湖南工业大学教案高效液相色谱化工高分子材料

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1、高效液相色谱高效液相色谱 HPLC HPLChigh performance liquid chromatography1.液相色谱概论液相色谱概论液相色谱法液相色谱法liquidchromatography，LC发现发现1903年年应用气相色谱技术进行开展应用气相色谱技术进行开展1960年后年后特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC那么适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位

2、居色谱法之首。 2.色谱别离类型与机理色谱别离类型与机理液固吸附色谱液固吸附色谱液液分配色谱液液分配色谱离子交换色谱离子交换色谱凝胶色谱凝胶色谱高效色谱主要可分为四大类高效色谱主要可分为四大类:但不可简单归于这四类但不可简单归于这四类,详细分类如下详细分类如下:2.1不同色谱别离机理不同色谱别离机理1. 液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatography根本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。根本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。 适用于别离相对分子质量中等的油溶性试样，对具适用于别离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高

3、选择性；有官能团的化合物和异构体有较高选择性；固定相：固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；缺点：缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾2. 液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatography根本原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的根本原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同分配作用而实现别离的液相色谱别离溶解度不同分配作用而实现别离的液相色谱别离模式。模式。键合固定相：键合固定相： 分配色谱原本是基于样品分子在包覆于惰分配色谱原本是基于样品分子在包覆于惰性载体基质上的固定相液体和流动相液体之间的分配性载体基质上

4、的固定相液体和流动相液体之间的分配平衡的色谱方法，因此也称液平衡的色谱方法，因此也称液-液分配色谱。因为作固定液分配色谱。因为作固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。后来开展起来的键合固定相以化学键不大为人们所采用。后来开展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。这种化学键合型固定相是当今解到流动相中去了。这种化学键合型固定相是当今HPLC最常用的固定相，大约占最常用的固定相，大约占HPLC固定相的固定相的3/

5、4。极性键合固定相：极性键合固定相： 键合在载体外表的功能分子是具有键合在载体外表的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。 非极性键合固定相：非极性键合固定相：键合在载体外表的功能分子是烷键合在载体外表的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。基、苯基等非极性有机分子。如最常用的如最常用的ODSOctaDecyltrichloroSilane柱或柱或C18柱就是最典型的代表，它是将十八烷基三氯硅烷柱就是最典型的代表，它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反响与硅胶外表的硅羟基结合，在硅胶外表通过化学反响与硅胶外表的硅羟基结合，在硅胶外表

6、形成化学键合态的十八烷基，其极性很小。形成化学键合态的十八烷基，其极性很小。正相正相HPLCnormalphaseHPLC)：是由极性固定相和是由极性固定相和非极性或弱极性流动相所组成的非极性或弱极性流动相所组成的HPLC体系。其代体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相反相HPLCreversedphaseHPLC)：由非极性固定相由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体体系正好相反。其代表性的固定

7、相是十八烷基键合硅胶，系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要别离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂要别离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的别离。中的有机物质的别离。3.凝胶色谱凝胶色谱gel chromatography 原理：原理： 以多孔性物质作固定以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大相，样品分子受固定相孔径大小的影响而到达别离的一种液小的影响而到达别离的一种液相色谱别离模式。样品分子与相色谱别离模式。样品分子与固定相之间不存在相互作用力固定相之

8、间不存在相互作用力吸附、分配和离子交换等，吸附、分配和离子交换等，因而凝胶色谱又常被称作体积因而凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱、分排斥色谱、空间排阻色谱、分子筛色谱等。比固定相孔径大子筛色谱等。比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，迅的溶质分子不能进入孔内，迅速流出色谱柱，不能被别离。速流出色谱柱，不能被别离。比固定相孔径小的分子才能进比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保存，溶质分子入孔内而产生保存，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的体积越小，进入固定相孔内的机率越大，于是在固定相中停机率越大，于是在固定相中停留保存的时间也就越长。留保存的时间也就越长。 固定相：固定相： 化

9、学惰性的多孔性材化学惰性的多孔性材料料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。 流动相：流动相： 在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制别离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。别离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。 凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱gelfiltrationchromatography,GFC：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的别离。溶性高分子的别离。凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱gelpermeationchromatography,GPC：以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主

10、要适合于脂溶性高以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的别离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，分子的别离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以所以GPC主要用于合成高分子的分子量分布的测定。主要用于合成高分子的分子量分布的测定。渗透极限渗透极限别离范围别离范围Sephadex 葡聚糖凝胶4.离子交换色谱法离子交换色谱法ion exchange chromatography, IEC 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH-IEC使用的是低交换容量的离子交换剂，这种交换剂的外表有离

