第三章第三章谷氨酸生产菌的特征、育种谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养及扩大培养. 目录contents 1234谷氨酸生产菌的主要特征谷氨酸生产菌的主要特征●国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较●谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化●谷氨酸发酵的代谢控制育种策略谷氨酸发酵的代谢控制育种策略●5利用生物工程技术选育谷氨酸生产菌利用生物工程技术选育谷氨酸生产菌●6菌种的扩大培养及种子的质量要求菌种的扩大培养及种子的质量要求 ●. 第一节第一节. . 谷氨酸生产菌的主要特征谷氨酸生产菌的主要特征一、现有谷氨酸生产菌的分类一、现有谷氨酸生产菌的分类 现有谷氨酸生产菌主要是棒现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌小杆菌属及节杆菌属中的细菌属中的细菌 1. 1. 棒状杆菌属棒状杆菌属( (CorynebacteriumCorynebacterium) )直直到到微微弯弯的的杆杆菌菌，，一一端端膨膨大大呈呈棒棒状状，，折折断断分分裂裂形形成成“八八”字字形形或或栅栅状状排排列列葡葡萄萄糖糖发酵产酸，发酵产酸，G G+ +. 2 2 短杆菌属短杆菌属( (BrevibacteriumBrevibacterium) ) 短的不分枝直杆菌。
短的不分枝直杆菌多数从葡萄糖发酵产酸，多数从葡萄糖发酵产酸，不发酵乳糖不发酵乳糖 G G+ +3 3 小杆菌属小杆菌属( (MicrobacteriumMicrobacterium) ) 形态与棒状杆菌相似形态与棒状杆菌相似发酵葡萄糖产酸弱，主发酵葡萄糖产酸弱，主要产乳酸要产乳酸 G G+ +. 4 4 节杆菌属节杆菌属( (ArthrobacteriumArthrobacterium) ) 培养过程中，细胞形态变化较大培养过程中，细胞形态变化较大球菌球菌 杆菌，杆菌杆菌，杆菌 球菌 G G+ + G G- - , , G G- - G G+ + 能液化明胶，能液化明胶，从碳水化合物从碳水化合物产酸极少或不产酸极少或不产酸 二、谷氨酸棒状杆菌基因组研究进展二、谷氨酸棒状杆菌基因组研究进展谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032ATCC 13032GenBank NC-GenBank NC-004369004369. . 目前应用发酵法生产目前应用发酵法生产L-L-乳酸乳酸常用的微生物仅有两大类常用的微生物仅有两大类: :一一类为细菌类为细菌, ,多采用乳酸菌多采用乳酸菌, ,另另一类为根霉。
根霉可以直接一类为根霉根霉可以直接利用淀粉质原料生产利用淀粉质原料生产L-L-乳酸乳酸, ,但是产酸量低但是产酸量低, ,副产物多副产物多, ,转转化率低SauerSauer等构建了包含等构建了包含乳杆菌乳杆菌L-L-乳酸脱氢酶基因的乳酸脱氢酶基因的毕氏酵母毕氏酵母, ,它利用木糖发酵它利用木糖发酵, ,初始浓度为初始浓度为100g/L100g/L，生产，生产L-L-乳酸达到乳酸达到58g/L58g/L，比利用葡萄，比利用葡萄糖产生乳酸的水平高糖产生乳酸的水平高基因工程育种（重组基因工程育种（重组DNADNA技术）技术）. 三、现有谷氨酸生成菌的主要特征三、现有谷氨酸生成菌的主要特征（（1 1）细胞形态球形、棒状以及短杆状细胞形态球形、棒状以及短杆状2 2））G G+ +，无芽孢、无鞭毛，不能运动无芽孢、无鞭毛，不能运动3 3））需氧型、生物素缺陷型微生物需氧型、生物素缺陷型微生物4 4））脲酶强阳性脲酶强阳性（（5 5）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶以及明胶6 6）发酵中菌体发生明显的形态变化，同）发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化。
时发生细胞膜渗透性的变化7 7））COCO2 2固定反应酶系活力强固定反应酶系活力强 （（8 8）异）异柠檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循环柠檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循环弱9 9））αα- -酮戊二酸氧化能力微弱酮戊二酸氧化能力微弱1010））NADPH2NADPH2进入呼吸链能力弱进入呼吸链能力弱1111）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强1212）能利用醋酸，不能利用石蜡能利用醋酸，不能利用石蜡1313）具有向环境中泄露谷氨酸的能力具有向环境中泄露谷氨酸的能力1414）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸的谷氨酸，产谷氨酸5%5%以上 第二节第二节 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 1 1、形态特征、形态特征 短短杆杆至至小小棒棒状状，，有有时时微微弯弯曲曲，，两两端端钝钝圆圆，，不不分分枝，呈多种形态枝，呈多种形态 单个、成对及单个、成对及“V V”字形排列字形排列 G+G+胞内有横隔胞内有横隔。
