动物细胞工程的应用

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1、动物细胞工程动物细胞工程应用应用动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植核移植动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术 皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，1014天后就要被身体排斥。 如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何

2、才能获得大量的自体健康皮肤？人耳鼠“人耳鼠”再出风头 2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。 在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。 人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？一、动物细胞培养一、动物细胞培养 1.1.发展历史发展历史: : 20 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细世纪初，人们不知道神经纤维是由

3、神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。19071907年，美国生物学家哈里森年，美国生物学家哈里森(Harrison)(Harrison)从蝌蚪的脊索从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的长出了神经纤维。哈里森的实验

4、不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。渐发展成为动物细胞培养。2、动物细胞培养的应用和概念：、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培动物细胞培养就是从动物有养就是从动物有机体中取出相关机体中取出相关的组织的组织,将它分将它分散成单个细胞散成单个细胞,然后然后,放在适宜放在适宜的培养基中的培养基中,让让这些细胞生长和这些细胞生长和增殖增殖.动物细胞的培养过程动物细胞的培养过程幼龄动物取动物器官和组织剪

5、碎组织胰蛋白酶处理细胞培养养单个细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础是其他动物细胞工程技术的基础剪碎组织剪碎组织的目的？的目的？胰蛋白酶处胰蛋白酶处理的目的？理的目的？3、动物细胞培养过程：、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加加培养液培养液遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质已改变已改变动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维

6、等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）有关概念有关概念原代培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养）原代细胞。（分装前的细胞培养）传代培养传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念有关概念细胞株：细胞株：传代培养的细胞一般传至传代培养的细胞一般传至10代

7、左代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至50代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传

8、代培养。容易传代培养。动物组织细胞培养要求动物组织细胞培养要求一一 体外培养特点体外培养特点: 大多数动物细胞要附在物体上表面生长，大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。求更高。二二 培养工具培养工具:培养瓶、培养皿、培培养瓶、培养皿、培养管、养管、多孔培养板多孔培养板等。等。细胞培养以玻璃器皿为主。细

9、胞培养以玻璃器皿为主。器皿应选择透明度好、无毒、器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。中性硬度玻璃制品。根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。 三三、培养条件培养条件细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。【讨论讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。和气体环境。2.体

10、外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 提示：无菌、无毒的环境。提示：无菌、无毒的环境。1）恒定的温度恒定的温度:37 ，维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为体细胞培养的标准温度为36.536.50.50.5，偏离这一温度，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过3939时，细时，细胞代谢与温度成正比；胞代谢与温度成正比；人体细胞在人体

11、细胞在39-40139-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；能恢复；在在40-41140-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；恢复；41-42141-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；别细胞仍有恢复可能；当温度在当温度在4343以上以上1 1小时，细胞全部死亡。低温下会使细小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低胞代谢速率降低2）PHPH：7.2-7.7.2-7.当当PHPH低于低于6 6或高于或高于7.67.6时的

12、生长会受到影响，时的生长会受到影响，甚至死亡。甚至死亡。用来检测PH的变化：红色-pH7.4，橙色-pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色-pH7.6，紫色-pH7.8。3) 气体：气体：有调节有调节PH的作用。的作用。气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。4）营养）营养培养基：培养基： 在保证细胞渗透压的情况下，培养在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如

13、包括十几种必需氨基酸的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。生长。 动物细胞的培养基一般分为天然、合动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。还需要一些常用的溶液。合成合成培养基培养基 1951年厄尔开发了供动物细胞体外生年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的合

14、成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。普遍的作法是加入小牛血清。人工合成培养基，如人工合成培养基，如109培养液、培养液、DMEM、199、RPMI-1640，IME

15、M，MEM培养液等。培养液等。天然天然培养基培养基 直接采用取自动物体液或从组织中提取的成直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。汁等。 血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。生物学性状不可缺少的未知成分。 使用最普遍的天然培养基是血清，基本以使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子

16、、促贴附因子及其多活性物质。与合成培因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。养基合用，能使细胞硕利增殖生长。常用的动物血清主要有牛血清和马血清。常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为牛血清分为胎牛血清和犊牛血清胎牛血清和犊牛血清，前者来，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。白

