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1、核酸核酸检测技技术及及质量控制量控制常州市疾病预防控制中心王凤鸣编辑ppt目目 录一、一、PCR实验技技术操作要点操作要点二、二、质量控制要点量控制要点三、三、实验室生物安全管理室生物安全管理编辑ppt一、PCR实验技术操作要点编辑ppt常用仪器设备编辑ppt加样器PCR实验室应备有4套连续可调加样器，分别用于试剂准备、样本处理、扩增和产物检测四个试验区。编辑ppt加样器的类型l单单道道连续连续可可调调式移液器式移液器l多通道多通道连续连续可可调调式移液器式移液器l单单道道连续连续移液器移液器l单单道移液管配合使用的移液器道移液管配合使用的移液器编辑ppt加样器的使用编辑ppt编辑ppt加样器
2、的校准l校准方式校准方式 计计量局量局 厂家厂家 自自较较l时间时间 视视使用使用频频率定（率定（6个月个月-1年）年）编辑ppt加样器-注意事项 l 根据所需取液量根据所需取液量选择选择相相应应的移液器及吸的移液器及吸头头，基因，基因扩扩增增实验实验要求使用要求使用带滤带滤芯芯的吸的吸头头，防止交叉，防止交叉污污染。染。编辑pptl吸取液体吸取液体时应缓时应缓慢匀速吸取，避免液体慢匀速吸取，避免液体溅溅到移到移液器液器头头上；打出液体后拇指不上；打出液体后拇指不应应松开按松开按钮钮，将，将吸液嘴吸液嘴压压掉后再将拇指松开，掉后再将拇指松开，避免液体回吸避免液体回吸。l在在调调整取液量的旋整取
3、液量的旋钮时钮时，不要用力不要用力过过猛猛，并，并应应注意注意计计数器数器显显示的数示的数值值不要超不要超过过其可其可调调范范围围。l连续连续可可调调式移液器不可在无吸式移液器不可在无吸头时头时使用，吸使用，吸头头有液体有液体时时不可平放或倒置。不可平放或倒置。加样器-注意事项 编辑ppt（一）高速（冷（一）高速（冷冻冻）离心机）离心机l电电机机l转转速速 最低最低转转速速 最高最高转转速速l转头转头l消毒方式消毒方式l标标准配件系准配件系统统l噪音噪音编辑ppt高速（冷高速（冷冻冻）离心机）离心机-使用方法使用方法l离心机离心机应应放置在放置在水平水平坚坚固固的地板或平台上，并力求使机器的地
4、板或平台上，并力求使机器处处于水平位置以免离心于水平位置以免离心时时造成机器震造成机器震动动。l打开打开电电源开关，按要求装上所需的源开关，按要求装上所需的转头转头，将，将预预先平衡好的先平衡好的样样品放置于品放置于转头样转头样品架上，关品架上，关闭闭机盖。机盖。l按功能按功能选择键选择键，设设置各置各项项要求：温度、速度、要求：温度、速度、时间时间、加速、加速度及减速度，度及减速度，带电脑带电脑控制的机器控制的机器还还需按需按储储存存键键，以便，以便记忆记忆输输入的各入的各项项信息。信息。l待离心机待离心机完全停止完全停止转动转动时时打开机盖，取出离心打开机盖，取出离心样样品，用柔品，用柔软
5、软干干净净的布的布擦擦净转头净转头和机腔内壁和机腔内壁，待离心机腔内温度与室，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。温平衡后方可盖上机盖。编辑pptl机体机体应应始始终处终处于水平位置，外接于水平位置，外接电电源系源系统统的的电压电压要匹要匹配，并要求有良好的接地配，并要求有良好的接地线线。l开机前开机前应检查转头应检查转头按装是否牢固，机腔有无异物掉入。按装是否牢固，机腔有无异物掉入。l离心机运行离心机运行时时，离心机周离心机周围围30cm范范围围内不能有人和危内不能有人和危险险物品物品。l挥发挥发性或腐性或腐蚀蚀性液体离心性液体离心时时，应应使用使用带带盖的离心管，盖的离心管，并确保液