不运动一、一、 北京棒杆菌北京棒杆菌(AS1299)(AS1299)的形态和生理特征的形态和生理特征. 2 2、培养特征、培养特征普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，普通肉汁琼脂平板：菌落圆形， 24h24h白白色，色，48h48h淡黄色，中央隆起，表面湿润、淡黄色，中央隆起，表面湿润、光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，无黏性，不产生水溶性色素无黏性，不产生水溶性色素 3 3、生理特征、生理特征★ 对氧的要求：好氧及兼性厌氧★ 与温度的关系：菌株26~37 ℃ 培养生长良好，不耐高温，41 ℃ 生长较弱★ pH的影响： Ph5~10均能生长，最适 pH6~7.5★ 还原硝酸盐：反映强烈★ 石蕊牛奶培养：7d后微产碱★ 不水解淀粉，不分解纤维素★ 对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制★ 脲酶试验：强阳性反应★ 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖迅速产酸★ 生长因素试验：生物素是必需生长因素硫胺素明显促生长 二、钝齿棒杆菌二、钝齿棒杆菌(AS1542)(AS1542)的形态和生理特征的形态和生理特征1 1、、 形态特征形态特征 短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。
单个、成对及圆，不分枝单个、成对及“V V”字形排字形排列 折断分裂折断分裂 G G+ +胞内有横隔胞内有横隔 2 2、、 培养特征培养特征普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色，普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色， 表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较薄，表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素半透明，无黏性，不产生水溶性色素 ★ 对氧的要求：兼性厌氧★ 与温度的关系：菌株20~37 ℃ 培养生长良好，不耐高温，42 ℃ 不生长★ pH的影响： pH6~9生长良好， pH10生长微弱， pH4~5已不能生长★ 还原硝酸盐：反映强烈★ 石蕊牛奶培养：7d后微产碱★ 水解淀粉，不分解纤维素★ 对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制★ 脲酶试验：强阳性反应★ 产酸物质的测定： G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵等迅速产酸★ 生长因素试验：生物素是必需生长因子3 3、生理特征、生理特征. 三、天津短杆菌三、天津短杆菌(T613)(T613)的形态和生理特征的形态和生理特征典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆，不分枝。
单个、成对及钝圆，不分枝单个、成对及“V V”字形排列折断分裂字形排列折断分裂 G G+ +1 1、形态特征、形态特征. 2 2、培养特征、培养特征★ ★ 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅黄色，黄色， 表面湿润、光滑，隆起，边缘整表面湿润、光滑，隆起，边缘整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素溶性色素 3 3、生理特征、生理特征 ★ 对氧的要求：好氧及兼性厌氧★ 与温度的关系：菌株26~37 ℃ 培养生长良好，75 ℃ 处理10min不再生长★ pH的影响： pH6~10生长良好， pH5生长微弱， pH4和pH11已不能生长★ 还原硝酸盐：反映强烈★ 不水解淀粉，不分解纤维素★ 对尿素的耐力，5%以上生长受抑制★ 脲酶试验：强阳性反应★ 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵★ 生长因素试验：生物素是必需生长因子硫胺素是促生长作用 四、北京棒杆菌四、北京棒杆菌(7338)(7338)与钝齿棒杆与钝齿棒杆菌菌(B9)(B9)的比较的比较后提取容后提取容易，收率易，收率较高，质较高，质量较好量较好分泌色分泌色素较多素较多. 2.5 2.5 天津短杆菌天津短杆菌(T613)(T613)与钝齿杆与钝齿杆菌菌(B9)(B9)的比较的比较 T613T613感染感染噬菌体时，噬菌体时，不能换用不能换用B9B9，调换，调换7338.7338.. 第三节第三节 谷氨酸生产菌在发酵谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化过程中的形态变化 斜斜面面和和一一、、二二级级种种子子在在不不同同培培养养条条件件下下，，细细胞胞形形态态基基本本相相似似。