17、质主要是白蛋白和球蛋白。氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中氨基酸中有有1212种是细胞本身不合成的，种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子增殖刺激因子(MSA)(MSA)、类胰岛素生长因子类胰岛素生长因子(IGFl(IGFl、IGF2)IGF2)等。等。 水解乳蛋白、胶原水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色

18、成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成粉末状，富含氨基酸。一般配制成0 05 5溶液，微酸溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。性促使其附着生长的作用。无血清培养基无血清培养基动物血清成分复杂，各种生物大小分子混动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量

19、的动物血清来源有限，成本高，另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。限制了它的大量使用。 无血清培养基不加动物血清，在基础培无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。养基中加入细胞生长有效因子，激素等。5) 细胞细胞培养溶液培养溶液平衡盐水（平衡盐水（BSSBSS）：）： Hanks Hanks 液和液和EarleEarle液是常用液是常用的的BSSBSS基础溶液。基础溶液。PH调整液：调整液： NaHCO3溶液溶液、HEPES溶液溶液（二羟乙基哌二羟乙基哌嗪乙烷磺酸嗪乙烷磺酸）细胞消化液细胞消化液: : 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液EDTAEDTA溶

20、液胶原酶溶液溶液胶原酶溶液抗生素溶液：抗生素溶液：1)1)青、链霉素青、链霉素: :每毫升培养液含每毫升培养液含100U100U青霉素和青霉素和100ug100ug链霉素链霉素. .2)2)卡那霉素：终浓度为卡那霉素：终浓度为50ug/ml50ug/ml培养液。培养液。3 3）制霉菌素：浓度制霉菌素：浓度25U/ml25U/ml，小瓶分装，每瓶小瓶分装，每瓶一次用完。一次用完。6)、无污染环境、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物与体内相比细胞丢失了

21、对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。四 细胞培养设施细胞培养设施1、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内

22、较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。细胞培养实验室细胞培养实验室1.准备室准备室2.缓冲室缓冲室 准备室风淋3.培养室培养室培养室培养室专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、缓冲间、操作间。间、缓冲间、操作间。内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。施。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机及倒置显微镜等。离心机及倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无缓冲间可放置电冰箱

23、、冷藏器及毒好的无菌物品等菌物品等风淋室风淋室： 风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。 超净工作台超净工作台n也称净化工作台，分也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外为侧流式、直流式和外流式三大类。流式三大类。CO2培养箱培养箱哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要

24、在恒足温度下才能生存需要在恒足温度下才能生存,温差变化一般温差变化一般不应超过不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。较高灵敏度。 CO2培养箱的优点在于能恒定地供应一培养箱的优点在于能恒定地供应一定量定量的的CO2,一般一般5%即可即可维持培养维持培养液液PH值值稳定稳定。 冰箱冰箱细胞培养的冰箱应特别注意清洁，细胞培养的冰箱应特别注意清洁，防止污染。防止污染。水纯化装置水纯化装置细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各种培养用液。过滤装置过滤装置各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微化滤膜滤器是目前应用最广泛的过滤装置。细胞

25、冷冻贮存细胞冷冻贮存器器细胞冷冻贮存具有经济、省力和较好保持细胞生物学特性的优点，目前各实验室主要使用液氮容器贮存细胞。培养器皿培养器皿培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等。洗刷消毒间：洗刷消毒间： 烤箱、消毒锅、蒸烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸馏水处理器及酸缸等。等。 分析间：分析间： 显微镜、计算机及显微镜、计算机及打印机等。打印机等。无菌操作的要领无菌操作的要领由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。超净工作台消毒超净工作

26、台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒2030分钟，然后关闭紫分钟，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台可保持无菌环境。工作台可保持无菌环境。洗手洗手 操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用洗到肘部，然后用0.2%新洁尔灭或新洁尔灭或75%的酒精棉球擦拭。的酒精棉球擦拭。火焰消毒火焰消毒所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒

27、。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。 烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。 吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼,否则会烧焦形成炭膜否则会烧焦形成炭膜,再用时会将有害物质带再用时会将有害物质带入培养液。入培养液。合理布局合理布局右手使用方便的用品放右侧，左手使用右手使用方便的用品放右侧，左手使用方便的用品放左侧。方便的用品放左侧。 酒精灯置于中央，打开的培养液、培养酒精灯置于中央，打开的培养液、培养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直立直立,易

28、增加落菌机会）。易增加落菌机会）。 吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。3.动物细胞培养动物细胞培养 的条件的条件1.无菌无毒的环境无菌无毒的环境2.营养营养3.温度和温度和pH4.气体环境气体环境 应该加入哪些物质？这应该加入哪些物质？这些物质如何调配？些物质如何调配？在在使用合成培养基时通常使用合成培养基时通常需加入血清、血浆等天然需加入血清、血浆等天然成分，目的是什么？成分，目的是什么？4.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体健康细胞培养健

29、康细胞培养 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 用于筛选抗癌药物用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理培养基性质培养基性质培养基特有成分培养基特有成分培养结果培养结果培养目的培养目的细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基蔗糖蔗糖 植物激素植物激素 葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系快速繁殖、培育无快速繁殖、培育无病毒植株病

30、毒植株获得细胞或细胞分获得细胞或细胞分泌蛋白泌蛋白思考：思考：2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。主要成分：葡萄糖、氨基酸

31、、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：独特之处有：1、液体培养基、液体培养基 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体动物个体一、动物细胞融合一、动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用动物动物细胞细胞融合融合细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭

32、活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核细胞融合与融合诱导细胞融合物质细胞融合与融合诱导细胞融合物质诱导剂：诱导剂：仙台病毒仙台病毒 聚乙二醇聚乙二醇 电融合电融合诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。二、单克隆抗体二、单克隆抗体什么是抗体？什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫功能的球蛋

33、白。B淋巴细胞产生抗体。淋巴细胞产生抗体。B淋巴细胞与抗体淋巴细胞与抗体B淋巴细胞受抗原刺激后，可以淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。产生抗体。动物体内的动物体内的B淋巴细胞可以产生淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。原具有特异性免疫作用。每一个淋巴细胞只能产生一种抗每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。体。单克隆抗体单克隆抗体 由单个由单个B淋巴细胞经过无性繁殖淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的

34、抗体称为异性强的抗体称为单克隆抗体。单克隆抗体。 特点：特点：特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞交瘤细胞 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂

35、交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体思考：思考：1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的

36、本领，因而可以获得大量单克隆抗体无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用与与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：应用主要有：1、临床诊断、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿治疗肿瘤瘤资料资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗

37、传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内位体内“病灶病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。踪及心肌梗塞的诊断。植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法 去去除细胞壁后诱导除

38、细胞壁后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体动物的胚胎移植动物的胚胎移植 解决某些妊解决某些妊娠时间长、每胎娠时间长、每胎产子数量少的优产子数量少的优良种畜的繁殖速良种畜的繁殖速度问题。度问题。胚胎移植技术胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程试管动物（婴儿）培养过程卵细胞卵细胞精子精子体外受精体外受精受精卵受精卵胚胎胚胎新个体新个体母

39、体子宫内母体子宫内孕育、产出孕育、产出一、动物体细胞核移植技术和克隆动物一、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、动物细胞全能性的表现程度不同、动物细胞全能性的表现程度不同受精卵受精卵 胚胎干细胞胚胎干细胞 多能干细胞多能干细胞 单能干细胞单能干细胞 体细胞体细胞核移植核移植胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植体细胞核移植（难度高）（难度高） 2、动物体细胞核移植动物体细胞核移植是将动物的一个细胞的是将动物的一个细胞的细胞核细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中中.使其重组并发育成一个新的胚胎使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的这个新的胚胎最终发育为动

40、物个体。胚胎最终发育为动物个体。3.培育过程培育过程去核卵细胞去核卵细胞体细胞核体细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期胚胎早期胚胎(或重组胚胎）或重组胚胎）胚胎移植胚胎移植母体子宫母体子宫妊娠、出生妊娠、出生 个体个体4、原理、原理动物体细胞核具有全能性动物体细胞核具有全能性卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程融合后的卵细胞融合后的卵细胞克隆羊的成功证明了什么？克隆羊的成功证明了什么？