11、子交换基团。带负电荷的交换基团如磺酸基和羧酸基可以用于阳离子的别离，带正电荷的交换基团如季胺盐可以用于阴离子的别离。右图是阴离子交换过程的示意图。样品阴离子和淋洗剂阴离子也称淋洗离子都与固定相中带正电荷的交换基团作用，在两相中到达动态平衡。不同的样品阴离子与交换基的作用力大小不同，电荷密度大的离子与交换基的作用力大，在树脂中的保存时间就长，于是不同的离子相互别离。 使用离子交换剂使物质别离表使用离子交换剂使物质别离表样品样品 强酸型强酸型(磺酸型磺酸型)稀稀NH4OH洗脱洗脱 通过液通过液 酸性、中性化合物酸性、中性化合物解离型、解离型、两性化合物两性化合物 稀稀NaOH洗脱洗脱强碱型强碱型(

12、季铵型季铵型)强强碱型碱型稀稀HCl洗脱洗脱 通过液通过液 通过液通过液 酸性化合物酸性化合物中性化合物中性化合物解离型解离型物质物质两性化合物两性化合物(盐、生盐、生物碱物碱)别离机理别离机理 P0：流动相中溶质的浓度：流动相中溶质的浓度Pb：填料外表上被吸附的溶质浓度：填料外表上被吸附的溶质浓度D0：流动相中洗脱剂的浓度：流动相中洗脱剂的浓度Db：填料外表上洗脱剂的浓度：填料外表上洗脱剂的浓度Z：是蛋白质在吸附过程中从填料外表上被置换的洗脱剂的数目。：是蛋白质在吸附过程中从填料外表上被置换的洗脱剂的数目。Z可以小到忽略不计，反响常数可以小到忽略不计，反响常数变为分配系数变为分配系数在Z值不

13、能忽略时值不能忽略时在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K与保存体积成比例，同时洗脱过程中，Kd， Db是常数，用Kz表示。5.离子排斥色谱法离子排斥色谱法 ion chromatography exclusion ICE ICE的别离机理是以树脂的Donnan排斥为根底的分配过程。别离阴离子用强酸性高交换容量的阳离子交换树脂，别离阳离子用强碱性高交换容量的阴离子交换树脂。下面以阴离子别离为例如右图说明离子排斥色谱的原理。强电解质Cl-形成H+Cl-，因受排斥作用不能穿过半透膜进入树脂的微孔，迅速通过色谱柱而无保存。而弱电解质CH3COOH可以穿过半透膜进入树脂微孔。电解质的离解度越小，受排斥作

14、用也越小，因而在树脂中的保存也就越大。 6.离子对色谱法离子对色谱法ion-pair chromatography, IPC无机离子以及离解很强的有机离子通常可以采用离子交换色谱或离子排斥色谱进行别离。 Problem: 别离困难 Reason: 正相色谱的硅胶固定相上吸附太强，致使被测物质保存值太大、出现拖尾峰，有时甚至不能被洗脱。 Solution: 离子对色谱 离子对色谱也称离子相互作用色谱，是在流动相中参加适当的具有与被测离子相反电荷的离子，即离子对试剂，使之与被测离子形成中性的离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱柱上被保存。保存的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂

15、的浓度。离子对色谱也可采用正相色谱的模式，即可以用硅胶柱，但不如反相色谱效果好，多数情况下采用反相色谱模式，所以离子对色谱也常称反相离子对色谱。 7.亲和色谱亲和色谱Affinitychromatograph 原理：利用生物大分子和固定相外表存在的某种特异性亲和力，进行选择性别离。 先在载体外表键合上一种具有一般反响性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保存。改变淋洗液后洗脱。3.高效液相色谱仪高效液相色谱仪3.1主要部件及工作原理主要部件及工作原理最根本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统记

16、录仪、积分仪或色谱工作站。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反响系统和全自动控制系统等。 液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速或压力输液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速或压力输液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速或压力输液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速或压力输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入, ,流动相将样品带流动相将样品带流动相将样品带流动相将样品带

17、入色谱柱入色谱柱入色谱柱入色谱柱, ,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被别离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据不同而被别离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据不同而被别离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据不同而被别离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。系统记录、处理或保存。系统记录、处理或保存。系统记录、处理或保存。 高压输液泵高压输液泵根本