6、体不外漏以免腐并确保液体不外漏以免腐蚀蚀机腔或造成事故。机腔或造成事故。高速（冷高速（冷冻冻）离心机）离心机-使用方法使用方法编辑pptl易燃易爆以及易与其他物易燃易爆以及易与其他物质发质发生反生反应应的物的物质质不能不能离心。离心。l在没有相在没有相应应的防的防护护措施措施时时，不能离心有毒的、放，不能离心有毒的、放射性的物射性的物质质或病原微生物。或病原微生物。l离心机运行离心机运行时时不可人不可人为为地打开盖子。地打开盖子。l如果如果转头转头和盖子有可和盖子有可见见的腐的腐蚀蚀或磨或磨损损的痕迹，的痕迹，则则应应立即停止使用。立即停止使用。l使用的玻璃或塑料离心管使用的玻璃或塑料离心管应
7、应能承受相能承受相应应的离心力的离心力并大小合适。非金属并大小合适。非金属转头转头不可用紫外照射。不可用紫外照射。高速（冷高速（冷冻冻）离心机）离心机-使用方法使用方法编辑ppt全自动核酸提取仪编辑ppt全自动核酸提取仪编辑ppt编辑ppt编辑ppt编辑ppt基于核酸的分子诊断技术编辑ppt病毒颗粒DNARNAFQ-PCRRT-FQPCR裂解荧光信号检测核酸提取荧光光PCR检测系系统荧光定量PCR检测加样编辑ppt病毒病毒荧荧光定量光定量PCRPCR反反应应内容1份样品的量DEPCH2O2.875ulMasterMIX6.25ulRT-MIX0.125ul引物0.25ul探针0.25ul程序循
8、环数温度反应时间115030min219515min3459515sec601min反反应体系配置体系配置反反应条件条件设置置对照照设置：置：阴性阴性对照：照：灭菌双蒸水代替菌双蒸水代替标本本阳性阳性对照：提取好的阳性核酸照：提取好的阳性核酸标本本编辑ppt典型典型荧荧光定量光定量PCR结结果果 阳性标本扩增曲线 阴性标本扩增曲线编辑ppt 二、质量控制要点编辑pptPCR实验技术的质量控制要点 分子生物学实验室的质量控制涉及到整个基因检测扩增的所所有有阶阶段段，确保检测结果的准确性和可靠性，严禁各类交叉污染事故的发生。编辑pptPCR实验技术的质量控制要点 PCR实验实验的的过过程主要包括：
9、程主要包括：l标标本本处处理与核酸提取理与核酸提取l扩扩增增试剂试剂的准的准备备l核酸核酸扩扩增与增与产产物分析物分析l测测定后的定后的结结果果报报告告编辑pptPCR实验技术的质量控制要点 l高质量无污染无降解的核酸制备l严格实行分区操作试剂储存和准备区标本处理和核酸制备区核酸扩增区扩增产物分析区l实验人员的操作技能编辑ppt理想的理想的PCRPCR实验室分区室分区设计模式模式产物分析区物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲冲间缓冲冲间缓冲冲间专用走廊用走廊工作流向工作流向扩增区增区标本制本制备区区试剂准准备区区n各区独立各区独立n注意注意风向向n因地制
10、宜因地制宜n方便工作方便工作“十六字口十六字口诀”PCR实验室设计的一般原则编辑ppt标本处理与核酸提取的质量控制l核酸提取试剂的选择l核酸扩增试剂的选择l试剂的分装保存l试剂的配置l对照的设立l核酸扩增仪器l扩增参数的设定编辑ppt扩增产物的检测与分析l荧光定量l普通凝胶电泳l毛细管电泳编辑ppt污染的控制和预防l常见污染的来源l控制污染的措施l消除污染的措施编辑ppt三、实验室生物安全管理编辑ppt为什么关注什么关注实验室生物安全？室生物安全？ 三起SARS疫情后期的实验室感染事件M2003年9月8日：新加坡国立大学实验室，在P3实验室同时开展西尼罗病毒与SARS病毒的研究，一位27岁华人
11、研究员感染；M2003年12月6日：台湾省国防大学预防医学研究所，一名47岁的中校研究员，在P3实验室内清理SARS实验后的废弃物时，未戴手套，因而感染；M2004年4月22日：中国CDC病毒所，跨室开展SARS病毒研究，并引发三代、9例 病例、1例死亡；另有两例 “隐性”感染者。编辑ppt引起实验室生物污染的原因很多很多人员生物安全概念薄弱和技生物安全概念薄弱和技术操作不当；操作不当；生物安全柜和高生物安全柜和高压灭菌容器的不正常菌容器的不正常使用或使用或使用不当；不当；样品品传递、接受和使用、装有、接受和使用、装有冻干感染性物干感染性物质安安瓿的打开；瓿的打开；匀匀浆器、器、组织研磨器、研
