中中，两两套套肽肽段段之之间间正正好好可可以以相相互互跨跨过过切切口口而而重重叠叠，从从而而能能确确定定出出肽肽段段在在多多肽肽链链中中的的位位置置，拼拼凑凑出出整整条肽链的氨基酸顺序。条肽链的氨基酸顺序。v9.多多肽链中二硫中二硫键位置确位置确实定定v对于含有二硫于含有二硫键的蛋白的蛋白质，我，我们在分析多在分析多肽链氨基酸氨基酸顺序前先将其拆开，然而在序前先将其拆开，然而在测定完多定完多肽链氨基酸氨基酸顺序后需求确定序
22、后需求确定链内和内和链间二硫二硫键的的位置，常用的方法是位置，常用的方法是对角角线电泳法。不拆开二泳法。不拆开二硫硫键直接用蛋白直接用蛋白酶水解蛋白水解蛋白质，所得，所得肽段段样品品点点样到到滤纸中央的中央的电泳原点，在第一个方向上泳原点，在第一个方向上进展展电泳，那么不同的泳，那么不同的肽段按其所段按其所带电荷和分荷和分子大小分子大小分别。终了后将了后将滤纸在在过甲酸蒸气中熏，甲酸蒸气中熏，二硫二硫键被氧化和拆开。将被氧化和拆开。将滤纸旋旋转90，在一，在一样条件下条件下进展第二个方向上的展第二个方向上的电泳。泳。这时，对于于不含二硫不含二硫键的的肽段，由于没有段，由于没有发生生变化，化，电
23、泳泳迁移率不迁移率不变，电泳后位置泳后位置应处于于对角角线上；而上；而含有二硫含有二硫键的的肽段，其大小和段，其大小和电荷荷发生了生了变化，化，电泳迁移率也要改泳迁移率也要改动，电泳后位置偏离泳后位置偏离对角角线，将将这些些肽段提取出来，段提取出来，进展氨基酸展氨基酸顺序分析，序分析，与曾与曾经测定的多定的多肽链氨基酸氨基酸顺序相比序相比较，即可，即可推断出二硫推断出二硫键的位置。的位置。v除除了了上上述述经经典典的的蛋蛋白白质质一一级级构构造造测测定定方方法法外外，由由于于核核苷苷酸酸序序列列测测定定技技术术开开展展迅迅速速，目目前前DNA的的核核苷苷酸酸序序列列测测定定已已完完全全实实现现
24、自自动动化化，而而蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸顺顺序序是是由由DNA所所决决议议的的，人人们们经经过过提提纯纯指指点点蛋蛋白白质质合合成成的的mRNA，再再将将mRNA经经过过逆逆转转录录作作用用得得到到cDNA，并并扩扩增增cDNA，然然后后测测定定其其核核苷苷酸酸序序列列，根根据据三三联联体体遗遗传传密密码码规规那那么可确定出蛋白质的氨基酸顺序。么可确定出蛋白质的氨基酸顺序。v到到目目前前为为止止，已已有有10万万种种以以上上的的蛋蛋白白质质完完成成了了一一级级构构造造的的测测定定，对对于于大大多多数数常常见见蛋蛋白白质质，经经过查阅数据库，可得到关于一级构造的资料。过查阅数据库，可得到关
25、于一级构造的资料。第二节第二节 蛋白质空间构造的研讨方法蛋白质空间构造的研讨方法v二二级构构造造：a螺螺旋旋ahelix)；b片片层(sheet)；b转角角(turn)；无；无规卷曲卷曲(random)v维持持键：氢键、疏疏水水键、范范德德华力力、离离子子键、配配位位键等等vR基基团对a螺螺旋旋的的影影响响：a)构构成成a螺螺旋旋要要求求R不不太太大大，不不带电荷荷b几几个个相相连的的氨氨基基酸酸的的R带同同种种电荷荷，不不构构成成a螺螺旋旋cR带电荷荷但但延延续，可可构构成成a螺旋螺旋v*=57，=47是是构构成成a螺螺旋旋的的条条件件，不不满足足此条件不能构成此条件不能构成a螺旋螺旋v*G
26、ly不不参参与与a螺螺旋旋，缘由由：Gly的的aC上上连两两个个H，故，故、无法确定无法确定v*Pro、Hyp不不参参与与a螺螺旋旋，缘由由：不不构构成成角角；空空间妨碍不构成妨碍不构成氢键v=119，=+113时，蛋蛋白白质分分子子成成平平行行的的b片片层v=，=+时，蛋白，蛋白质分子成反平行的分子成反平行的b片片层v从能量上看，反平行式要比平行式更从能量上看，反平行式要比平行式更稳定。定。 三级构造二级构造进一步卷曲构成,具有三级构造的蛋白普通为球形或椭球形纤维蛋白具有超二级构造(超螺旋)四级构造具有独立的三级构造间的构造 晶体蛋白晶体蛋白测定定X光光衍衍射射古古老老的的方方法法，1958
