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1、质粒质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳n n主讲人：文琪n n同组人员：黄梦秋 张如骐 肖重科1实验目的实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳检测掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原的原理和方法。理和方法。实验原理实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应分子筛效应。在在 pH 值为值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带离，核酸分子带负电负电，在电泳时，在电泳时向正极移动向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在采用适当浓度的凝胶介质作
2、为电泳支持物，在分子筛分子筛的作用下，的作用下，使使分子大小和构象不同的核酸分子分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入核酸分子中嵌入荧光染料（如荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。酸片段所在的位置。实验器材和试剂实验器材和试剂实验器材实验器材：桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪射仪样品样品： DNA分子量标准品，质粒分子量标准品，质粒试剂试剂 琼脂糖琼脂糖1电泳缓冲液（电泳缓
3、冲液（TBE）6上样缓冲液上样缓冲液溴化乙锭溴化乙锭(EB) ：10mg/ml上样缓冲液0.25溴酚兰；溴酚兰；0.25二甲苯青；二甲苯青；30甘甘油水溶液油水溶液作用：作用：增加样品密度增加样品密度，使其比重增加，以，使其比重增加，以确保确保DNA均匀沉入加样孔内均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指在电泳中形成肉眼可见的指示带，可示带，可预测核酸电泳的速度和位置预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色使样品呈色，使加样操作更方便，使加样操作更方便琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻又名琼胶、菜燕、冻粉粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来从石花菜及其它红藻类植物
4、提取出来的一种线状高聚物。的一种线状高聚物。琼脂糖（琼脂糖（agaroseagarose）琼脂胶（琼脂胶（agaropectinagaropectin）: :含硫酸根和羧基的强酸含硫酸根和羧基的强酸性多糖，性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。在电场作用下能产生较强的电渗现象。琼琼脂脂琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定分离鉴定和和纯化纯化DNA片段片段的的标准方法。标准方法。该技术操作该技术操作简便快速简便快速，可以分辨用其它方法，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。片段。当用低浓度的荧光嵌入染料当
5、用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色染色,在紫外光下至少在紫外光下至少可以检出可以检出1-10ng的的DNA条带条带,从而可以确定从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。片段在凝胶中的位置。此外此外,还可以从电泳后的凝胶中还可以从电泳后的凝胶中回收特定的回收特定的DNA条带条带,用于以后的克隆操作。用于以后的克隆操作。电泳指示剂：电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种核酸电泳常用的指示剂有两种 溴酚蓝溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）；）； 二甲苯青二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它携），它携带的电荷量比溴
6、酚蓝少，在凝胶中的迁带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢移率比溴酚蓝慢核酸电泳的染色剂最常用的染色剂最常用的染色剂溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外紫外线线激发下，发出激发下，发出桔红色荧光桔红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的的EB，有时亦可在电泳，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015minEB染料有许多优点，如染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏
7、度高，染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或或更少的更少的DNA即可检出即可检出。（注意：注意：EB被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置和，操作时应尽量小心，配置和使用使用EB时都应带上手套，且注意不要把时都应带上手套，且注意不要把EB洒到桌面或地板上。洒到桌面或地板上。 ）银染色银染色影响琼脂糖凝胶电泳的因素影响琼脂糖凝胶电泳的因素DNA分子的大小分子的大小：实验证明，：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量片段迁移距离与其分子量的对数成反比；的对数成反比；琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度：一定大小的：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝片段在不同浓度的琼脂凝胶中
8、，电泳迁移率不相同；胶中，电泳迁移率不相同；DNA分子的构型分子的构型：不同构型的：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大度差别较大琼脂糖凝胶的优点琼脂糖凝胶的优点(1) 操作简单操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶结构均匀结构均匀，对样品吸附极微，因此，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖琼脂糖透明无紫外吸收透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。接用紫外监测及定量分析。(4
9、)电泳后区带电泳后区带易染色易染色，样品易洗脱，便于定量测，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。定。制成干膜可长期保存。缺点：缺点：1.1.机械强度差机械强度差，易破碎，浓度不能太低。，易破碎，浓度不能太低。2.2.易被细菌污染易被细菌污染，不易保存，临用前配制。，不易保存，临用前配制。3.3.琼琼脂脂糖糖支支持持层层上上的的区区带带易易于于扩扩散散，电电泳泳后必须立即固定染色。后必须立即固定染色。4.4.与与PAGEPAGE相比，相比，分子筛作用小分子筛作用小，区带少。，区带少。银染色银染色银染色液中的银染色液中的银离子银离子(Ag+)可与核酸形可与核酸形成稳定的复合物成稳定的复合
10、物，然后用还原剂如甲，然后用还原剂如甲醛使醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。也用于琼脂糖凝胶染色。灵敏度比灵敏度比EB高高200倍倍，但银染色后，但银染色后，DNA不宜回收不宜回收实验操作实验操作制备琼脂凝胶 胶板的制备 加样 电泳 紫外透射仪检测操作步骤1. 准备准备用蒸馏水将电用蒸馏水将电泳槽和梳子泳槽和梳子冲洗干净，冲洗干净，放在水平桌放在水平桌面上，并架面上，并架好梳子好梳子2. 配制配制1%琼脂糖凝胶及倒胶琼脂糖凝胶及倒胶具体步骤：具体步骤：三
11、角瓶内：三角瓶内：0.6g琼脂糖琼脂糖 +60ml(0.5TBE) 煮胶溶解煮胶溶解 冷却至冷却至60(不烫手不烫手) 加加EB 倒板倒板 室温下充分凝固室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面缓冲液至刚没过凝胶表面12nm。3. 加样加样将将DNA样品（样品（5ul）与）与6 上上样缓冲液（样缓冲液（1ul） 混匀后，混匀后，用微量加样枪小心加入样用微量加样枪小心加入样品孔内。品孔内。注意加样枪的枪头注意加样枪的枪头不可插入不可插入过深过深，以免刺穿凝胶，导致，以免刺穿凝胶，导致样品外
12、溢。样品外溢。每加完一个样品要每加完一个样品要更换枪更换枪头头，以，以防止防止EB污染污染。 4. 电泳电泳接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极（长度以两个电极之间的距离计算）之间的距离计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，处，停止电泳停止电泳5. 结果观察结果观察电泳结束后，将凝胶板取出。电泳结束
13、后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。置，记录实验结果。注意事项注意事项1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，否，否则温度太高会使制板变形；则温度太高会使制板变形；2、 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔；直向上，不要弄坏点样孔；3 、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶；要刺穿凝胶；4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔；胶勿乱扔；5 、紫外线照射不要太久。、紫外线照射不要太久。