18、要求： 流量准确可调流量准确可调对于一般的分析工作而言，流动相的流速在，输液对于一般的分析工作而言，流动相的流速在，输液泵的最大流量一般为泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求。输液泵的流量控制精度通常要求小于小于0.5%。输液泵必须能精确地调节流动相流量，这可以通过电。输液泵必须能精确地调节流动相流量，这可以通过电子线路调节电机转速或冲程长短来实现。流量的测定通常采用热脉子线路调节电机转速或冲程长短来实现。流量的测定通常采用热脉冲流量计。冲流量计。耐高压耐高压高效液相色谱柱是将很细颗粒高效液相色谱柱是将很细颗粒3-10粒径的填料，在粒径的填料，在高压下填充到柱管

19、中的，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱高压下填充到柱管中的，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力到达柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力到达30-60MPa的的高压。高压。液流稳定液流稳定输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。泵的死体积小泵的死体积小为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于。泵的结构材料应耐化学腐蚀。常要求小于。泵的结构材料应耐化学腐蚀。 输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定

20、性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保存值的变化，而保存值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。 输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。 分类： 活塞型往复泵活塞型往复泵活塞型往复泵是液相色谱仪中使用最广泛的一种恒流泵。活塞型往复泵是液相色谱仪中使用最广泛的一种恒流泵。 脱气装置脱气装置脱气方法脱气方法流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现锋利的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。

21、气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡那么很费时间。 Why脱气？脱气？离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。超声波振荡脱气：超声波振荡脱气：将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min广泛采用。广泛采用。惰性气体鼓泡吹扫脱气：惰性气体鼓泡吹扫脱气：将气源钢瓶中的气体氦气缓慢将气源钢瓶中的气体氦气缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气

22、所形成的小顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。气泡对检测无影响。真空脱气装置：真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。右图是单流路真空脱气装置的示意图。一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。 梯度洗脱装置 在进行多成分的复杂样品的别离时，经常会碰到前面的一些成分别离不完全，而后面的一些成分别离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保存值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并到达相互别离，往往要用到梯度洗

23、脱技术。 梯度洗脱操作： 在液相色谱中流速压力梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在别离过程中改变流动相的组成或浓度。 四大梯度四大梯度 线形梯度线形梯度线形梯度线形梯度 阶梯梯度阶梯梯度阶梯梯度阶梯梯度 高压梯度高压梯度高压梯度高压梯度 低压梯度低压梯度低压梯度低压梯度 线形梯度线形梯度线形梯度线形梯度 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。阶梯梯度阶梯梯度阶梯梯度阶梯梯度 直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。 梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到别离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的

24、混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。 高压梯度高压梯度高压梯度高压梯度 一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的，其装置结构如以下图。高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。 只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀

25、，混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压低压下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置，右图是四元梯度系统的结构示意图。来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以局部空置。 低压梯度低压梯度低压梯度低压梯度 进样装置 进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，其原理与气

26、相色谱中所介绍的相同。 色谱柱1.1.构成构成构成构成 色谱柱是实现别离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。色谱柱是实现别离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。色谱填料：色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是常是5-10粒径的球形颗粒。粒径的球形颗粒。色谱柱管：色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径，长是内径，长250mm。2. 2. 填充填充填充填充

27、 干法填充：干法填充： 在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端翻开垂在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端翻开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入直放在软垫上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂填料，然后垂直台面墩直台面墩10-20次。次。湿法填充：湿法填充： 又称淤浆填充法，使用专门的填充装置又称淤浆填充法，使用专门的填充装置 3. 3. 填料的结构填料的结构填料的结构填料的结构 色谱填料是由基质和功能层两局部构成。 基质：基质： 又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对别离径的球形颗粒，它具有

28、一定的刚性，能承受一定的压力，对别离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。硅胶和有机高分子聚合物微球。功能层：功能层： 是通过化学或物理的方法固定在基质外表的、对样品分是通过化学或物理的方法固定在基质外表的、对样品分子的保存起实质作用的有机分子或功能团。以以下图是硅胶基质子的保存起实质作用的有机分子或功能团。以以下图是硅胶基质的冠醚大分子固定相的结构示意图，功能层冠醚分子吸附或键合的冠醚大分子固定相的结构示意图，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的外表。在硅胶基质的外表。 填料的物理结构：填料