27、年年英英国国科科学学家家开开场运运用用，分分辨辨率率6A0，目目前前分分辨辨率率1.4A0，我我国国X光光衍衍射射仪分分辨辨率率1.8A0，测胰胰岛素构造。素构造。缺陷：只能缺陷：只能测晶体，不能晶体，不能测溶液。溶液。不能不能测氢原子位置，故原子位置，故测不出不出氢键的作用。的作用。只能只能测静静态酶构造，无法构造，无法测酶催化反响的催化反响的动态。目前有目前有较新的新的实验方法方法中子衍射。中子衍射。溶液中构象的溶液中构象的测定定a)紫紫外外吸吸收收法法常常用用方方法法：Try，Tyr，Phe在在紫紫外外波波长范范围有有最最大大光光吸吸收收，产生生紫紫外外吸吸收收光光谱。受受pH、溶溶剂或
28、或临近近分分子子、临近近发色色团的的相相对取取向向影影响。响。目前用紫外吸收法可以目前用紫外吸收法可以讨论以下以下问题：芳芳香香族族氨氨基基酸酸在在外外表表？在在内内部部？极极性性环境境？非非极极性性环境境？数数量量？(氨氨基基酸酸由由极极性性到到非非极极性性，上上升升。极极性性溶溶液液中中，氨氨基基酸酸在在蛋蛋白白中中，大大于于游游离离时，一一定定在在蛋蛋白白内内部部且且被被非非极极性性氨氨基基酸酸包包围。极极性性变化化对，影响大，氨基酸一定在外表。影响大，氨基酸一定在外表。外外界界条条件件影影响响，二二级、三三级构构造造有有无无变化化？变化化过程程？vb)荧光光光光谱法法vTyr，Try，
29、Phe能能发射射荧光光。最最大大荧光光强度度波波长为348nm、303nm、282nm，发光光强度度Try：Tyr：Phe=100：9：0.5。故故普普通以通以Try为准，准，荧光的灵敏度是紫外的光的灵敏度是紫外的103104倍。倍。v用用荧光光光光谱法法可可研研讨蛋蛋白白质分分子子的的构构象象变化化、酶活活性性部部位位构构造造、Try和和Tyr残基的微残基的微环境、蛋白量境、蛋白量变性。性。v蛋白位于极性溶蛋白位于极性溶剂时，max短波，短波，Try进入蛋白内部非极性区。入蛋白内部非极性区。v蛋白位于非非极性溶蛋白位于非非极性溶剂，max短波，短波，Try到蛋白外表。到蛋白外表。v紫外紫外测
30、值，纯酶需配成需配成0.5mg/mlv荧光光测值，纯酶需配成需配成0.035mg/mlv研研讨酶活活性性部部位位普普通通要要引引入入一一个个荧光光探探针.此此试剂要要求求与与酶结合合结实、不不影影响响底底物物结合合。探探针在在水水中中，荧光光很很小小；在在非非极极性性中中增大。增大。v例例：酶+荧光光标志志的的底底物物：荧光光强度度上上升升，峰峰值移移向向短短波波,酶活活部位是疏水区部位是疏水区vc)园二色园二色谱法法CD谱vCD光光谱图：远紫紫外外区区185nm245nm，吸吸光光是是肽键所所致致，故故可可看看出出主主链，可可算算出出螺螺旋、旋、折叠的含量。折叠的含量。v近近紫紫外外区区24
31、5nm320nm，吸吸光光是是Tyr、Trp、Phe所所致致，故故可可看看出出芳芳香香族族氨氨基基酸酸所所在在的微的微环境。境。v至至今今为止止人人们还无无法法做做到到直直接接察察看看蛋蛋白白质分分子子中中原原子子和和原原子子团的的陈列列，光光学学显微微镜的的最最大大分分辨辨率率在在0.2m，而而蛋蛋白白质分分子子内内各各原原子子之之间的的间隔隔在在0.1nm左左右右。目目前前人人们对蛋蛋白白质的的空空间构构造造进展展研研讨都都是是借借助助于于一一些些辐射射方方法法，常常见的的包包括括X射射线衍衍射射法法、核核磁磁共共振振、荧光光光光谱法法、旋旋光光色色散散、圆二二色色性性、拉拉曼曼光光谱、扫
32、描描隧隧道道显微微技技术、原原子力子力显微技微技术，等等。，等等。v例例1氨氨基基酸酸组成成Phe+Pro+2Lys+GluEdman降降解解PTHGlu，胰胰酶，羧肽酶A、B均均不不可可水水解成氨基酸或小解成氨基酸或小肽，求，求顺序。序。v例例2：A肽经酸解得酸解得:vLys+His+Asp+2Glu+Ala+Val+Tyr+2NH3。v经FDNB得得DNPAspv经羧肽酶得得Valv经胰胰酶得得1Lys+Asp+Glu+Ala+TyrPH6.4是是等等电点点2His+Glu+ValPH6.4带+电荷荷v2经FDNB得得DNPHis。v经胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶得得1Asp+Ala+TyrPH