斜斜面面培培养养的的菌菌体体较较细细小小, ,一一、、二二级级种种子子比比斜斜面面菌菌体体大大而而粗粗壮壮, ,革革兰兰氏氏染染色色深深多多为为短短杆杆至至棒棒杆杆状状, ,有有的的微微呈呈弯弯曲曲状状, ,两两端端钝钝圆圆, ,无无分分枝枝; ;细细胞胞排排列列呈呈单单个个、、成成对对及及“V V”字字形形, ,有有栅栅状状或或不不规规则则聚聚块块; ;分分裂裂的的细细胞胞大大小小为为0.70.7～～0.9*1.00.9*1.0～～3.4um3.4um由由于于生生物物素素充充足足, ,繁繁殖殖的的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞 一、一、 种子的菌体形态种子的菌体形态. 二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态 长菌型细胞：长菌型细胞：发酵发酵0-8h0-8h或或0-10h0-10h短杆至棒状，短杆至棒状，有的微弯曲状，细胞单个、成对及有的微弯曲状，细胞单个、成对及 V V字形排列字形排列转移期细胞：转移期细胞：发酵发酵8-18h8-18h或或10-20h10-20h细胞开始伸长、膨细胞开始伸长、膨大在生物素贫乏大在生物素贫乏的条件下，的条件下，从谷氨从谷氨酸非积累型转变成酸非积累型转变成谷氨酸积累型。
谷氨酸积累型转转移期有长菌型细胞，移期有长菌型细胞，也有产酸型细胞也有产酸型细胞 产酸型细胞：产酸型细胞：发酵发酵16-20h16-20h后细胞为含磷脂不足的异后细胞为含磷脂不足的异常状态，呈伸长、膨大、不规则状，缺乏常状态，呈伸长、膨大、不规则状，缺乏V V字形排列字形排列发酵后期，细胞较长，呈有明显的横隔的多节细胞，发酵后期，细胞较长，呈有明显的横隔的多节细胞，产酸高过量生物素，过量生物素，不同阶段的细胞形态则基本上没有明不同阶段的细胞形态则基本上没有明显的变化菌体较粗壮，类似于长菌型细胞典型显的变化菌体较粗壮，类似于长菌型细胞典型的异常发酵，长菌体、耗糖快、耗尿素快、发酵周的异常发酵，长菌体、耗糖快、耗尿素快、发酵周期短、低酸或不产酸期短、低酸或不产酸 三、谷氨酸发酵感染噬菌体后三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态的菌体形态 发酵前期感染噬菌体后发酵前期感染噬菌体后, ,菌体细胞明显减少菌体细胞明显减少, ,细胞细胞不规则不规则, ,发圆、发胖发圆、发胖, ,缺乏缺乏" "ＶＶ" "字形排列字形排列, ,有明显的有明显的细胞碎片细胞碎片, ,严重时出现拉严重时出现拉丝、拉网丝、拉网, ,互相堆在一起互相堆在一起, ,几乎找不到完整的菌体细几乎找不到完整的菌体细胞胞, ,类似蛛网或鱼翅状。
类似蛛网或鱼翅状 . 在发酵中、后期感染噬菌体后在发酵中、后期感染噬菌体后, ,菌体细胞形菌体细胞形态不规则态不规则, ,边缘不整齐边缘不整齐, ,有的边缘似乎有许多有的边缘似乎有许多毛刺状的东西毛刺状的东西, ,有细胞碎片有细胞碎片 第四节、谷氨酸发酵的代谢控制育种第四节、谷氨酸发酵的代谢控制育种 一、日常菌种工作一、日常菌种工作 1 1、定期分纯、定期分纯1-21-2个月分离纯化一次个月分离纯化一次. 2 2、小剂量诱变刺激、小剂量诱变刺激用紫外线（用紫外线（10-20s10-20s）处理，）处理，可以淘汰生长微弱的菌可以淘汰生长微弱的菌株，并能株，并能激发溶原性噬激发溶原性噬菌体菌体，使挑出来的菌产，使挑出来的菌产酸高、生长旺盛、无噬酸高、生长旺盛、无噬菌体感染菌体感染 3 3、高产菌制作安瓿管、高产菌制作安瓿管育种后分纯的育种后分纯的高产菌种需保高产菌种需保存到安瓿管中，存到安瓿管中，防止菌种变异防止菌种变异 二、选育耐高渗透压菌种二、选育耐高渗透压菌种耐高糖突变株耐高糖突变株选育在含20-30%葡萄糖的平板上生长好的突变株耐高谷氨酸突变株耐高谷氨酸突变株选育在含15-20%味精的平板上生长好的突变株。
耐高糖、高谷氨酸突变株耐高糖、高谷氨酸突变株选育在含20%葡萄糖、15%味精的平板上生长好的突变株 三、三、 选育不分解利用谷氨酸的突变株选育不分解利用谷氨酸的突变株 选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株长微弱的突变株四、选育细胞膜渗透性好的突变株四、选育细胞膜渗透性好的突变株 生物素生物素亚适量亚适量吐温吐温-60-60青霉素青霉素温度敏感株温度敏感株. 五、五、 选育强化选育强化COCO2 2固定反应的突变株固定反应的突变株六、选育减弱乙醛酸循环的突变株六、选育减弱乙醛酸循环的突变株 七、选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到七、选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到 α-α-酮戊二酸代谢的突变株酮戊二酸代谢的突变株 八、选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反八、选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反 馈调节的突变株馈调节的突变株 九、选育强化能量代谢的突变株九、选育强化能量代谢的突变株耐谷氨酸、谷氨酸结构类似物、谷氨酰胺抗性突变株耐谷氨酸、谷氨酸结构类似物、谷氨酰胺抗性突变株. 