29、的物理结构： 分为微孔型或凝胶型、大孔型分为微孔型或凝胶型、大孔型全多孔型、薄壳型和外表多孔型四种类型全多孔型、薄壳型和外表多孔型四种类型 检测系统检测系统用来连续监测用来连续监测经色谱柱别离经色谱柱别离后的流出物的后的流出物的组成和含量变组成和含量变化的装置。化的装置。右表为液相右表为液相色谱主要检色谱主要检测系统，我测系统，我们分别进行们分别进行讨论。讨论。1.紫外紫外-可见光可见光UV-VIS检测器检测器原理：原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。特点：特点： 灵敏度高；灵敏度高； 线形范围高；线形范围高； 流通池可做的

30、很小流通池可做的很小1mm 10mm ，容积，容积 8L； 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作；波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。2.光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：以光电二极管阵列或CCD阵列，硅靶摄像管等作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV

31、-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。3.示差折光检测器示差折光检测器differentialrefractometers,RI原理：原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。 RI 检测器根据其设计原理可分为反射型根据Fresnel定律、折射型根据Snell定律和干预型三种类型。 5.荧光检测器荧光检测器fluorescence detector 原理：原理： 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物

32、质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反响衍生化后检测。物质反响衍生化后检测。特点：特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。 6.电导检测器电导检测器con

33、ductivity detector, CD原理： 基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。 电导检测器是离子色谱中必备的检测器。电导检测器的构成： 由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几局部组成，电导池是其核心。 7.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器evaporative light-scattering detector, ELSD工作机理：工作机理：ELSD是基是基于溶质的光散射性质的于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加检测器。由雾化器、加热漂移管溶剂蒸发室热漂移管溶剂蒸发室、激光光源和光检测、激光光源和光检测器光电转换器等部器光

34、电转换器等部件构成色谱柱流出液导件构成色谱柱流出液导入雾化器，被载气压入雾化器，被载气压缩空气或氮气雾化成缩空气或氮气雾化成微细液滴，液滴通过加微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成通过光电倍增管转变成电信号电信号 固定相固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧

35、化硅为基质，可承受基质，可承受7.01081.0109Pa的高压，可制成直的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅外表径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅外表键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按。固定相按孔隙深度分类，可分为外表多孔型和全多孔型固定相

36、孔隙深度分类，可分为外表多孔型和全多孔型固定相两类。两类。4.液相色谱固定相和流动相液相色谱固定相和流动相 全多孔型担体全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，的大颗粒，外表涂渍固定液，性能不佳已不多见；外表涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用现采用10m以下的小颗粒，化学键合以下的小颗粒，化学键合制备柱填料制备柱填料外外表表多多孔孔型型担担薄薄壳壳型型微微珠珠担担体体3040m的的玻玻璃璃微微球球，外外表表附附着着一一层层厚厚度度为为12m的的多多孔孔硅胶。硅胶。外表积小，柱容量底；外表积小，柱容量底

37、；由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。对流动相溶剂的要求是： 1溶剂对于待测样品，必须具有适宜的极性和良好的选择性。 2溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。下表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差异的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。二流动相二流动相3高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线

38、不稳，或产生“伪峰。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50100nm。4化学稳定性好。不能选与样品发生反响或聚合的溶剂。5低粘度。假设使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于别离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响别离. 4.1液液-液分配色谱液分配色谱固定相固定相 由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决别离问题。例如，最常用的强极性固定液，一氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是

39、将各种不同有机基团通过化学反响键合到载体外表的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速开展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。流动相流动相 在液液色谱中为了防止固定液的流失。对流动相的一个根本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差异越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的别离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的别离，其流

40、出顺序与正相色谱恰好相反。 常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)固定相固定相4.2液液-液分配色谱液分配色谱键合固定相类型键合固定相类型用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶外表的硅醇基利用硅胶外表的硅醇基(Si-OH)与有机分可成键与有机分可成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类即可得到各种性能的固定相。一般可分三类1疏水基团疏水基团如不同链长的烷烃如不同链长的烷烃C

41、8和和C18。和苯基等和苯基等2极性基团极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。3离子交换基团离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基，如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐；作为阳离子交换季镀盐；作为阳离子交换基团的磺酸等基团的磺酸等. a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSiCc.硅碳键型：硅碳键型：SiCd.硅氮键型：硅氮键型：SiN4.3离子交换色谱别离固定相离子交换色谱别离固定相固定相固定相l多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为