33、6.4中性中性v2Lys+His+2Glu+ValPH6.4带+电荷荷v求求顺序。序。v例例31肽经酸酸解解得得Try+Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Prov2肽经FDNB法得法得DNPAlaDNPLysv3肽经羧肽酶A不能不能测出出C末端氨基酸末端氨基酸v4肽经羧肽酶B不能不能测出出C末端氨基酸末端氨基酸v5肽经溴溴化化氰得得Ser+Try+Pro；Ala+Arg+Ser+Lys+Phe+Metv6肽经胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶chT得得Ser+Pro；Met+Try；Phe+Lys+Ser+Arg+Alav 7 肽 经 胰胰 酶 T 得得 Ala+Arg； Lys+Ser；
34、Phe+Try+Met+Ser+Prov求求顺序。序。v例例1v答案：答案：GluPheLysProLysv解解法法：PTHGluN末末端端为Glu，胰胰酶不不水水解解故故有有LysProv羧肽酶A不不水水解解：Lys为C末末端端，Pro为C末末端端，Pro为C末端第二。末端第二。v羧肽酶B不水解：不水解：Pro为C末端第二。末端第二。v故故Pro为C末端第二。末端第二。v故有故有GluPheLysProLys或或GluLysLysProPhev假假设是是后后一一种种胰胰酶可可将将其其水水解解成成GluLys，LysProPhe，而，而实验显示胰示胰酶不水解，故只能是第一种情况。不水解，故只能
35、是第一种情况。v例例2答案：答案：AsnAlaTyrGluLysHisGlnValv解法：酸讲解明解法：酸讲解明Asp和和2Glu中有两个是以酰胺形状存在中有两个是以酰胺形状存在vFDNB得得N末端是末端是Aspv羧肽酶得羧肽酶得C末端是末端是Valv胰胰酶酶水水解解碱碱性性氨氨基基酸酸的的羧羧基基所所构构成成的的键键，且且在在His+Glu+Val中中His为为N末末端端。综合以上四项有综合以上四项有AspLysHisGluVal1v胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸羧基所构成的键，故有胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸羧基所构成的键，故有vAspAlaTyr2v由由12得得AspAlaTyrGluLy
36、sHisGluValv由由于于Lys+Asp+Glu+Ala+TyrpH6.4是是等等电电点点故故AsporGlu是是以以酰酰胺胺形形状状存在。存在。v又由于又由于His+Glu+ValPH6.4带带+电荷故电荷故Glu应为应为Glnv所以原顺序应为所以原顺序应为AspAlaTyrGluLysHisGlnValv又由于又由于1Asp+Ala+TyrPH6.4中性得中性得Asp为为Asnv2Lys+His+2Glu+ValPH6.4带带+电荷得电荷得2Glu中只需一个中只需一个Glu，v而另一个应为而另一个应为Glnv最终结果为最终结果为AsnAlaTyrGluLysHisGlnValv例例3答
37、案：答案：AlaArgSerLysPheMetTrySerProv解解法法：2阐阐明明N末末端端为为Ala；34阐阐明明Pro要要么么在在C末末端端要要么么在在C末末端端第第二二；5阐阐明明溴溴化化氰氰专专注注水水解解Met的的羧羧基基所所构构成成的的键键，故故应应将将肽肽分分解解成成两两段段，由由于于Ala在在N末末端端故故有有AlaMet；6阐阐明明胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶水水解解芳芳香香族族氨氨基基酸酸羧羧基基所所构构成成的的键键，且且芳芳香香族族氨氨基基酸酸羧羧基基衔衔接接是是Pro的的不不能能水水解解，故故有有AlaPheMetTrySerPro；7阐阐明明胰胰酶酶水水解解碱碱性性氨氨基基酸酸羧羧基基所所构构 成成 的的 键键 ， 故故 有有 AlaArgSerLysPheMetTrySerPro。