第五节第五节 利用生物工程新技术选育利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌谷氨酸生产菌 一、应用原生质体融合技术一、应用原生质体融合技术. 钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌B9B9( (细胞个体大、易于提取；细胞个体大、易于提取；产酸率低产酸率低) )天津短杆菌天津短杆菌TG-866TG-866( (产酸率高产酸率高) )融合子融合子F263F263( (细胞个体大、产酸率高细胞个体大、产酸率高) ). 二、二、应应用用转转化化法法. 三、应用转导法三、应用转导法. 四、应用重组四、应用重组DNADNA技术技术. 第六节第六节 菌种的扩大培养和种子菌种的扩大培养和种子的质量要求的质量要求 一、菌种扩大培养的目的一、菌种扩大培养的目的q 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平. 二、菌种扩大培养的过程二、菌种扩大培养的过程. 1 1、斜面菌种的培养、斜面菌种的培养培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖0.1%0.1%，蛋白胨，蛋白胨 1%1%，牛肉膏，牛肉膏1%1%，，氯化钠氯化钠 0.25% 0.25% ，酵母膏，酵母膏0.5%0.5%，琼脂，琼脂 2%2%，， pH pH 7.0-7.27.0-7.2培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细。
有利于菌体的生长，原料比较精细生长斜面要求：生长斜面要求： 32℃32℃，生长，生长18-2418-24小时，小时，生长良好，生长良好， 所使用斜面连续传代所使用斜面连续传代不超过不超过3 3次次. 2. 2. 一级种子培养（摇瓶）一级种子培养（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-200-250ml,32℃250ml,32℃ 培养培养1212小时培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%2%，尿素，尿素0.5%0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%2.5%，， K K2 2HPOHPO4 4 0.1% 0.1%，，FeSOFeSO4 4 2mg/k , 2mg/k , MnSOMnSO4 42mg/kg PH7.02mg/kg PH7.0培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料有利于菌体的生长，所使用的原料 已经基本接近于发酵培养已经基本接近于发酵培养基基. .. 一级种子培养的质量要求：一级种子培养的质量要求： 种龄：种龄：12h12h PH PH：：6.46.4光密度：光密度：ODOD值净增值净增0.50.5以上以上残糖：残糖：0.5%0.5%以下以下噬菌体检查：无噬菌体检查：无镜检：菌体生长均匀、镜检：菌体生长均匀、 粗壮，排列整齐粗壮，排列整齐革兰氏染色革兰氏染色：：阳性反应。
阳性反应 3. 3. 二级种子培养二级种子培养( (种子罐种子罐) )培养基：水解糖液培养基：水解糖液3%3%，尿素，尿素0.4%0.4%，， NaNa2 2HPOHPO4 4 0.3% 0.3%，玉，玉米浆米浆 2.5%2.5%，，KCl 0.14%KCl 0.14%，消泡剂，消泡剂0.5-1kg0.5-1kg，，PH7.0PH7.0培养条件：在种子罐中培养培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的（容积为发酵罐的1%1%），），32℃32℃培养培养7-107-10个小时个小时. 二二级级种种子子培培养养操操作作流流程程种子罐配料种子罐配料培养基加至罐体积培养基加至罐体积60-75%60-75%空消空消0.2MPa0.2MPa，，130℃,50min130℃,50min打料打料实消实消接种接种0.1 MPa0.1 MPa，，118℃,5min118℃,5min. 二级种子培养的质量要求：二级种子培养的质量要求：种龄：种龄：7-8h7-8hPHPH：：7.27.2光密度：光密度：ODOD值净增值净增0.50.5以上以上残糖：消耗残糖：消耗1%1%左右左右噬菌体检查：无噬菌体检查：无镜检：菌体生长旺盛，镜检：菌体生长旺盛， 排列整齐排列整齐革兰氏染色：革兰氏染色：阳性反应。
阳性反应 三、影响种子质量的主要因素三、影响种子质量的主要因素培养基培养基温度温度pHpH值值溶解氧溶解氧接种量接种量种龄种龄. 本章作业：本章作业：一、简述现有谷氨酸生成菌的主要特征一、简述现有谷氨酸生成菌的主要特征二、简述谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态二、简述谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态三、谷氨酸发酵日常菌种工作有哪些？三、谷氨酸发酵日常菌种工作有哪些？四、简述菌种扩大培养的一般过程四、简述菌种扩大培养的一般过程五、简述二级种子培养操作流程五、简述二级种子培养操作流程。