42、520m，有微孔型和大孔型之分。，有微孔型和大孔型之分。2薄膜型离子交换树脂薄膜型离子交换树脂它是在直径约对它是在直径约对30m的固体情性核上，凝聚的固体情性核上，凝聚12m厚的厚的树脂层。树脂层。3外表多孔型离子交换树脂外表多孔型离子交换树脂它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。一层很薄的离子交换树脂。4离子交换键合固定相离子交换键合固定相它是用化学反响将离子交换基团键合到惰性载体外表。它是用化学反响将离子交换基团键合到惰性载体外表。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。它也分为两种类型。一种是

43、键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速别离。可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速别离。流动相流动相 离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度或离子强度的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，那么可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保存值。一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞

44、留次序为：柠檬酸离子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3C00-OH-F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。阳离子的滞留次序大为： Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+MgAg+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十4.4凝胶色谱法凝胶色谱法固定相固定相凝胶色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。 所谓凝胶，指含有大量液体一般是水的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。 1软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许

45、多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。 2半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯Styragel比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。 3刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速1cm3s-1；否那么将影响凝胶孔径，造成不良别离。流动相流动相 凝胶色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身凝胶色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶

46、剂也必须能非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响别离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质别扩散作用而影响别离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质别离，尤需注意。选择溶剂还必须与检定器相匹配。常用的流动相有离，尤需注意。选择溶剂还必须与检定器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有

47、机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。5.别离类型的选择别离类型的选择三大选择标准：三大选择标准： 相对分子量相对分子量相对分子量相对分子量 溶解度溶解度溶解度溶解度 化学结构化学结构化学结构化学结构 一、相对分子量一、相对分子量分子量分子量2000，凝胶色谱柱，凝胶色谱柱分子量分子量2000，但同时分子量相差，但同时分子量相差10%，凝胶色谱柱，凝胶色谱柱分子量分子量2000的水溶性电解质的水溶性电解质，酸性物质用阴离子交换树脂，碱，酸性物质用阴离子交换树脂，碱性物质用阳离子交换树脂性物质用阳离子交换树脂分子量分子量2000的水溶性非电解质的水溶性

48、非电解质，选用反相色谱法，选用反相色谱法分子量分子量2000的非水溶性物质的非水溶性物质，弱极性物质选用反相色谱法，极，弱极性物质选用反相色谱法，极性物质选用正相色谱法。性物质选用正相色谱法。二、溶解度二、溶解度水溶性样品水溶性样品离子交换色谱或离子交换色谱或液液-液分配色谱液分配色谱微溶于水，但在微溶于水，但在酸或碱存在下能酸或碱存在下能很好离心的化合很好离心的化合物物离子交换色谱离子交换色谱油性样品油性样品液液-固色谱法固色谱法相对非极性化合相对非极性化合物物液液-固色谱法固色谱法三、化学结构三、化学结构结构特点结构特点分离方法分离方法离子型化合物离子型化合物离子交换色谱，离子交换色谱，空

49、间排阻和液空间排阻和液-液分配色谱液分配色谱异构体异构体液液-固色谱法固色谱法同系物同系物液液-液分配色谱液分配色谱高分子聚合物高分子聚合物空间排阻色谱空间排阻色谱法法6.定性和定量分析定性和定量分析6.1定性分析定性分析一利用物对照法定性一利用物对照法定性1、利用保存特性、利用保存特性2、利用不同柱比较、利用不同柱比较二色谱法和其他方法结合定性二色谱法和其他方法结合定性1、利用化学反响定性、利用化学反响定性2、利用二极管陈列检测器、利用二极管陈列检测器3、收集峰的流出物、收集峰的流出物4、HPLC-MS(质谱连用质谱连用6.3定量分析定量分析开发一个适合定量分析的色谱方法:确认被检测组分峰,

50、并到达别离度(R)大于确定被测组分色谱峰的一致性确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围 用不同浓度的标准样品建立校正曲线 考查定量方法的准确度及精密度 用M32色谱管理系统实施样品采集,数据处理及报告结果一一. 定量分析根本步骤定量分析根本步骤定性鉴别每个要定量的色谱峰定性鉴别每个要定量的色谱峰定性鉴别每个要定量的色谱峰定性鉴别每个要定量的色谱峰1 1。通过比较保存值。通过比较保存值。通过比较保存值。通过比较保存值( (通常是保存时间通常是保存时间通常是保存时间通常是保存时间) )的方法的方法的方法的方法, ,找到找到找到找到各色谱峰所对应的组份各色谱峰所对应的组份各色谱峰所对应的组份各色

