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1、常用实验基本技术（续）山东大学医学院组胚教研室史玮四大常用基本技术逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）免疫组织化学技术（免疫组化）免疫印迹技术（Western blot）细胞培养技术局限性 联合应用细胞培养技术细胞培养（Cell culture）是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。细胞培养便于应用各种方法和技术进行研究，并可直接观察，已成为现代生物医学研究中一项非常重要的技术。培养细胞的生存条件无菌环境（器皿、超净台）超纯水温度（37左右左右）气体（5%CO2/空气）PH值（，细胞耐酸不耐碱）营养条件（基础培养基+10%FBS）渗透
2、压、培养基质等细胞培养用液平衡盐溶液：洗涤组织、细胞 D-Hanks液、PBS液等。消化液：分散细胞 0.25%胰酶、0.02%EDTA液或二者混合使用培养液：细胞生存、生长和繁殖 基础培养基(DMEM、RPMI1640等），已商品化 10%左右的胎牛血清（FBS）培养细胞的来源直接取材： 实验动物、胚胎、临床标本等细胞系： 各实验室保存 细胞库：上海中科院细胞库、武汉细胞库、 中国医科院细胞中心培养方式原代培养： 直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。 只能原代培养：神经元、心肌细胞等。传代培养： 当培养细胞增殖到一定密度后，生长受到抑制， 需要分散稀释后重新培养。 常见：肿瘤细胞系培养
3、细胞的处理改变细胞外部因素改变细胞内部因素外部因素药物高温低氧射线内部因素改变细胞内基因表达水平： 上调：基因转染 下调：RNAi细胞转染转染（transfection）是指将外源性DNA或 RNA导入细胞的过程。上调目的基因表达： 质粒载体 病毒载体下调目的基因表达： 化学合成siRNA 质粒载体 病毒载体转染方法电转法脂质体介导的转染法病毒载体介导的转染法转染试剂脂质体与非脂质体：商品化，多家公司如Invitrogen、Fermentas、Qiagen等都有售。常用： Invitrogen公司Lipofectamine 2000 可用来转染质粒和siRNA.其他专用试剂：如Invitrog
4、en公司RNAiMAX Transfection Reagent 专门用来转染siRNA.瞬时转染与稳定转染瞬时转染：将DNA导入活细胞内，但DNA不会嵌入细胞的染色体中，可在2-3天内收集被转染的细胞进行基因表达分析。稳定转染：将目的基因导入活细胞，根据选择标记经过一段时间的筛选，使目的基因整合入细胞染色体中，从而得到稳定表达目的基因的细胞系。真核筛选标记设立对照组空载体对照：如PCDNA3、PEGFP-N1等。Scrambled siRNA：将选中的siRNA序列打乱。作为阴性对照的scrambled siRNA应该与选中的siRNA序列有相同的核苷酸组成，并且与目的基因的mRNA没有明显
5、的同源性。细胞特性检测活力：MTT实验凋亡：TUNEL染色、流式细胞术等增殖：BrdU掺入法、克隆形成实验分化：形态学观察、分化标志物检测致瘤性：体内成瘤实验靶基因表达水平检测RT-PCRWestern blot免疫组化其他：基因芯片、流式细胞术等细胞培养的应用用途： 1.验证体内实验结果 2.进行深入机制研究优点：可同时获得大量生物学性质相似的细胞作为研究对象，便于施加各种干预因素，方便观察与检测。局限性：不能准确反应体内的真实状况，需与体内实验相互验证。神经干细胞分离培养取小鼠胚胎端脑，制成单细胞悬液，接种于神经干细取小鼠胚胎端脑，制成单细胞悬液，接种于神经干细胞培养基，体外培养胞培养基，
6、体外培养2天，可见神经球形成。天，可见神经球形成。NSC鉴定体外培养神经干细胞体外培养神经干细胞BrdU(+)，Nestin(+)，并能分，并能分化为化为MAP2 (+)神经元和神经元和GFAP (+)星形胶质细胞。星形胶质细胞。出生后7天小鼠脑切片，可见G-CSFR与Nestin共表达。SVZ：室管膜下区；LV：侧脑室体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：Nestin（神经干细胞marker）与G-CSFR共表达于神经干细胞。RT-PCR结果也显示神经干细胞表达G-CSFR。体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：与对照组相比，G-CSF作用组BrdU阳性细胞比例明显增高。小鼠脑切片，免疫染色结果显示，与对照组（CT）及缺血缺氧性模型组（HI）相比，G-CSF处理组（HI+G-CSF）室管膜下区（SVZ）BrdU阳性细胞数明显增加。谢谢！