41、1、动物体细胞核具有全能性；、动物体细胞核具有全能性；2、细胞质具有调控细胞核发育的作用。、细胞质具有调控细胞核发育的作用。动物体细胞核移植是一种无性繁殖技术，动物体细胞核移植是一种无性繁殖技术，用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。其意义：其意义：1、有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育、有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育2、对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩、对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩群有重要意义群有重要意义3、降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率、降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率体细胞核移植技术存在的

42、问题：体细胞核移植技术存在的问题：许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。器缺陷，免疫失调等。 动物细胞特点？动物细胞特点？v分化潜能变窄分化潜能变窄：随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。v细胞核仍具有全能性细胞核仍具有全能性：细胞核，它含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性 根据动物细胞核仍具有全能性的根据动物细胞核仍具有全能性的特点特点,怎样将动物细胞的全能性表达怎样将动物细胞

43、的全能性表达? 利用动物体细胞核移植技术利用动物体细胞核移植技术动物核移植：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。动物个体。用核移植的方法得到的动物。用核移植的方法得到的动物。克隆动物：卵细胞卵细胞C母绵羊子宫母绵羊子宫母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植胚胎移植胚胎移植早期胚胎早期胚胎多莉羊多莉羊分娩分娩卵裂卵裂融合后的卵细胞融合后的卵细胞细胞拆合

44、技术细胞拆合技术妊娠妊娠多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程2.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景克隆动物的研究意义克隆动物的研究意义1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白2.改良动物品种改良动物品种 3.治疗人类疾病，作为供体治疗人类疾病，作为供体4.保护濒危动物保护濒危动物体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题1.许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。2.成功率非常低及克隆动物食品的安全性问题。成功率非常低及

45、克隆动物食品的安全性问题。小结小结两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三三个个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒灭活病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势植物细胞工程植物细胞工程的基本技术和理论基础植物细胞工程的理论基础是：植物细胞工程的理论基础是： 植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞工程常用的技术是植物细胞工程常用的技术是 植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交概念：概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具

46、有细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。使后代细胞形成完整个体的潜能。原因：原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。个体所必需的全部基因。 细胞的全能性 当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。 在生物的个体发育

47、中，由于基因在特定时间和空间在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。 受精卵的全能性最高；受精卵的全能性最高；其次是生殖细胞（尤其是卵细胞）；其次是生殖细胞（尤其是卵细胞）；体细胞的全能性比生殖细胞低得多。体细胞的全能性比生殖细胞低得多。 植物组织培养的概念 植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配将离体的植物器官、组织、细胞，

48、培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞脱分化脱分化（又叫去分化）（又叫去分化）愈伤组织愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化再分化根或芽等器官根或芽等器官植物体植物体植物组织培养的条件：植物组织培养的条件： 适宜的养料和激素，适宜的适宜的养料和激素，适宜的温度和无菌条件温度和无菌条件离体的离体的植物植物器官

49、、组织器官、组织或细胞或细胞愈愈伤伤组组织织根根芽芽植植物物体体脱脱分化分化再再分化分化脱脱脱脱分化分化分化分化 由由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。再再再再分化分化分化分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。胞的再分化。二、植物组织培养2.植物组织培养过程相关问题1 1、在植物组培过程中，为、在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消什么要进行一系列

50、的消毒，灭菌，并且要求无毒，灭菌，并且要求无菌操作？菌操作？2 2、为什么切取胡萝卜根的、为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能形成层，其他部分也能培养成小植株吗？培养成小植株吗？植物体细胞杂交的概念 将不同种植物的体细胞，在一将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。种细胞培育成新的植物体的技术。 （不同种生物之间存在着生殖隔离，（不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的）能做到这一点的）相关问题（1）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在）要想让两个来自