51、谱峰所对应的组份2 2。大多数情况下用与标样比较保存时间来定性。大多数情况下用与标样比较保存时间来定性。大多数情况下用与标样比较保存时间来定性。大多数情况下用与标样比较保存时间来定性即：即：即：即： 保存时间相同，可能是同样的组份保存时间相同，可能是同样的组份保存时间相同，可能是同样的组份保存时间相同，可能是同样的组份 保存时间不同，肯定不是同样的组份保存时间不同，肯定不是同样的组份保存时间不同，肯定不是同样的组份保存时间不同，肯定不是同样的组份用用用用“ “标样的保存值定标样的保存值定标样的保存值定标样的保存值定出被测组份的位置出被测组份的位置出被测组份的位置出被测组份的位置废水样品中五氯苯

52、废水样品中五氯苯PCP的分析的分析标准参加法举例标准参加法举例标准参加法举例标准参加法举例进一步确实认进一步确实认进一步确实认进一步确实认( (定性定性定性定性) )标准参加标准参加同时用其他方法同时用其他方法1. 其他色谱方法改变机其他色谱方法改变机理，如：用不同的色谱柱理，如：用不同的色谱柱2. 其他检测器其他检测器 PDA，光谱图比较、谱，光谱图比较、谱库检索库检索 MS，质谱图解析、谱库，质谱图解析、谱库检索检索3. 其他仪器方法其他仪器方法二二. . 色谱峰定性中常见问题色谱峰定性中常见问题被鉴定峰丧失被鉴定峰丧失1.保存时间改变保存时间改变2.数据处理系统中输入值不正确数据处理系统

53、中输入值不正确色谱图中出峰比预想的少色谱图中出峰比预想的少1.样品分解样品分解2.色谱柱分辨率丧失色谱柱分辨率丧失3.用错流动相用错流动相4.梯度洗脱时平衡缺乏梯度洗脱时平衡缺乏(例如例如,过早将过早将手动进样器扳至手动进样器扳至(Load)位置位置色谱图中出峰比预想的多色谱图中出峰比预想的多(鬼峰鬼峰)1.样品分解或制样时导入了杂质2.流动相被污染,或用错流动相3.流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化4.前次进样的后流出物(某些RT值特大的组分)5.进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏6.未充分平衡进样器Loop管7.保护柱脏,色谱柱被污染,分辨率下降三三.HPLC定量分析的常用术语定量分析

54、的常用术语样品样品(Sample):含有待测物含有待测物,供色谱分析的溶液供色谱分析的溶液样品类型样品类型(SampleType)分为标样和未知两种分为标样和未知两种:标样标样(Standard):浓度的纯品浓度的纯品;未知样未知样(Unknow):浓度待测的混合物浓度待测的混合物样品量样品量(SampleWeight):待测样品的原始称样量待测样品的原始称样量稀释度稀释度(Dilution):未知样品的稀释倍数未知样品的稀释倍数组分组分(Componance):欲做定量分析的色谱峰欲做定量分析的色谱峰,即含量未即含量未知的被测物知的被测物组分的量组分的量(Amount):被测物质的含量被测物

55、质的含量(或浓度或浓度)积分积分(Integrity):由计算机对色谱峰进行峰面积测量的计由计算机对色谱峰进行峰面积测量的计算过程算过程定量限定量限:可以准确定量的样品最低量可以准确定量的样品最低量,一般要求色谱峰一般要求色谱峰的的S/N10:1校正曲线校正曲线(CalibrationCurve):组分含量对响应值线性组分含量对响应值线性曲线曲线,由量标准物建立由量标准物建立,用于测定待测物的未知含量用于测定待测物的未知含量四四.常用定量方法常用定量方法四四.常用定量方法常用定量方法内标法内标法外标法外标法外标法定量外标法定量外标法定量外标法定量1. 配制一系列浓度的标样2. 采集不同浓度标样的色谱图3.积分,按外标法定量计算,建立标准曲线计算公式计算公式计算公式计算公式特特特特 点点点点无需各组份都被检出、洗脱需要标样标样及样品测定的条件要一致进样体积要准确内标法定量内标法定量内标法定量内标法定量1. 配制一系列浓度的标样，其中有内标样2. 采集不同浓度标样的色谱图3.积分,按外标法定量计算,建立标准曲线计算公式计算公式计算公式计算公式特特特特 点点点点无需各组份都被检出、洗脱需要标样，需要内标样结果与进样体积无关