12、磨器、摇床、床、搅拌器和超声拌器和超声处理理器的使用；器的使用；离心机内装有潜在感染性物离心机内装有潜在感染性物质的离心管的离心管发生破裂生破裂编辑ppt生物安全的概念生物安全的概念l实验室生物安全室生物安全 避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室外扩散并导致危害的综合措施。l生物安全三个方面：生物安全三个方面： 一指人类的健康安全；二指人类赖以生存的农业生物安全；三指与人类生存有关的环境生物安全。编辑ppt微生物微生物实验室生物安全室生物安全l三三项技技术措施措施l样品隔离技品隔离技术（机械、气幕（机械、气幕) )：防止：防止传染因子染因子进入入环境接触人体境接触人体l定向气流技定向气
13、流技术（负压系系统) )：防止：防止传染因子染因子扩散散l消毒消毒灭菌技菌技术（物理、化学（物理、化学) )：灭活活传染因子染因子编辑ppt实验室可以分室可以分为l基基础实验室室 一一级生物安全水平生物安全水平l基基础实验室室 二二级生物安全水平生物安全水平l防防护实验室室 三三级生物安全水平生物安全水平l最高防最高防护实验室室 四四级生物安全水平生物安全水平l根据操作不同危根据操作不同危险度等度等级微生物所需的微生物所需的实验室室设计特点、建筑构造、防特点、建筑构造、防护设施、施、仪器、操作以及操作器、操作以及操作程序来决定程序来决定实验室的生物安全水平。室的生物安全水平。编辑ppt实验室生
14、物安全防室生物安全防护屏障屏障l一一级防防护屏障屏障l生物安生物安全柜全柜和和个人防个人防护装装备等构成等构成的防的防护屏障。屏障。编辑ppt生物安全柜生物安全柜 高效空气高效空气过滤器器l。编辑ppt编辑ppt编辑ppt编辑ppt实验室生物安全防室生物安全防护屏障屏障l二二级防防护屏障屏障l设施施结构和通构和通风系系统等构成的等构成的防防护屏障。屏障。“盒中盒盒中盒”的的结构构44编辑ppt实验室生物安全防室生物安全防护水平分水平分级l生物安全水平分生物安全水平分级l根据生物因子危害程度和采取的防根据生物因子危害程度和采取的防护措施，将措施，将生物安全防生物安全防护水平（水平（biosafe
15、ty levelbiosafety level，BSLBSL）分分为4 4级（BSL-1BSL-1、BSL-2BSL-2、BSL-3BSL-3、BSL-4BSL-4表示）；表示）；动物物实验室以室以ABSL-1ABSL-1、ABSL-2ABSL-2、ABSL-3ABSL-3、ABSL-ABSL-4 4表示。表示。编辑ppt与一般生物与一般生物洁净室的区室的区别1.1.工作目的工作目的BSLBSL实验室：室： 保保护工作人工作人员和和环境境为主，也保主，也保护产品。安品。安全是首要考全是首要考虑因素。因素。生物生物洁净室：以保室：以保护产品（工作品（工作对象）象）为主。主。洁净是首是首要考要考虑
16、因素因素2.2.污染物的种染物的种类和来源和来源BSL实验室：室：为目目标微生物。内部微生物。内部产生。生。生物生物洁净室：粉室：粉尘（可能的（可能的热源）和微生物。外部源）和微生物。外部进入入以及人的活以及人的活动产生。生。编辑ppt与一般生物与一般生物洁净室的区室的区别3.3.空气空气污染物染物处理方式理方式BSL实验室：平面布局和气流流向的作用室：平面布局和气流流向的作用, 产生生环节在一在一级屏障内屏障内进行个体防行个体防护。生物生物洁净室：主要通室：主要通过进气气净化化 减少活减少活动。4.4.洁、污概念BSL实验室：凡有目室：凡有目标微生物即微生物即视为污； 凡无目凡无目标微生物即
17、微生物即视为洁；对各各环节洁、污应仔仔细分析。分析。生物生物洁净室：粉室：粉尘、微生物（特、微生物（特别是超是超标者）和者）和废弃物均弃物均视为污。编辑ppt与一般生物与一般生物洁净室的区室的区别5.5.排气排气处理方式理方式BSL实验室：不允室：不允许室内室内 室外；室外； 排气排气须净化，不化，不许回回风。生物生物洁净室：一般室内室：一般室内 室外；室外；排气可回排气可回风。6.6.实验室室软、硬件的作用、硬件的作用BSL实验室：室：对工作人工作人员保保护，实验室室软件件应是决定性的；是决定性的； 对环境保境保护，实验室硬件室硬件应是决定性的；是决定性的；生物生物洁净室：均很重要，但硬件室