51、不同植物的体细胞融合在一起，遇到的第一个障碍是什么？一起，遇到的第一个障碍是什么？（2）有没有一种温和的去细胞壁的方法？）有没有一种温和的去细胞壁的方法？（3）为什么两个原生质体能发生融合，这与细）为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？胞膜的什么特性有关？（4）如果两个来源不同的原生质体发生融合形）如果两个来源不同的原生质体发生融合形成了杂种细胞，下一步该对此细胞做何种成了杂种细胞，下一步该对此细胞做何种处理？处理？（5）如何将杂种细胞培育成杂种植株？）如何将杂种细胞培育成杂种植株？植物体细胞杂交过程植物细胞植物细胞A植物细胞植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁去掉细胞壁去掉细胞壁

52、原生质体原生质体A原生质体原生质体B原生质体融合原生质体融合杂合的原生质体杂合的原生质体再生出细胞壁再生出细胞壁杂种细胞杂种细胞细胞分裂细胞分裂分化发育分化发育愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株植物体细胞杂交过程原生质体制备（酶解法去细胞壁）原生质体制备（酶解法去细胞壁）原生质体融合（人工诱导）原生质体融合（人工诱导） 杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤组织）杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤组织）杂种植株的再生与鉴定杂种植株的再生与鉴定物理法：物理法：离心、振动、电刺激等离心、振动、电刺激等化学法：化学法：聚乙二醇等试剂聚乙二醇等试剂纤维素酶、果胶酶等纤维素酶、果胶酶等问题为什么为什么“番茄番茄马铃薯

53、马铃薯”超级杂种植株没有如超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？铃薯？主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地一样有序表达，杂交植株不能地

54、上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。下结马铃薯就是很自然的了。 问题自然界中有一种含有叶绿体的原生动物自然界中有一种含有叶绿体的原生动物眼眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。具体实验方案。 异想天开植物细胞工程的实际应用繁殖植物的新途径繁殖植物的新途径微型育种微型育种作物脱毒作物脱毒人工种子人工种子育种新方法育种新方法单倍体育种单倍体育种诱导突变体诱导突变体细胞产物的工厂化生

55、产细胞产物的工厂化生产概念：概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术）快速繁殖技术）原理：原理：植物细胞的全能性植物细胞的全能性优点：优点：繁殖率高，可大批量生产繁殖率高，可大批量生产 取材少取材少 培养周期短培养周期短 保持优良性状保持优良性状微型繁殖作物脱毒病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产量降低，品质变差量降低，品质变差分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，甚至没有甚至没有采用茎尖进行组织培养采用茎尖进行组织培养人工种子人工种子结构：结构：人工薄膜人工薄膜+ +胚状体

56、（不定芽、顶芽、腋芽）胚状体（不定芽、顶芽、腋芽）优点：优点：不受气候、季节、地域的限制不受气候、季节、地域的限制保留优良性状保留优良性状时间短，占地少时间短，占地少技术：技术：组织培养组织培养原理：原理：细胞全能性细胞全能性养分、无机盐、有机碳源、农药、抗生素、有益菌养分、无机盐、有机碳源、农药、抗生素、有益菌生长调节剂生长调节剂单倍体育种方法：方法：花药离体培养花药离体培养 技术：技术：组织培养获得单倍体组织培养获得单倍体秋水素处理单倍体的幼苗，使染色体加倍秋水素处理单倍体的幼苗，使染色体加倍优点：优点：明显缩短了育种年限明显缩短了育种年限后代稳定遗传后代稳定遗传突变体的利用利用组织培养时，分裂状态的细胞易受利用组织培养时，分裂状态的细胞易受培养条件和外界压力（如射线，化学物培养条件和外界压力（如射线，化学物质等）的影响而产生突变的原理，诱导质等）的影响而产生突变的原理，诱导并筛选出对人类有用的突变体。并筛选出对人类有用的突变体。细胞产物的工厂化生产红豆杉与紫杉醇红豆杉与紫杉醇人参皂甘的生产人参皂甘的生产植物细胞工程的实际应用繁殖植物的新途径繁殖植物的新途径微型育种微型育种作物脱毒作物脱毒人工种子人工种子育种新方法育种新方法单倍体育种单倍体育种诱导突变体诱导突变体细胞产物的工厂化生产细胞产物的工厂化生产