18、：均很重要，但硬件设施作用比施作用比较大。大。编辑ppt与一般生物与一般生物洁净室的区室的区别7.7.压力力递增方向增方向BSL实验室：室：缓冲室准冲室准备室主室主实验室室生物生物洁净室：室：缓冲室准冲室准备室主室主洁净室室编辑ppt 保保护对象象 操作区操作区 压力力 气体排气体排 放方式放方式 设备 结构构 设备 造价造价 生物安全柜生物安全柜 操作者、操作者、 样品、品、环境境 负压 净化后排放化后排放 复复杂 较贵 洁净工作台工作台 样品品 正正压 直接排放直接排放 简单 便宜便宜 生物安全柜与生物安全柜与洁净工作台的区工作台的区别编辑pptBSL-1BSL-1实验室室1) 1) 实验
19、室的室的门应有可有可视窗并可窗并可锁闭。2) 2) 实验室室门口口设挂衣装置，个人便装与工作服分开。挂衣装置，个人便装与工作服分开。3) 3) 实验室各表面平整、易清室各表面平整、易清洁、不渗水、耐腐、不渗水、耐腐蚀。4) 4) 实验台面防水，耐腐台面防水，耐腐蚀、耐、耐热。5) 5) 橱柜和橱柜和实验台牢固，保持一定距离以便于清台牢固，保持一定距离以便于清洁。6) 6) 实验室可以利用自然通室可以利用自然通风。如果采用机械通。如果采用机械通风，应避免交叉避免交叉污染。染。编辑pptBSL-1BSL-1实验室室7) 7) 如有可开启的窗如有可开启的窗户，应设置置纱窗。窗。8) 8) 保保证工作
20、照明，避免不必要的反光和工作照明，避免不必要的反光和强光。光。9) 9) 有适当的消毒有适当的消毒设备。10) 10) 若操作有毒、刺激性、放射性若操作有毒、刺激性、放射性挥发物物质，应在在风险评估的基估的基础上，配上，配备适当的适当的负压排排风柜。柜。11) 11) 应设应急照明装置；急照明装置；应有足有足够的的电力供力供应。12) 12) 应有防止有防止节肢肢动物和物和啮齿动物物进入的措施。入的措施。编辑ppt编辑ppt典型的一典型的一级生物生物安全水平安全水平实验室室编辑pptBSL-2BSL-2实验室室1) 1) 满足足BSL-1BSL-1的要求。的要求。2) 2) 实验室室门可自可自
21、动关关闭, ,门禁系禁系统。3) 3) 应在在实验室工作区配室工作区配备洗眼装置。洗眼装置。4) 4) 应在在实验室或其所在的建筑内配室或其所在的建筑内配备高高压蒸汽蒸汽灭菌器菌器或其他适当的消毒或其他适当的消毒灭菌菌设备。5) 5) 应在操作病原微生物的在操作病原微生物的实验间内配内配备生物安全柜。生物安全柜。6) 6) 应有可靠的有可靠的电力供力供应。编辑pptBSL-2BSL-2实验室室生物危害警告生物危害警告标志。志。编辑ppt典型的二典型的二级生物生物安全水平安全水平实验室室编辑ppt生物安全柜生物安全柜l生物安全柜的要求生物安全柜的要求: :l颗粒粒经HEPAHEPA过滤去除去除l
22、气流气流为层流流l气流有方向气流有方向编辑ppt生物安全柜的分生物安全柜的分级lI I级生物安全柜：保生物安全柜：保护工作人工作人员和和环境境lIIII级生物安全柜：保生物安全柜：保护工作人工作人员、环境和境和试样（产品）品）lIIIIII级生物安全柜：采生物安全柜：采用手套箱更用手套箱更严格地保格地保护工作人工作人员、环境和境和试样（产品）品）Class II Class II 生物安全柜生物安全柜编辑ppt 与其它操作区域相分离；与其它操作区域相分离； 远离主要通道；离主要通道； 与气道有与气道有 一定距离；一定距离； 与与实验室入口保持一定距离。室入口保持一定距离。生物安全柜生物安全柜摆放位置放位置编辑ppt61编辑ppt生物安全柜的使用生物安全柜的使用干干净净的物品的物品理想的工作台理想的工作台摆放放被被污污染的区域染的区域废废弃物托弃物托盘盘垃圾袋垃圾袋编辑ppt编辑ppt个人防个人防护装装备l实验室防室防护服服l面部及身体保面部及身体保护l手套手套l鞋（套）鞋（套）l呼吸防呼吸防护编辑ppt【 尾 声 】谢 谢！编辑ppt
